蔣鴻濤 李濤 何松哲 余一凡 白云昊 馬曉杰 王毅

為了解決供者短缺的問題，人們采取了很多措施，例如親屬活體移植，ABO血型不相容移植等，我國也在2006年開展了第1例ABO血型不相容腎移植。即便這樣，仍不能有效地解決器官短缺問題。正是在這種背景下，人們開始研究將轉(zhuǎn)基因豬作為供體來源之一[1-2]。在基因修飾豬-非人靈長類動物（non-human primate，NHP）的異種器官移植模型中，腎和心臟異種移植取得了令人興奮的進展。其中移植腎存活時間＞1年[3-4]，移植心臟（原位移植）存活時間＞6個月[5-6]，而異種肝移植和肺移植的進展比較緩慢。雖然目前異種移植研究有所突破，但長期存活的例數(shù)仍較少。接受α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因敲除（α-1,3-galactosyltransferase gene-knockout，GTKO）供體供腎的受體1、3和12個月的存活率分別為47.1%、24.2%和7.6%[7]?？梢姶蟛糠质荏w短期內(nèi)就發(fā)生移植腎失功。因此，仍有一些問題需要明確并解決。本文就目前異種腎移植所存在的問題和面臨的挑戰(zhàn)進行歸納。

1 排斥反應(yīng)

1.1 固有免疫

由于供體豬和NHP受體之間的分子差異，固有免疫在異種移植排斥反應(yīng)中的影響明顯強于同種移植。巨噬細胞通過識別異種移植物的激活信號和干預抑制信號來介導強烈的排斥反應(yīng)，筆者所在團隊前期研究中也發(fā)現(xiàn)豬腎有大量的巨噬細胞浸潤。CD47是一種膜糖蛋白，在所有組織中都有表達，并作為“自我標記物”與巨噬細胞中的抑制劑受體信號調(diào)節(jié)蛋白α（signal regulatory protein α，SIRPα）相互作用。SIRPα與CD47之間相互作用的缺失可導致異種移植的排斥反應(yīng)。此外，被激活的巨噬細胞還可以進一步調(diào)節(jié)T細胞反應(yīng)，誘導適應(yīng)性反應(yīng)損傷異種移植物。

與巨噬細胞相似，自然殺傷（natural killer，NK）細胞在異種移植中起著關(guān)鍵作用，其作用機制依賴于激活和抑制信號之間的平衡。NK細胞無法有效識別異種組織上的抑制信號，從而損傷異種移植物。然而，一些研究表明NK細胞在異種移植排斥反應(yīng)中可能未起到關(guān)鍵作用[8]。另外，NK細胞可能被異種細胞的激活配體（比如NKG2D或NKp44及其各自的配體）所激活，加重對移植物的損傷[9]。為了減少NK細胞的活化，研究者們嘗試了不同基因修飾方案，如轉(zhuǎn)入人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-E，HLA-Cw3或HLA-Cw4。然而相比于野生型豬，人NK細胞介導的毒性對導入NK細胞抑制分子的豬更高。NK細胞對異種器官損傷的其他機制是抗體依賴細胞介導的細胞毒性作用（antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）。因此，這種先天免疫反應(yīng)在異種器官移植中似乎難以被抑制。有體內(nèi)實驗證實導入CD47能有效延長異種移植腎存活時間[10]，這可能是抑制巨噬細胞吞噬異種組織的重要手段之一，但對于如何有效抑制NK細胞的殺傷作用仍需進一步研究。

1.2 適應(yīng)性免疫反應(yīng)

異種移植的適應(yīng)性排斥反應(yīng)呈多樣性，包括超急性排斥反應(yīng)（hyperacute rejection，HAR）、抗體介導的排斥反應(yīng)（antibody-mediated rejection，AMR）、T細胞介導的排斥反應(yīng)（T cell-mediated rejection，TCMR）、亞急性或慢性體液或細胞排斥反應(yīng)[11]。使用hCD55或GTKO豬作為供腎來源，基本不會發(fā)生HAR；以共刺激阻滯劑為基礎(chǔ)的維持免疫方案對抑制或逆轉(zhuǎn)TCMR有一定的作用；AMR仍是阻礙臨床異種腎移植長期存活的主要障礙，同時伴有或不伴有移植腎微循環(huán)血栓形成。為了抑制AMR，人們加大了對豬的基因改造，目前最新的轉(zhuǎn)基因豬是“12基因”豬[12]。然而并非對豬的基因改造越多就越有易于異種腎移植，且過多的基因改造容易造成豬畸形，難以存活。目前存活時間最長的異種腎移植受體，其供豬基因型為GTKO/4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶2敲除（β-1，4-N-acetylg alactosaminyltransferase 2 knockout，β4GalNT2KO）。筆者所在團隊前期研究中即使使用了GTKO/β4GalNT2KO/hCD55/h血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM）供豬，受體獼猴存活時間＜30 d，且大部分發(fā)生了AMR，表明確實存在其它的未知異種抗原。從2003年以來的基因修飾豬-NHP異種腎移植中，大部分受體都發(fā)生了AMR，其中有小部分發(fā)生了TCMR。因此，克服AMR才能快速地推動異種腎移植的臨床應(yīng)用。

目前正在進行異種移植研究的藥物包括達雷木 單 抗（daratumumab，anti-CD38） 和 貝 利 木 單抗[belimumab，B細胞活化因子（B cell activating factor，BAFF）阻滯劑][13]。另一種新藥imlifidase可能有一定的作用，它能在4 h內(nèi)清除循環(huán)中的IgG[14]。然而，主要問題是所有抗體水平會在移植后的第1周反彈，如何抑制抗體的反彈尤為重要?？赡苄枰M一步發(fā)現(xiàn)其它免疫原性較強的異種抗原并敲除。

2 難治性凝血功能紊亂

當異種腎移植受體移植腎功能出現(xiàn)惡化時，往往伴有血小板的迅速下降，發(fā)生嚴重的凝血功能紊亂，移植腎表現(xiàn)出廣泛的微循環(huán)血栓形成和間質(zhì)出血。即使移植后馬上應(yīng)用抗凝藥物也無法抑制凝血功能紊亂，主要原因有：（1）低水平的抗豬抗體、補體和先天免疫細胞損傷或激活移植腎血管內(nèi)皮細胞；（2）NHP和豬凝血-抗凝血系統(tǒng)之間的分子不相容性?；罨呢i血管內(nèi)皮細胞成為促凝劑，NHP體內(nèi)發(fā)生的凝血過程不能被豬的抗凝血因子有效抑制，因此將人凝血調(diào)節(jié)基因如TM、內(nèi)皮蛋白C受體（endothelial protein C receptor，EPCR）、組織因子途徑抑制劑（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）等轉(zhuǎn)入豬的血管內(nèi)皮細胞中，可以在一定程度上抑制移植物微循環(huán)血栓的形成，其中導入人TM是克服異種移植凝血功能障礙的最重要手段之一。在體外實驗中，豬血管內(nèi)皮細胞表達人TM可顯著抑制凝血酶原活性，延遲人血漿凝血時間，誘導人血小板聚集的活性降低[15]。另外在抗凝系統(tǒng)起到關(guān)鍵作用的是EPCR，它同時也具有抗炎和保護細胞信號的作用。因此，在供體豬中過表達人EPCR可能是一種克服相關(guān)障礙的潛在解決方案，提供有效的抗炎、抗凝和細胞保護信號傳導。在體外實驗中，GTKO細胞表達人EPCR能減少血小板的聚集。人TFPI的表達是解決人組織因子（tissue factor，TF）與豬TFPI不結(jié)合的一個潛在途徑。體外研究表明，人TFPI的表達可抑制TF活性[16]。在體外實驗中，大部分研究都證實了豬細胞導入人凝血調(diào)控基因可以達到有效抗凝的效果。

體內(nèi)實驗表明，僅用GTKO/hCD55或者GTKO/β4GalNT2KO/hCD55的豬供腎，受體存活時間＞1年，未發(fā)生嚴重的微循環(huán)血栓[17]。而有些接受導入了人凝血調(diào)控基因的豬腎發(fā)生了嚴重的微循環(huán)血栓[18]，而且大部分跟急性排斥反應(yīng)有關(guān)，特別是急性AMR。當抗原抗體結(jié)合后，激活補體的經(jīng)典途徑，生成攻膜復合物，破壞豬腎血管內(nèi)皮細胞。當然，細胞性排斥反應(yīng)也能激活CD8+T細胞進而損傷血管內(nèi)皮細胞。因此筆者認為，如果能解決排斥反應(yīng)對細胞的損傷，就能大大降低移植腎微循環(huán)血栓形成，如果排斥反應(yīng)仍解決不了，導入2～3個人凝血調(diào)控基因仍可能無法有效抑制微循環(huán)血栓形成。然而對于慢性排斥反應(yīng)，導入更多人凝血調(diào)控基因是否能在一定程度上起到抑制豬腎微循環(huán)血栓形成值得進一步研究。

3 持續(xù)存在的炎癥反應(yīng)

異種移植受體發(fā)生持續(xù)的炎癥反應(yīng)，在異種移植失敗中起著重要作用[19-20]。當異種移植受體發(fā)生凝血功能紊亂時，促炎因子和趨化因子能推動異種排斥反應(yīng)的發(fā)生，但能否導致炎癥反應(yīng)仍不清楚。在異種移植受體中可以檢測到干擾素（interferon，IFN）-γ、白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-12、IL-8、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 和單核細胞趨化蛋白（monocyte chemoattractant protein，MCP）-1水平明顯升高。在接受豬動脈片移植的受體狒狒中，以共刺激通路阻滯劑為基礎(chǔ)的免疫抑制方案能有效減少IL-6的釋放。IL-6與炎癥和血栓并發(fā)癥都有關(guān)，其還能促進組織因子的表達[21]，因此，抑制IL-6的釋放可能對異種移植受體有益。

在異種移植術(shù)后數(shù)日內(nèi)，受體C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）水平開始升高，且CRP水平升高發(fā)生在受體凝血激活和消耗性凝血功能障礙發(fā)展之前[22]。值得注意的是，CRP水平較高與凝血功能紊亂快速發(fā)展和異種移植腎早期衰竭均有關(guān)。異種器官移植受體全身并發(fā)癥發(fā)生率的不同可能與異種器官的異質(zhì)性和器官特異性血管基因表達有關(guān)。在異種移植受體猴安樂死后，移植心臟和腎臟中檢測到CRP沉積。此外，在異種移植受體的肺中觀察到CRP陽性的免疫細胞，表明發(fā)生了全身炎癥反應(yīng)。IL-6除了促進炎癥反應(yīng)，還可以誘導肝細胞和平滑肌細胞產(chǎn)生CRP[23]。在接受豬動脈片的狒狒中，IL-6和CRP水平之間存在顯著的正相關(guān)，血液中CRP和纖維蛋白原水平之間也存在顯著的正相關(guān)[18]。CRP和纖維蛋白原都是急性期的反應(yīng)蛋白，在急性炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生。

因此，抑制或者減弱炎癥反應(yīng)的發(fā)生，特別是抑制CRP和IL-6的釋放可能對延長異種移植腎的存活有一定的作用。IL-6阻滯劑是目前用于異種移植中的一種抗炎藥物，它能有效抑制異種器官移植受體血清CRP升高[24-25]。在同時接受IL-6阻滯劑和共刺激阻滯劑治療的10例異種腎移植受體中，大部分長期存活，也有幾例受體存活時間短，發(fā)生了AMR。在單獨使用IL-6阻滯劑，而未加用共刺激阻滯劑的異種腎移植受體存活時間短。由此說明抗炎治療對異種移植可能有一定的積極作用，但單獨的抗炎治療并不能有效延長異種移植腎的存活時間。

4 免疫抑制藥的選擇

免疫抑制藥的使用對異種腎移植受體存活有很大影響。特別是CD154-CD40共刺激阻滯劑的使用。CD154也稱為CD40配體或CD40L，主要表達于活化的T細胞，是TNF超家族分子的成員。它與抗原提呈細胞上的CD40蛋白結(jié)合，根據(jù)靶細胞類型產(chǎn)生多種效應(yīng)?？偟膩碚f，CD40L有三個結(jié)合靶點：CD40、α5β1整合素和αIIbβ3。CD154作為一種共刺激分子，對T細胞亞群中的濾泡輔助性T細胞（follicular helper T cell，Tfh）尤其重要。在Tfh上，CD154通過結(jié)合B細胞表面的CD40促進B細胞成熟和功能，從而促進細胞間的交流。細胞表面CD154的缺失也會阻止生發(fā)中心的形成，從而抑制抗體親和力，這是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的一個重要過程。

在異種器官移植中，有大量證據(jù)證明CD154-CD40共刺激阻滯劑的使用能明顯延長移植受體的存活時間。雖然這種免疫抑制藥在異種器官移植中取得了較好的效果，但抗CD154 單抗可能引起血栓并發(fā)癥，其臨床適用性仍然存在問題[26-27]。而已經(jīng)有大量研究證實了抗CD40單抗在NHP同種異體移植和豬-NHP異種移植中的有效性[28-29]，且其在人同種異體移植中也有一定的效果[30-31]。目前，臨床腎移植受者接受了一種新的抗CD40單抗的治療研究，取得了一定的初步療效[32]。另外的研究報道了一種靶向結(jié)合CD154的新型結(jié)構(gòu)域的抗體，該抗體沒有發(fā)生血栓栓塞并發(fā)癥，并與其他抗CD154單抗具有類似的療效。盡管CD154-CD40共刺激阻滯劑有很好的進展，但尚不清楚何時以及是否最終批準抗CD40單抗或抗CD154單抗應(yīng)用于臨床器官移植。

5 臨床受者的選擇

通過NHP模型能初步驗證基因修飾豬的效用、免疫抑制方案的選擇和移植術(shù)后排斥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展等科學問題，然而，因NHP模型自身的局限性，目前仍不能達到穩(wěn)定的移植后移植物和受體長期存活。那么腦死亡器官捐獻供者是否適合作為連接動物實驗和臨床試驗的過渡？筆者所在團隊前期開展的體外實驗證實腦死亡器官捐獻供者預存抗豬抗體水平明顯較低，但具體原因不清楚。且腦死亡器官捐獻供者存在多種不穩(wěn)定因素，導致其難以長期維持穩(wěn)定的血液循環(huán)。最近，人們已將10基因型豬腎移植至腦死亡器官捐獻者，在3 d后終止實驗，病理活組織檢查未發(fā)現(xiàn)明顯的排斥反應(yīng)和微循環(huán)血栓形成[33]。雖然僅有3 d，但仍給我們提供了寶貴的實驗數(shù)據(jù)。因此，采用腦死亡器官捐獻供者作為異種器官移植受者模型有一定的應(yīng)用價值，但仍需進一步探尋更具有實驗價值的受者模型。

異種腎移植早期臨床試驗的安全性和有效性應(yīng)該與長期透析治療相比，而不是與同種異體腎移植的安全性和有效性相比較。因此，那些已經(jīng)在等待接受腎移植名單，且接受同種腎移植的可能性不大的那些患者可以考慮進行異種腎移植，例如，部分B型或O型血的患者可能會在等待名單上等待7年甚至更長時間，其中年齡超過55歲的患者在等待腎源期間很有可能因并發(fā)癥而死亡。因此，這部分患者可能是異種腎移植早期臨床試驗的最佳受者。

此外，對于高致敏的患者是否能接受豬腎這一問題，有研究發(fā)現(xiàn)HLA高水平患者中抗HLA抗體不會增加豬腎排斥反應(yīng)的風險[34]。然而，又有一些研究證實抗HLA抗體與豬白細胞抗原（swine leukocyte antigen，SLA）之間存在交叉反應(yīng)[35-36]。因此，對于早期的臨床試驗，為了避免任何交叉反應(yīng)的風險，應(yīng)選擇非高致敏的患者接受豬腎移植。另外重要的是，有少量證據(jù)表明如果患者接受豬腎并產(chǎn)生抗豬抗體（如抗SLA抗體）而發(fā)生排斥反應(yīng)后，并不影響受者繼續(xù)接受同種腎移植[37]。因此臨床試驗中，豬腎移植雖然是以治療為主要目的，但也可以有效地作為同種異體腎移植的橋梁。

6 交叉感染

排斥反應(yīng)和感染的平衡是影響移植受體長期存活的一個重要因素，前者可以導致移植物失功，后者威脅受者的生命。在異種移植中，如果供體豬是在超潔凈級的飼養(yǎng)環(huán)境下繁殖和圈養(yǎng)，那么移植的器官將不存外源性致病微生物[38]。因此，異種腎移植術(shù)后感染的發(fā)生風險可能與同種腎移植相似[39]。最近的一項研究表明，異種腎移植受體狒狒接受幾個月的免疫抑制治療后，未出現(xiàn)巨細胞病毒激活[40]。在異種移植中使用CD154-CD40共刺激阻滯劑為基礎(chǔ)的免疫維持，同時加上抗胸腺細胞球蛋白、利妥昔單抗和糖皮質(zhì)激素的免疫誘導，其免疫抑制強度明顯高于同種腎移植，理論上更易發(fā)生感染。在短期存活的腎移植豬受體中，大部分死亡原因為排斥反應(yīng)和消耗性凝血功能障礙，長期存活的受體中，一部分死于感染，但長期存活的例數(shù)并不多，無法得到充分的數(shù)據(jù)支持。無論如何，一旦異種移植受體可以得到長期穩(wěn)定的存活，可考慮使用CD154-CD40共刺激阻滯劑作為基礎(chǔ)的免疫維持方案。

人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（human endogenous retrovirus，HERV）在人體內(nèi)并不具有致病性，豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）也似乎不會對豬的健康造成問題。然而，PERV是否在人類中具有致病性，以及是否會與HERV結(jié)合形成一種新的病毒，目前還不確定，但在目前動物實驗和亞臨床試驗中均驗證未出現(xiàn)PERV的傳播。在體外實驗中，用于治療獲得性免疫缺陷綜合征的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物可以有效抑制PERV。如果證實在異種移植遠期或其他特殊情況下可能會出現(xiàn)PERV的傳播，可以通過基因編輯技術(shù)阻斷這一過程[41]，但其對豬腎功能的影響尚不得而知。

7 其它問題

7.1 高碳酸氫根

本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)異種腎移植獼猴受體均出現(xiàn)了血清碳酸氫根升高，可能是由豬腎和人腎的差異造成，但受體獼猴存活時間短，長期存活時血清碳酸氫根的濃度是否能恢復正常仍不得而知，需要進一步研究。

7.2 貧 血

豬的促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）在靈長類動物中是否發(fā)揮了充分作用，目前還存在疑問[42]。接受豬腎的NHP腎功能穩(wěn)定時，仍會發(fā)生血紅蛋白水平降低，可能與CD154-CD40共刺激阻滯劑的作用有關(guān)，對異種腎移植受者抽血的次數(shù)也比較頻繁也可能是原因之一。即使證實豬EPO不能刺激NHP或人血紅蛋白生成，也可以通過外源性的補充人EPO或者通過基因工程將人EPO導入豬細胞中。

7.3 豬腎迅速生長

將一個正在迅速增長期的豬腎移植至NHP，豬腎將在受體體內(nèi)快速增長，就像它仍在豬體內(nèi)一樣。2～3個月后，其生長速度下降，并基本與受體狒狒的生長速度一致，且將一個正在迅速增長的豬腎移植到另一個生長緩慢的豬體內(nèi)，移植腎的增長速度仍然很快[43]，表明這不是異種移植特有的問題。據(jù)推測，有一種先天因素導致了這種早期生長，敲除生長激素受體基因的豬腎或許可以解決這個問題[44]，但至今未用于豬-NHP腎移植模型中。2022年1月，美國馬里蘭大學醫(yī)學中心將1顆基因修飾豬（敲除了生長激素受體基因）的心臟移植至1例心力衰竭的患者，受者在移植術(shù)后2個月后死亡，其具體的死亡原因仍不清楚。因此，對于移植至人的豬腎究竟能生長多大，仍然不清楚。筆者總結(jié)的近20年基因修飾豬-NHP異種腎移植體內(nèi)研究情況見附表1（掃描二維碼1可見）[4,10,17-18,45-64]。

掃描二維碼1可見附表1

8 小 結(jié)

綜上所述，雖然基因修飾豬-NHP異種腎移植取得很大的進展，但因NHP本身的局限性，未來研究者們應(yīng)進一步探究豬-NHP異種腎移植中存在的排斥反應(yīng)、凝血功能紊亂、炎癥反應(yīng)、交叉感染等問題，積極尋找可能解決的方法，選擇最適的免疫抑制藥和臨床受者，促進臨床異種腎移植的應(yīng)用，解決更多終末期腎病患者的移植需求。