王 敏，段海燕，姜恭好，李忠梅

（1黑龍江大學現代農業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，哈爾濱 150080；2黑龍江大學生命科學學院，哈爾濱 150080；3哈爾濱市益農種業(yè)有限公司，哈爾濱 150080）

0 引言

水稻(Oryza sativa L.)是世界上重要的糧食之一，因此水稻的育種是一項極其重要的任務。隨著雜交水稻的出現，當前水稻的產量基本滿足人們的溫飽需求，但在水稻品質追求上，人們還在不斷發(fā)掘與改良優(yōu)越的新品種。水稻花藥培養(yǎng)技術是一種有效、快速的育種手段，本研究對現階段影響水稻花藥培養(yǎng)技術的各因素、存在的問題以及對未來的發(fā)展方向進行綜述和探究，為花藥培養(yǎng)實踐提供理論參考。

1 水稻花藥培養(yǎng)技術概況

實現植株的純合性和均一性一直是育種者的目標[1]，水稻花藥培養(yǎng)技術的出現為實現這一目標開辟了捷徑。水稻花藥培養(yǎng)技術在中國育種歷史進程中有著悠久的歷史，1975年中國利用花藥培養(yǎng)育種技術第1次育成了粳稻品種‘單豐1號’，標志花藥培養(yǎng)技術在中國常規(guī)水稻育種中開始應用[2]，到現階段已經發(fā)展成一種比較成熟、能快速恢復水稻固定育種系的重要生物技術工具[3]。相比于傳統(tǒng)的育種手法，它的最大特點就是能在較短時間內獲得目的基因型的水稻品種。目前水稻花藥培養(yǎng)多采用先誘導出愈傷組織，再分化成苗兩部分，在這個過程中提高出愈率和分化率是保證，一般來說經花藥培養(yǎng)出來的幼苗是單倍體，需進行染色體加倍方可長成正常的植株，所以染色體能否加倍也是關鍵。中國已經通過花藥培養(yǎng)的方法培育出了多個優(yōu)質的水稻品種，并且到現階段，已經逐漸結合其他選育手段來進行花藥培養(yǎng)選種。如綜合農藝性狀好，有香味，米質達部標優(yōu)質米三級標準的‘潤香玉’[4]，它是以高檔優(yōu)質秈稻‘鄂中5號’和‘玉針香’為親本，采用花藥培養(yǎng)和分子標記輔助選擇相結合的方法培育出的長粒型優(yōu)質秈稻新品種，未來還會與其他育種技術相結合，創(chuàng)造出高效、快速、準確的水稻育種體系以及創(chuàng)造更多的優(yōu)質水稻品種。

2 影響水稻花藥培養(yǎng)技術的因素

2.1 基因型

基因型對愈傷組織誘導頻率和綠苗再生效率有顯著影響[5-7]，不同基因型間誘導率及綠苗分化率差異明顯[8]，一般而言，花藥培養(yǎng)力的大小為糯稻＞粳稻＞粳秈雜交稻＞秈型雜交稻＞秈稻，相同類型的不同品種間也存在著較大差異[9]。因此，篩選出有較高的花藥培養(yǎng)力的品種作為親本是提高花藥培養(yǎng)率的根本保證。如水稻‘17y155’就有著較高的愈傷誘導率和綠苗分化率，適于用作花藥培養(yǎng)F1代的親本[10]。

2.2 取材時間及部位

葉枕間距是影響出愈率的主效因子[11]，在選材時應盡量選取主穗，葉枕距5～7 cm，且穗部飽滿，但對不同地點、不同特性的水稻材料進行綜合分析發(fā)現，判斷葉枕距不能成為取穗的唯一標準[12]。水稻資源品種繁多，來源不同其特性也不同，不能僅以葉枕距作為標準進行取材，而應該結合品種特性、取材地的氣候條件等多方面因素來確定取材標準。以穗末兩葉間的節(jié)間距離作為小孢子成熟度的外指示劑，不適用所有水稻品種[13]。因此，最有效的方式應該是用顯微鏡檢查花粉雄核發(fā)育至單核靠邊期，這時候為最適宜的取材時期，也是保證出愈率的重要基礎。此外，Rownak等[14]研究結果表明，不同小穗部位的花藥愈傷組織能力存在顯著差異，穗基部的花藥愈傷組織培養(yǎng)能力最高。

2.3 有機成分及配比

培養(yǎng)基的有機成分對花藥培養(yǎng)的出愈率以及分化率有著重要的影響[15]，但不同的水稻類型以及品種均有最適宜的培養(yǎng)基。劉建新等[12]經過試驗得出，‘五優(yōu)稻2號’為親本的誘導培養(yǎng)基配方為進口N6+凝膠3.6 g/L+蔗糖60 g/L+2,4-D 2 mg/L，最佳分化培養(yǎng)基配方為MS+KT 2 mg/L+IAA 1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂4 g/L。Aananthi等[10]比較了5個亞種秈稻品種的愈傷組織形成和再生能力，證實了添加100 mL/L椰子乳作為有機補充劑可以提高愈傷組織的反應，MS+2.5 mg/L BAP+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L KN作為分化培養(yǎng)基的效果最好。陳萍萍等[16]認為，GM8培養(yǎng)基對秈稻材料、偏秈型材料具有較好的花藥培養(yǎng)效果，N6培養(yǎng)基對粳稻具有較好的花藥培養(yǎng)效果。張選明等[11]認為水稻秈粳交品種最優(yōu)出愈培養(yǎng)基為M8+8 mg/L 2,4-D+8 mg/L NAA+4 mg/L KT+2 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂；最適宜分化的培養(yǎng)基為MS+6-BA 4 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L。所以，到目前為止并沒有一個萬能型的培養(yǎng)基，只能通過借鑒同類型的品種最適情況，探索出最適宜該品種的培養(yǎng)基及配比。

2.4 激素及其他添加物

激素能夠調節(jié)植物的生長趨向，無論是愈傷組織的誘導還是對愈傷組織的分化過程，都需要一定的激素才能刺激生長，而且添加復合激素培養(yǎng)基處理其愈傷組織數量和發(fā)育情況明顯優(yōu)于單一激素處理[16]。Rahman等[17]發(fā)現，1.0 mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)與3.0 mg/L的NAA混合后，愈傷組織誘導率顯著提高，2,4-D 1.0 mg/L與BAP 1.0 mg/L配合施用，愈傷組織發(fā)育進一步增強。Lakshmaiah等[18]通過實驗得出，含10 μM BAP與10 μM IAA組合的處理適合愈傷組織誘導。李三和等[19]認為誘導培養(yǎng)基中加入0.05 mg/L TDZ能提高花藥的出愈率。此外，一些學者還發(fā)現化學物質作為脅迫預處理因子的應用可能會對谷物和其他作物的雄激素應答產生積極影響[20]。Wan等[21]經過對頑拗性秈稻品種‘MR219’進行試驗，發(fā)現木質素磺酸鈣(CaLS)通過增加內源生長素合成、增強營養(yǎng)物質吸收和調節(jié)細胞內穩(wěn)態(tài)，能成功改善‘MR219’愈傷組織的增殖和生根。Rakesh等[22-23]指出，多胺在植物的生理過程中能幫助它們分化、誘導多能性、增加細胞分裂以及分子信號傳導。已有學者證實了多胺能夠有效促進枸杞的愈傷組織再生率和提高成苗率[24]。所以，添加激素及外源物都能刺激愈傷組織的生長于分化，且對不同品種產生的影響也不一致。

2.5 處理溫度及時間

2.5.1 預處理溫度及時間 冷預處理對親本和雜種F1花藥愈傷組織的誘導至關重要[25]，冷處理能夠延緩花粉或花藥壁的衰老，有利于花粉細胞核啟動和進一步生長發(fā)育，從而提高愈傷組織誘導率和總的綠苗率。但冷處理并不是愈極端愈好，而是有一定的溫度和時間范圍，并且與種質也有關系。李三和等[19,26]通過實驗得出預處理溫度10℃、預處理時間8天能有效改善水稻花粉的生理狀態(tài)，提高出愈率，且以蔗糖為碳源的誘導培養(yǎng)基誘導，低溫預處理8天效果較好，以麥芽糖為碳源的誘導培養(yǎng)基誘導則預處理10天達到最好的誘導效果。孫杰等[27]認為，水稻花藥在培養(yǎng)前必須要經低溫預處理，其最適的預處理溫度為8℃；冷前處理的最佳時間為9天，經過冷前處理的愈傷組織誘導率較高[28]。綜合前者研究，一般水稻在8～10℃低溫處理8～10天為適宜范圍。

2.5.2 培養(yǎng)溫度及時間 愈傷組織誘導出來后需要將其分離出來，然后通過繼代培養(yǎng)增殖，再轉接至分化培養(yǎng)基上誘導分化。過早轉接，愈傷組織太小，操作比較困難，實驗后期愈傷組織生長迅速，但結構松散，會降低分化成苗的幾率，培養(yǎng)溫度過高或者過低都不利于愈傷組織生長。張選明等[11]以水稻秈粳交品種的花藥為植體進行試驗，認為最佳愈傷轉接時間為30天；培養(yǎng)溫度為29℃時綠苗率最高。孫杰等[27,29]認為，誘導培養(yǎng)最佳的培養(yǎng)溫度為28℃，27℃為最適的分化培養(yǎng)溫度，當花藥愈傷組織長至0.2 cm時應轉移至分化培養(yǎng)基分化[30]?；ㄋ幣囵B(yǎng)的時間長短還會調節(jié)組織中銅離子和銀離子間的相互作用，從而影響再生植株的綠苗率[31]。過高的分化溫度容易導致白化苗的產生，所以為了提高綠苗率，必須嚴格把控培養(yǎng)的時間與溫度。

2.6 加倍劑

加倍劑能抑制或破壞細胞紡錘絲和初生壁的形成而產生染色體加倍，除了有的愈傷組織在繼代培養(yǎng)的過程中已經進行了染色體加倍，一般通過花藥培養(yǎng)產生的幼芽為單倍體，需要通過加倍劑使其變成雙倍體才能正常生長。秋水仙素是最早被利用的加倍劑[32]，但由于其本身含有劇毒性，對人體以及植株都有一定影響[33]，且通過秋水仙素處理由于細胞發(fā)育的不同步性容易形成嵌合體，再生植株異常生長等缺點，有學者發(fā)現了其他可替代物，如除草劑氨氟樂靈(Pronamide)、氨磺樂靈(Oryzalin)、甲酰胺草磷(APM)和氟樂靈(Trifluralin)，對一些植物進行染色體加倍的效果比秋水仙素好，且毒害程度比秋水仙素低。但在水稻花藥培養(yǎng)應用上，Hooghvorst等[34]通過對3種抗線粒體化合物（秋水仙堿、Trifluralin和Oryzalin）的染色體加倍能力比較，發(fā)現濃度在500 mg/L和625 mg/L的秋水仙堿不加DMSO時抗線粒體效果最好，同時也證實了秋水仙素是水稻染色體最有效的加倍劑[35]。Trifluralin和Oryzalin屬于硝基苯胺類除草劑，而Pronamide屬于苯基酰胺類除草劑，APM屬于磷酰胺類除草劑[36]，Pronamide和APM的作用機理與硝基苯胺類略有不同，染色體加倍效果也不一樣，但在水稻上應用的相關報道甚少。雖然現在已有多種方式能促使染色體加倍，如高溫脅迫、γ射線處理等，但添加加倍劑卻是最方便、最有效的手段，因此在加倍劑種類的開發(fā)上仍然有較大的發(fā)展空間。

3 水稻花藥培養(yǎng)存在的問題

3.1 基因型影響大

基因型很大程度決定了花藥培養(yǎng)力的大小，且在眾多類型水稻中秈稻的花藥培養(yǎng)力最低，因此，可以通過選擇花藥培養(yǎng)力高的品種作為親本，或以粳秈雜交的方式，選粳稻親緣相對較多的雜交后代進行花藥培養(yǎng)，以提高花藥培養(yǎng)的出愈率。

3.2 花藥褐化

褐化現象是由于培養(yǎng)材料的組織中多酚氧化物被激活，酚類化合物被氧化形成褐色的醌類物質，醌類化合物在酶的作用下，與培養(yǎng)材料組織中的蛋白質發(fā)生聚合，引起其他酶失活最終導致生長受阻[37]?；ㄋ庍^老或者過嫩都容易褐化，因此，應嚴格篩選材料，選擇單核靠邊期的花粉是關鍵，還應注意給予適宜的光照強度、光照時間和培養(yǎng)溫度。

3.3 愈傷組織褐化

據研究發(fā)現，培養(yǎng)基中過高濃度的無機鹽和糖都容易導致愈傷組織發(fā)生褐化，所以，培養(yǎng)基應該控制好無機鹽與糖的濃度，以及提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境。還可以嘗試在培養(yǎng)基中加入適量防褐劑如PVP、活性炭、Na2S2O3、維生素C等來抑制褐化現象[38]。從分子角度來看，Zhang等[39]發(fā)現，在BOC1基因啟動子中插入轉座子，編碼一個SIMILAR to RADICAL誘導的細胞DEATH ONE蛋白，可以通過釋放氧化應激，上調其表達，降低水稻愈傷組織褐變。

3.4 白化苗率高

植物白化是由多種基因座控制的隱性性狀[40]，一定程度上與基因突變或者基因表達異常有關，基因與環(huán)境相互作用導致植株缺少合成葉綠素的葉綠體。在誘導培養(yǎng)基中，適當降低培養(yǎng)基中無機鹽濃度和錳的含量，適量調整2,4-D或者KT的激素配比[41]，在不影響正常生長和分化的前提下降低溫度，減少光照可以一定程度上降低白化苗率。但葉綠體受核基因與葉綠體基因雙重控制，還需要從多重角度加以研究，目前仍是一個亟待解決的問題。

4 展望

雙單倍體技術是作物新品種加速生產的重要手段[42]，是產生跨季節(jié)、環(huán)境和世代穩(wěn)定的完全純合系的重要工具[43-44]。且利用雙單倍體技術顯著減少了在育種中選擇目標基因型所需的群體大小，結合分子標記輔助選擇提高了選擇目標基因的效率和精確度[45-46]，因此也節(jié)約了大量研究成本[47]。雖然單倍體的產生還有其他途徑，且文欽等[48]最新發(fā)現OsMATL基因的突變可以誘導水稻單倍體的產生，但比起花藥培養(yǎng)技術，后者更加簡單有效。目前基因型仍是制約花藥培養(yǎng)效率的主要原因，篩選出花藥培養(yǎng)力高的品種作為親本，以及將粳秈雜交來提高秈稻的花藥培養(yǎng)力已經是中國的育種目標之一。利用標記來輔助選擇促進花藥培養(yǎng)過程中效應的主效基因，是一個高效的篩選方式，但是由于受水稻的品種、環(huán)境等影響大，影響基因的位點也不一樣，篩選的難度較大。

隨著科學技術水平的提高，水稻育種技術逐漸由單一的育種技術過渡到不同技術的相互交融、共同作用[49]。在未來，除了選擇高效的品種作為親本，還應注重培養(yǎng)體系的優(yōu)化，實現花藥培養(yǎng)實驗的簡單化與統(tǒng)一化。運用其他育種技術加以輔助，如轉基因技術，通過將促進效應的基因導入到主體中從而實現高效的花藥培養(yǎng)。此外，花粉小孢子離體培養(yǎng)技術在其他作物上也已是較為成熟的一種方式，可以使花粉不受花粉壁的束縛直接與培養(yǎng)基接觸，大大提高培養(yǎng)速度，將其運用到水稻花藥育種上，理論上比傳統(tǒng)的花藥培養(yǎng)技術更有優(yōu)勢。再者，開發(fā)一些尚未運用到水稻的高效、綠色加倍劑，是實現雙單倍體、提高花藥培養(yǎng)力的另一目標。通過現代科學手段建立起完整的水稻花藥培養(yǎng)體系，如采用圖像處理和人工神經網絡相結合的方法進行建模[50]，將水稻花藥培養(yǎng)技術運用到水稻育種上，能開發(fā)更多品質優(yōu)良的水稻新品種，對豐富中國的種質資源有著重要的意義。