原 凱，馬 堅，馬曉芳，丁小艷，于麗麗，胡 晨，董 文，黃永清

（1.寧夏醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，銀川 750004）；2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院口腔醫(yī)院口腔頜面外科，銀川 750004）

唇腭裂（cleft lip and palate）是最常見的先天性疾病之一，平均發(fā)病率約為1/600[1]，我國發(fā)病率約為1.4/1 000[2]。該疾病不僅對患兒的面部形態(tài)及生理功能造成了極大影響（如唇部缺陷、飲食困難、發(fā)音不清、頜面部組織發(fā)育異常等），而且為患兒帶來了極大的心理障礙及壓力。同時，該疾病需要多學科共同參與，治療周期長，花費巨大，為患兒家庭和社會帶來了巨大的經(jīng)濟壓力[3]。根據(jù)其是否伴發(fā)其他先天身體畸形，可將唇腭裂分為綜合征型唇腭裂（syndromic cleft lip and/or cleft palate，SCL/P）與非綜合征型唇腭裂（non-syndromic cleft lip and/or cleft palate，NSCL/P）。非綜合征型唇腭裂（NSCL/P）是指未伴發(fā)其他器官畸形，排除于任何綜合征范圍之內(nèi)的唇裂伴或不伴腭裂的總稱[4]。目前大多數(shù)研究學者認為NSCL/P發(fā)病是遺傳與環(huán)境因素共同作用所致[5]。近年來，國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn)了與該病相關的多個易感基因，這其中包括干擾素調(diào)節(jié)因子6（interferon regulatory factor 6，IRF6）、同源異形盒基因1（msh homeobox 1，MSX1）、v-maf肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物B（v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B，MAFB）等[5-7]。

WNT9B（WNT Family Member 9B）基因位于人類染色體17q21，這一染色體區(qū)域在某些人群中與NSCL/P的發(fā)生密切相關[8]。Juriloff等[9]構建A/WySn小鼠模型，通過遺傳互補實驗，證實WNT9B基因的突變可導致包括唇裂或腭裂表型在內(nèi)的一些致命綜合征。此外Lan等[10]和Jin等[11]通過構建A/WySn小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，WNT9B基因在小鼠胚胎顱面部發(fā)育過程中可直接或間接激活經(jīng)典WNT/β-Catenin信號傳導通路，進而調(diào)節(jié)鼻突及上下頜突的發(fā)育融合。然而，由于研究人群及研究方法有所差異，各國學者所得到的WNT9B基因多態(tài)性與NSCL/P發(fā)病關系的結論也不盡相同[12-14]。本研究選取了WNT9B基因上常見的18個SNP位點進行病例對照研究，探討WNT9B基因多態(tài)性與寧夏人群NSCL/P發(fā)病是否存在相關性，并對病例組和對照組間差異有統(tǒng)計學意義的SNP位點進行生物信息學分析。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2014年1月至2019年12月就診于寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院口腔醫(yī)院口腔頜面外科的唇腭裂患者504例（男性302例，女性202例）為病例組；本院同期出生的正常新生兒455例（男性214例，女性241例）為對照組。病例組納入標準：1）患兒除患有先天性NSCL/P外，不伴有其他系統(tǒng)器官的先天畸形或疾?。?）患兒家庭無其他遺傳病史；3）患兒雙親精神、智力正常，能接受問卷調(diào)查者；4）患兒家庭至少三代為寧夏籍，并長期定居寧夏。對照組納入標準：新生兒無任何先天畸形或其他疾??；此外還應滿足病例組納入標準中2）、3）、4）項。本研究所有樣本采集均獲得患者或其監(jiān)護人知情同意，并已通過寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院倫理委員會批準（批號：2015-076）。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取及基因分型 收集患者及正常新生兒血樣5 mL，加入EDTA抗凝劑，使用Wizard基因組DNA純化試劑盒提取純化血樣中的基因組DNA，之后通過紫外線吸收法和瓊脂糖凝膠電泳對所提取的DNA樣本進行濃度及純度測定，檢測合格樣本于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。結合HapMap基因庫數(shù)據(jù)、Haploview中的tagSNP以及最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.5作為選取標準，最終選定WNT9B基因上18個常見的SNP，于Ion Torrent測序平臺對所選SNP運用AgriSeqTM靶向測序技術進行基因分型。此部分實驗委托博奧生物公司完成（通過多方考察和對比，公司后期給予質(zhì)控標準及驗證，以保證數(shù)據(jù)真實可靠）。

1.2.2 生物信息學分析 通過3DSNP數(shù)據(jù)庫（http：//cbportal.org/3dsnp/）、RegulomeDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.regulomedb.org/regulome-search）對目標SNP位點的三維互作基因、三維互作SNP位點及染色質(zhì)狀態(tài)進行分析總結。

1.3 統(tǒng)計學方法

對照組基因分型結果進行哈迪-溫伯格（Hardy-Weinberg，H-W）平衡檢驗，P＞0.05即符合H-W平衡；采用SPSS 17.0軟件對病例組和對照組中所選位點的等位基因及基因型頻率進行卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義；同時使用Haploview軟件對所選位點進行連鎖不平衡及單倍型分析。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗

H-W平衡檢驗結果表明，18個所選SNP位點中，除rs2083798、rs7218180外，其余位點均符合H-W平衡（P＞0.05），之后對符合遺傳平衡定律的SNP位點進行下一步分析，見表1。

表1 WNT9B基因中18個SNP位點信息及H-W平衡檢驗

2.2 WNT9B基因中16個SNP位點等位基因頻率分析

對16個SNP位點進行等位基因頻率分析，兩組間rs62071984位點（P=0.031 8，OR=1.477）和rs1530364（P=0.028 4，OR=1.250）差異有統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 WNT9B基因中16個SNP位點等位基因頻率分析［頻數(shù)（%）］

2.3 兩組患者連鎖不平衡及單倍型分析

連鎖不平衡及單倍型分析結果顯示，18個SNP位點分別形成3個單倍型塊，其中Block 2（rs74941685、rs58818473、rs2083798、rs2083797、rs57258872、rs7212221、rs62071984、rs7218180、rs4968279、rs12150651、rs2165846）中的單倍型AAGCGCAATCG（P=0.047 8，OR=0.696）在病例組和對照組間的差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），見表3、圖1。

圖1 WNT9B基因18個SNP位點的連鎖不平衡和單倍型分析

表3 WNT9B基因中18個SNP位點單倍型分析

2.4 生物信息學分析

2.4.1 與目標SNP位點相關的三維互作分析3DSNP數(shù)據(jù)庫根據(jù)3D染色質(zhì)結構模型，將染色質(zhì)環(huán)分為兩種類型，即環(huán)內(nèi)相互作用（Within loop，跨度＜200 kb）與錨對錨相互作用（Anchor-to-anchor，跨度＞200 kb）[15]。與rs62071984、rs1530364相關的三維互作基因所示，染色質(zhì)環(huán)類型均為環(huán)內(nèi)相互作用，見表4。

表4 與目標SNP位點相關的三維互作基因

與rs62071984相關的SNP位點包括rs118065250和rs184316580；與rs1530364相關的SNP位點包括rs149109510、rs1530365、rs4968282等9個，見表5。在這些位點中，僅有rs4968282在以往報道中與NSCL/P相關，其余位點均未查及與NSCL/P的相關性研究[16]。

表5 與目標SNP位點相關的三維互作SNP

2.4.2 染色質(zhì)狀態(tài)分析 在RegulomeDB數(shù)據(jù)庫中查詢目標SNP染色質(zhì)狀態(tài)，rs62071984在120種細胞系或器官組織中與抑制性多梳蛋白（Polycomb）有關。Polycomb Group（PcG）是一類極為保守的轉(zhuǎn)錄抑制因子，在染色質(zhì)結構發(fā)育中起著重要作用[17]；rs1530364在53種細胞系或器官組織中與polycomb相關，在62種細胞系或器官組織中處于沉默子區(qū)域，并發(fā)揮相應作用影響DNA轉(zhuǎn)錄過程，以此調(diào)控基因表達，見圖2。

圖2 目標SNP的染色質(zhì)狀態(tài)

3 討論

NSCL/P作為一類先天性缺陷疾病，其病因復雜，涉及遺傳和環(huán)境等多種因素，具有顯著的遺傳異質(zhì)性[5]。目前多數(shù)學者認為NSCL/P由多種基因共同作用所致。因此，破解其中的遺傳密碼已成為世界學者共同面對的難題。隨著對候選突變位點的定位篩選技術更新?lián)Q代，從遺傳標記分子檢測技術到基因組學研究，同時加以各類數(shù)據(jù)庫及生物信息學分析工具的輔助，都為其病因機制研究提供了更多途徑。

WNT9B基因位于人類染色體17q21區(qū)域，這一區(qū)域與小鼠clf1區(qū)域同源。多位學者研究發(fā)現(xiàn)[9，18]，clf1區(qū)域主要呈現(xiàn)為WNT9B基因的自發(fā)隱性突變，并據(jù)此選擇A/WySn小鼠構建動物模型，結果提示，WNT9B基因可對胚胎顱面部發(fā)育產(chǎn)生重要影響。近年來，通過對來自不同地區(qū)的不同人群進行基因組學研究后發(fā)現(xiàn)rs4968282、rs1530364、rs197915等多個新的突變位點，但研究結果未能表現(xiàn)出一致性[13-14，16，19-20]。本研究選取了WNT9B基因上18個SNP位點進行病例對照研究；排除不符合H-W平衡的SNP位點，結果表明，2個SNP位點（rs62071984，rs1530364）的差異有統(tǒng)計學意義，提示這2個SNP位點與寧夏地區(qū)NSCL/P的發(fā)病可能具有相關性。連鎖不平衡及單倍型分析表明，3個連鎖Block中，位于Block 2的WNT9B AAGCGCAATCG單倍型與NSCL/P風險降低相關（P=0.047 8，OR=0.696），且rs62071984位于Block 2內(nèi)，提示Block 2是很有價值的研究區(qū)域。雖rs1530364未分布于連鎖Block內(nèi)，但在先前的報道中，F(xiàn)ontoura等[13]對巴西人群中70例核心家系樣本進行研究發(fā)現(xiàn)，WNT9B基因rs1530364與NSCL/P具有很強的相關性；同時Jain等[21]也通過實驗測序發(fā)現(xiàn)，WNT9B基因rs1530364與南印度人群NSCL/P的發(fā)生具有密切關系。但Shibano等[14]通過對日本人群中74例核心家系樣本及14例NSCL/P患者父母樣本進行二代測序后，結果顯示，WNT9B基因rs1530364與日本人群NSCL/P不存在相關性。結合本研究所得結果，rs1530364雖表現(xiàn)出與寧夏地區(qū)NSCL/P具有相關性的可能，但與既往不同人群研究結果未能表現(xiàn)出高度一致，這更表明了NSCL/P具有很強的人群特異性。

NSCL/P作為一類多基因遺傳疾病，基因間的相互作用在其發(fā)病過程中起著重要作用。隨著三維基因組學的發(fā)展，基因組結構被認為是一維的看法被打破，基因的三維空間結構為其發(fā)揮功能提供了更多研究可能[22]。染色質(zhì)環(huán)結構通過減小調(diào)控元件與靶基因之間的距離，從而促成二者之間的相互作用[23]。同時，染色質(zhì)環(huán)結構中多以“增強子-啟動子”成環(huán)最為多見，該成環(huán)構象經(jīng)常改變臨近基因的表達狀態(tài)[24]。本次研究通過3DSNP數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)與目標SNP三維互作的基因包括GOSR2及WNT9B；與其三維互作的SNP位點共有11個，其中僅有rs4968282在以往報道中與NSCL/P相關。

GOSR2基因同樣位于小鼠clf1區(qū)域，Juriloff等[18]通過A/WySn小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)GOSR2基因在小鼠胚胎10～11 d頭部的表達水平與正常小鼠模型相比，差異無統(tǒng)計學意義。三維基因組學的出現(xiàn)，為GOSR2基因與NSCL/P之間的聯(lián)系提供了更多的研究方向。

rs4968282位于WNT9B基因的內(nèi)含子區(qū)，Nikopensius等[16]對來自歐洲的300例NSCL/P患者進行病例對照研究，結果表明，WNT9B基因rs4968282的G等位基因與NSCL/P風險降低有關（OR=0.688；95%CI=0.548~0.865）；而在單倍型分析中，WNT9B CA單倍型與NSCL/P風險增加有關（P=0.001 34），WNT9B GG單倍型與NSCL/P風險降低有關（P=0.001 55）。而Mostowska等[19]通過對波蘭人群進行研究發(fā)現(xiàn)WNT9B rs4968282與NSCL/P無統(tǒng)計學關聯(lián)。在一項包含179個基因中的5 437個變異的全基因組關聯(lián)研究（Genome-Wide Association Studies，GWAS）中發(fā)現(xiàn)，雖然rs4968282未達到全基因組顯著性閾值水平，但達到了候選基因顯著性水平（P=2.65×10-4）[12]。

本次研究通過RegulomeDB數(shù)據(jù)庫分析目標SNP的染色質(zhì)狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，rs62071984在多種細胞系或器官組織中與polycomb相關。polycomb抑制復合物（polycomb repressive complex 2，PRC2）理論上可抑制WNT信號，從而影響多種生物發(fā)育進程，包括骨骼肌分化[25]、紅細胞生成[26]和腸道穩(wěn)態(tài)[27]等。WNT信號通路可參與調(diào)節(jié)多種細胞活動，并在多種器官發(fā)育過程中起著重要作用，尤其與頜面部形態(tài)發(fā)育關系密切。既往多項研究表明，WNT信號通路與NSCL/P相關，并通過A/WySn小鼠等動物模型得到證實[10]。因此PRC2與WNT信號通路之間的聯(lián)系可為rs62071984與NSCL/P的研究提供更多思路。

本研究通過病例對照實驗發(fā)現(xiàn)，WNT9B基因rs62071984、rs1530364與寧夏地區(qū)NSCL/P相關，WNT9B AAGCGCAATCG單倍型與NSCL/P風險降低相關；并通過3DSNP、RegulomeDB數(shù)據(jù)庫得出與其相關的基因、SNP位點及染色質(zhì)狀態(tài)。雖然本次實驗H-W平衡結果中未發(fā)現(xiàn)rs1530364參與連鎖重組，但生物信息學分析結果提示其與rs4968282關系密切，并與NSCL/P具有較強的相關性。同時對rs62071984的染色質(zhì)狀態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，PRC2與WNT信號通路之間的聯(lián)系可為NSCL/P的病因?qū)W研究提供更多研究方向。