趙華君，潘國慶，唐瑩，王智園，趙曉瑋，陀曉宇

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)附屬精神衛(wèi)生中心，云南 昆明 650224;2）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，云南 昆明 650032;3）昆明醫(yī)科大學(xué)電鏡室,云南 昆明 650500）

肺腺癌是世界范圍最常見的惡性腫瘤之一，近年來在我國發(fā)病率有上升趨勢，雖然靶向治療等新型治療模式取得長足發(fā)展，肺腺癌的療效得到了顯著提高，但肺腺癌仍是病死率最高的惡性腫瘤之一[1]。肺腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者生存率低的最主要因素[2]，傳統(tǒng)肺腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移途徑包括：血管、淋巴管侵犯及胸膜侵犯[3]。在《WHO（2015）肺腫瘤病理診斷指南》中正式提出并命名了一種新的肺癌侵襲模式：氣腔播散或氣道播散（spread through air space，STAS），定義為呈微乳頭狀、簇狀、實性的腫瘤巢或單個散在腫瘤細(xì)胞脫離主瘤體進(jìn)入周圍肺泡腔中播散，最終形成癌島及衛(wèi)星癌灶，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[4]。到目前為止，還沒有任何被廣泛接受的理論來解釋STAS 的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，但現(xiàn)有研究已經(jīng)證實STAS 是導(dǎo)致肺腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)、進(jìn)展的獨(dú)立高危因素[5]。

受體酪氨酸激酶樣孤兒受體（receptor tyrosine kinase-like orphan rectetpor 1，ROR1）是一類膜受體，屬于Ⅰ型受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）家族，主要包括ROR1 和ROR2，其中ROR1 主要通過參與細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞間信號傳導(dǎo)，實現(xiàn)調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增殖、凋亡、分化、遷移、轉(zhuǎn)移等功能[6-8]。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，ROR1 在正常、分化成熟的組織中幾乎不表達(dá)，但在包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、惡性黑色素瘤、淋巴造血系統(tǒng)腫瘤等多種腫瘤中高表達(dá)[9-13]，而且表達(dá)水平與腫瘤惡性程度、侵襲性及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為存在密切關(guān)系[6]。

目前針對STAS 的研究主要集中在肺腺癌的臨床病理特征及預(yù)后影響等方面，研究對象主要為肺葉或亞肺葉（肺段）切除術(shù)后的腫瘤標(biāo)本。由于STAS 僅能在術(shù)后才能確診，術(shù)前或術(shù)中冰凍判斷STAS 較為困難[14]。本文結(jié)合肺腺癌的病理組織亞型，通過檢測ROR1 蛋白在肺腺癌中的表達(dá)水平，探討ROR1 作為STAS 發(fā)生預(yù)測指標(biāo)的價值，初步探討其潛在機(jī)制，為臨床在術(shù)前輔助判斷肺腺癌STAS 狀態(tài)，進(jìn)一步制定針對性治療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2017年6 月至2022 年1 月手術(shù)切除肺腺癌蠟塊標(biāo)本618例，其中男性242例（39.2%），女 性376 例（60.8%），年齡29～81歲，中位年齡59 歲。原位癌、微浸潤性腺癌及術(shù)前接受放、化療者均排除。本研究通過昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審核委員會審核。通過復(fù)習(xí)病理切片，按WHO肺腫瘤病理診斷指南[4]標(biāo)準(zhǔn)以主要腫瘤病理亞型，將肺腺癌分為高分化（貼壁型），中分化（腺泡型、乳頭型），低分化（微乳頭型、實體型），同時觀察腫瘤神經(jīng)侵犯、脈管侵犯、胸膜侵犯情況，由2 位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)生觀察是否存在STAS，記錄STAS 腫瘤細(xì)胞數(shù)目、形態(tài)、分布，見圖1。

圖1 肺腺癌病理學(xué)亞型Fig.1 Subtypes of lung adenocarcinoma

1.2 實驗方法

實驗標(biāo)本均經(jīng)中性福爾馬林固定，采用石蠟包埋，切片后，行HE 及EnVision 兩步法免疫組化染色（IHC）。ROR1 蛋白抗體購自美國Thermo Fisher 公司；二抗購自邁新生物技術(shù)公司；陰性對照采用PBS 代替一抗。

1.3 結(jié)果判斷

1.3.1 STAS 判斷與分組依據(jù)WHO 定義判斷是否發(fā)生STAS，記錄STAS 類型及細(xì)胞數(shù)量，按照病理學(xué)形態(tài)分為3類[4,15]：（1）腫瘤周圍肺泡腔內(nèi)見呈微乳頭或簇狀腫瘤細(xì)胞巢；（2）腫瘤周圍肺泡腔內(nèi)見實性小巢狀腫瘤細(xì)胞或腫瘤島；（3）腫瘤周圍肺泡腔內(nèi)見散在單個腫瘤細(xì)胞；根據(jù)STAS腫瘤細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步分組[16-17]為：無STAS 組（未觀察到STAS）、低STAS 組（STAS 腫瘤細(xì)胞數(shù)量為1～4個）、高STAS 組（STAS 腫瘤細(xì)胞數(shù)量≥5個），見圖2。

圖2 STAS 病理形態(tài)與分組Fig.2 Pathological morphology and grouping of STAS

1.3.2 免疫組化結(jié)果判斷ROR1 蛋白免疫組化染色著色定位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜（染色強(qiáng)度判斷需對比背景非特異著色），根據(jù)陽性染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞比例采用半定量積分法[11]判定結(jié)果：（1）染色強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特性計分：無著色為0分，光鏡可識別的黃色（弱陽性）為1分，棕黃色（中陽性）為2分，棕褐色（強(qiáng)陽性）為3 分；（2）計算陽性腫瘤細(xì)胞百分率并評分：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，75%為4 分。兩項得分相乘，得分≥4分，判斷為陽性；＜4 分判斷為陰性，見圖3。

圖3 ROR1 在肺腺癌中的表達(dá)（IHC ×400）Fig.3 Expression of ROR1 in lung adenocarcinoma（IHC ×400）

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件，采用χ2檢驗分析，表1 中組織學(xué)形態(tài)與STAS 關(guān)系、表2、表3 均采用列聯(lián)表分析，計算Pearson 卡方值。表1 中除上述表格外的其他表均采用一般四格表卡方檢驗計算Pearson 卡方值，再比較P值。采用χ2檢驗分析比較ROR1 在不同肺腺癌病理亞型的表達(dá)水平，并分析ROR1 在不同STAS 分組中表達(dá)的差異。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STAS 與肺腺癌亞型及臨床病理特征的關(guān)系

肺腺癌618例，STAS陽性率為31.2%（193/618），通過分析發(fā)現(xiàn)STAS 的發(fā)生與患者性別、年齡無關(guān)（P＞0.05）；有吸煙史的患者具有更高的STAS 發(fā)生率（P＜0.001）；腫瘤直徑＞2.5 cm組肺腺癌STAS 發(fā)生率為72.2%高于直徑≤2.5 cm組（P＜0.001）;進(jìn)一步分析各亞型肺腺癌的STAS陽性率發(fā)現(xiàn)：低分化肺腺癌（微乳頭型、實體型肺腺癌，STAS 陽性率分別為71.0%、64.7%），高于中分化肺腺癌（腺泡型、乳頭型，STAS 陽性率分別為26.7%、29.1%），高分化的貼壁型肺腺癌中未發(fā)現(xiàn)STAS 現(xiàn)象（P＜0.001）。通過分析臨床病理特征與STAS 發(fā)生的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，STAS 的發(fā)生與其它肺腺癌侵襲性生物學(xué)行為如：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯及胸膜侵犯相關(guān)（P＜0.001），見表1。

表1 STAS 與肺腺癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 [n（%）]Tab.1 Relationship between STAS and clinicopathological features of lung adenocarcinoma[n（%）]

2.2 ROR1 在不同亞型肺腺癌中的表達(dá)

采用免疫組化法檢測618 例肺腺癌ROR1 表達(dá)情況，通過觀察陽性率發(fā)現(xiàn)：貼壁型（9.5%）低于腺泡型與乳頭型（分別為28.6%、33.1%），而微乳頭型與實體型肺腺癌（分別為79.7%、80.4%）ROR1 表達(dá)率高于其余各亞型肺腺癌，見表2、圖4。

圖4 不同病理亞型肺腺癌STAS 發(fā)生率與ROR1 表達(dá)率的關(guān)系Fig.4 The relationship between the incidence of STAS and ROR1 expression in different pathological subtypes of lung adenocarcinoma

表2 ROR1 在不同亞型肺腺癌中的表達(dá) [n（%）]Tab.2 Expression of ROR1 in different subtypes of lung adenocarcinoma[n（%）]

2.3 ROR1 在不同STAS 分組中的表達(dá)

通過比較無STAS 組（未觀察到STAS，425例，68.8%），低STAS組（STAS數(shù)量為1～4個，109例，17.6%），高STAS組（STAS數(shù)量≥5個，84例，13.6%），3 組ROR1 表達(dá)率分別為10.6%、88.0%、94.1%，見表3、圖5；且低、高STAS 組中STAS 腫瘤細(xì)胞與主瘤體ROR1 表達(dá)強(qiáng)度基本一致，見圖6。

圖5 不同STAS 分組ROR1 陽性率Fig.5 ROR1 positive rate in different STAS groups

圖6 ROR1 在STAS 陽性肺腺癌中的表達(dá)Fig.6 ROR1 expression in STAS positive lung adenocarcinoma

表3 ROR1 在不同STAS 分組中的表達(dá) [n（%）]Tab.3 ROR1 expression in different STAS groups[n（%）]

3 討論

本研究結(jié)果顯示在618 例肺腺癌中STAS 陽性率為31.2%，有吸煙史、腫瘤直徑＞2.5 cm 的肺腺癌具有更高的STAS 陽性率，與國內(nèi)外文獻(xiàn)報道接近[18]，其中低分化的微乳頭型與實體型肺腺癌STAS 陽性率分別為71.0%、64.7%，高于中分化肺腺癌（腺泡型、乳頭型，STAS 陽性率分別為26.7%、29.1%）；而在貼壁型肺腺癌中未發(fā)現(xiàn)STAS。這一結(jié)果提示，STAS 的發(fā)生主要取決于腫瘤的分化程度，并且與神經(jīng)侵犯、脈管侵犯、胸膜侵犯一樣提示腫瘤具有更高的侵襲性生物學(xué)行為。

通過比較不同亞型肺腺癌ROR1 的表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)，ROR1 在微乳頭型與實體型肺腺癌（分別為79.7%、80.4%）中的表達(dá)高于其余各組織學(xué)類型組，這一結(jié)果顯示，ROR1 高表達(dá)于低分化肺腺癌；依據(jù)STAS 狀態(tài)進(jìn)一步分組后發(fā)現(xiàn)低STAS 組、高STAS 組的ROR1 表達(dá)率分別為88.0%、94.1%，高于無STAS 組（10.6%），說明ROR1 高表達(dá)于STAS 陽性肺腺癌。

總結(jié)本研究結(jié)果，ROR1 高表達(dá)于低分化、高侵襲性的肺腺癌，并提示高STAS 發(fā)生率。因此推測ROR1 在肺腺癌組織中的高表達(dá)可能與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展以及STAS 的發(fā)生存在密切關(guān)系，但病理生理學(xué)過程尚不明確。依據(jù)現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)報道，其潛在機(jī)制可能主要有以下幾方面：（1）ROR1 過表達(dá)誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞EMT，從而促進(jìn)STAS 發(fā)生[19-20]。EMT（上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化）是指上皮細(xì)胞通過程序轉(zhuǎn)化為表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞特征的病理生理學(xué)過程。通過EMT，腫瘤細(xì)胞極性喪失，粘附性下降，同時具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力[21]。雖然STAS是肺癌特有的一種浸潤生長模式，但在本研究中發(fā)現(xiàn)STAS 的發(fā)生與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯及胸膜侵犯腫瘤侵襲性生物學(xué)行為相關(guān)，這些侵襲性生長現(xiàn)象均是在腫瘤粘附性下降、遷移能力增強(qiáng)的前提下發(fā)生的。目前，在結(jié)腸癌、乳腺癌的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ROR1 高表達(dá)具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT 作用[13,22]，因此推測，ROR1 高表達(dá)的肺腺癌發(fā)生EMT 導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞粘附性下降，脫離主瘤體播散進(jìn)入到周圍肺泡腔內(nèi)，這可能是發(fā)生STAS 的直接原因與關(guān)鍵啟動步驟；（2）ROR1 高表達(dá)促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞高增殖、高侵襲性，導(dǎo)致STAS 發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)ROR1 高表達(dá)于分化程度低，侵襲、轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的肺腺癌亞型中，在國內(nèi)外研究中也發(fā)現(xiàn)ROR1 高表達(dá)于分化差的結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌等腫瘤中并具有促腫瘤增殖、侵襲的作用[23-24]，在一項結(jié)腸癌研究中發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)ROR1 表達(dá)能夠降低腫瘤細(xì)胞增殖與遷移能力[22]。因此，ROR1 過表達(dá)可能促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的高增殖、高侵襲性，這也是導(dǎo)致STAS發(fā)生的重要因素。

自從2015 年STAS 被WHO 列為肺癌浸潤標(biāo)準(zhǔn)以來，引起臨床病理學(xué)的高度關(guān)注[25-27]。但到目前為止，還沒有被廣泛接受的理論來解釋STAS 發(fā)生、發(fā)展機(jī)制。通過本研究發(fā)現(xiàn)，ROR1高表達(dá)的肺腺癌具有較高的STAS 陽性率，提示腫瘤差分化及高侵襲性。因此ROR1 有望成為臨床肺腺癌診斷的重要生物學(xué)標(biāo)志物，特別是通過在肺癌術(shù)前檢測ROR1 表達(dá)水平，可以輔助判斷腫瘤惡性程度，并預(yù)測肺腺癌STAS 發(fā)生概率，為臨床針對患者制定個體化的手術(shù)方式與術(shù)后治療方案提供參考依據(jù)，從而改善患者預(yù)后。ROR1 在STAS 陽性肺腺癌過表達(dá)現(xiàn)象，其病理生理學(xué)機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究；但這一發(fā)現(xiàn)，也為將來以ROR1 為靶點(diǎn)治療STAS 陽性肺癌提供了新的研究方向。