許麗衛(wèi) 孫德慧 耿梅梅 陳 聞 賀志雄 王久榮

(中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，長沙 410125)

功能性低聚糖是最主要的一類益生元，研究表明，飼糧中添加功能性低聚糖可以提高動物腸道的免疫能力，維護機體健康[1-2]。功能性低聚糖在動物胃腸道既不能被水解也不能被吸收，可黏附腸道中的有害病菌，刺激腸道有益菌的繁殖代謝，調(diào)節(jié)腸道微生物菌群平衡，從而提高宿主的機體健康水平，降低由于消化道疾病導致的幼齡動物的死亡率[3-4]。酸性低聚糖是反芻動物初乳的重要組成部分，占比80%～90%，與生物體的炎癥、癌癥發(fā)生、新陳代謝以及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持等息息相關(guān)[5-6]。研究酸性低聚糖在幼齡反芻動物腸道內(nèi)容物中的變化情況，對于揭示其對幼齡反芻動物腸道健康的作用機制具有重要意義。

酸性低聚糖的檢測難點在于它們具有極強的親水性與相似的化學結(jié)構(gòu)，異構(gòu)體較多，且沒有發(fā)色官能團或熒光官能團。目前，酸性低聚糖含量的測定方法主要有：核磁共振法、凝膠排阻色譜法、高效陰離子色譜分析法、毛細管電泳法、反相和親水排斥作用液相色譜法[7]以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8]。核磁共振法所需樣品量大，分析較為復雜；凝膠排阻色譜法較為耗時，不能將異構(gòu)體完全分開，且需與其他手段聯(lián)用后方可對目標物進行定量分析；高效陰離子色譜分析法雖有較高的靈敏度，但需要與凝膠排阻色譜法聯(lián)用，按性質(zhì)分類后分離測定；反相和親水排斥液相色譜法需將目標物進行衍生后方可測定。目前，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法已逐漸成為分離酸性低聚糖的主要手段，其中石墨化碳液相色譜、熒光標記液相色譜或者不衍生直接進樣的液相色譜法等[8-10]與質(zhì)譜聯(lián)用已用于分離酸性低聚糖，測定樣品種類主要集中在人乳、牛乳、羊乳以及嬰兒配方奶粉，色譜柱主要為氨基柱和親水排斥色譜柱，離子模式為正離子或者負離子模式，測定的種類有3′-唾液基-3-巖藻基乳糖(3′-sialyl-3-fucosyl lactose，3′-S,3-FL)、3′-唾液乳糖(3′-salivary lactose，3′-SL)、6′-唾液乳糖(6′-salivary lactose，6′-SL)、唾液基乳糖-N-四糖a(sialyl lactose-N-tetrasaccharide a，LSTa)、唾液基乳糖-N-四糖b(sialyl lactose-N-tetrasaccharide b，LSTb)、唾液基乳糖-N-四糖c(sialyl lactose-N-tetrasaccharide c，LSTc)、雙唾液基乳糖-N-四糖(disasialyl lactose-N-tetrasaccharide，DSLNT)、二唾液酰乳糖(disasialyl lactose，DSL)、6′-唾液基-N-乙?；樘?6′-sialyl-N-acetylated lactose，6′-SLN)、3′-唾液基-N-乙酰乳糖胺(3′-sialyl-N-acetylated lactose，3′-SLN)。

目前，關(guān)于動物腸道內(nèi)容物中酸性低聚糖測定方法研究較少。Amanda等[11]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，在負離子、多反應(yīng)監(jiān)測模式下，對新生的荷斯坦公?？漳c、回腸以及結(jié)腸中的3′-SL、6′-SLN、3′-SLN、DSL和6′-SL共5種酸性低聚糖進行了測定，發(fā)現(xiàn)其在腸道內(nèi)容物中的含量較低，為20～300 μg/g；但未見對LSTa、LSTc和3′-S,3-FL定量分析的報道。動物不同腸道內(nèi)容物的含水量不同，且含有豐富的脂類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，導致腸道內(nèi)容物樣品基質(zhì)復雜且均一性較差，準確定量酸性低聚糖較為困難。因此，本研究擬采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，建立一種簡單、操作性強、準確、靈敏度高，且對動物不同腸段內(nèi)容物中8種酸性低聚糖進行單次分離分析并絕對定量檢測的技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

標準品：3′-S,3-FL(純度>95%，法國Elicityl公司)、LSTa(純度≥90%，法國Elicityl公司)、3′-SL(純度≥95%，加拿大TRC公司)、6′-SL(純度≥95%，加拿大TRC公司)、LSTc(純度>90%，Glycosci)、DSL(純度≥90%，Glycosci)、6′-SLN(純度≥95%，英國Dextra公司)、3′-SLN(純度≥95%，英國Dextra公司)。乙腈、甲醇(色譜純，美國Fisher公司)，乙酸銨(色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司)，水(中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室自制、電阻率為18.2 MΩ)；氨基固相萃取小柱(100 mg，1 mL，深圳逗點生物技術(shù)有限公司)；0.22 μm尼龍濾膜(天津市希波氏科技有限公司)；樣品為中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所畜禽健康養(yǎng)殖研究中心提供的羔羊腸道內(nèi)容物，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

Exion LC 30A-Q-Trap 5500超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿-線性離子阱質(zhì)譜儀(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS/MS)(美國AB SCIEX公司)，配備電噴霧離子源、自動進樣器；色譜柱Acquity UPLC?BEH Amide(1.7 μm，100 mm×2.1 mm)及其配套保護柱(美國Waters公司)；Vortex-6渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；ME104、XPR2電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Classic DI超純水系統(tǒng)(英國Elga公司)；CR22 GⅡ高速離心機(日本日立公司)。

1.3 色譜和質(zhì)譜條件

色譜部分。流動相：A相，15 mmol/L乙酸銨水溶液；B相：15 mmol/L乙酸銨乙腈：水(體積比9∶1)，流速為0.3 mL/min；多次優(yōu)化后，得到梯度洗脫條件為0～1 min，5% A相；1～2 min，25% A相；2～3 min，35% A相；3～6 min，35% A相；6～7 min，50% A相；7～8 min，50% A相；8.01～11 min，5% A相；總運行時間為11 min，進樣體積3 μL，柱溫40 ℃。

質(zhì)譜部分。負離子模式，離子源電壓為-4 500 V，離子源溫度為500 ℃，氣簾氣為高純氮氣，壓力為35 psi；碰撞氣級別為中，Gas1和Gas2壓力均為55 psi，多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測。8種目標物的多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)見表1。

1.4 樣品前處理條件的優(yōu)化

將采集的羔羊空腸內(nèi)容物樣品冷凍干燥，制成粉狀樣，分別對提取溶劑體積、溶劑提取次數(shù)、沉淀蛋白溶劑、沉淀蛋白溶劑體積、沉淀蛋白時間以及氨基固相萃取柱凈化條件進行優(yōu)化。

表1 8種目標物的多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)Table 1 Multiple reaction monitoring parameters of eight target analytes

通道1為定量離子對，通道2為定性離子對。The channel 1 was the quantitative ion pair, and the channel 2 was the qualitative ion pair.

1.4.1 提取溶劑體積的篩選

目標物水溶性好，因此選用水作為提取溶劑。精確稱取每份樣品0.050 0 g，加入水的體積分別為500、750、1 000、1 250和1 500 μL，渦旋混合均勻，超聲提取10 min，每個處理3個重復；接著以16 400×g、4 ℃離心10 min；取上清200 μL，加入800 μL乙腈沉淀蛋白；再次以16 400×g、4 ℃離心10 min；取上清液過0.22 μm濾膜，按照1.3中的色譜和質(zhì)譜條件上機測試。

1.4.2 溶劑提取次數(shù)的篩選

精確稱取每份樣品0.025 0 g，分別加入625 μL水，渦旋混合均勻，超聲提取10 min，每個處理3個重復；分別提取1、2和3次，3次提取液均按照1.4.1中離心并沉淀蛋白，取上清液過0.22 μm濾膜，按照1.3中的色譜和質(zhì)譜條件上機測試。

1.4.3 沉淀蛋白溶劑的篩選

精確稱取樣品0.050 0 g，加入1 250 μL水，渦旋混合均勻，超聲提取10 min，分別提取2次；按照1.4.1中離心后，合并2次上清液。各取上清液200 μL，分別加入600 μL乙腈、600 μL甲醇2種常用的沉淀蛋白溶劑，每個處理3個重復；沉淀0.5 h，再次以16 400×g、4 ℃離心10 min；取上清液過0.22 μm濾膜，按照1.3中的色譜和質(zhì)譜條件上機測試。

1.4.4 沉淀蛋白溶劑體積的篩選

精確稱取樣品2份，每份0.050 0 g，分別加入1 250 μL的水，渦旋混合均勻，超聲提取10 min，以16 400×g、4 ℃離心10 min；提取2次，合并所有上清液；各取上清液200 μL，分別按照樣品與沉淀試劑體積比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5加入乙腈沉淀蛋白，每個處理3個重復；沉淀0.5 h，再次以16 400×g、4 ℃離心10 min；取上清液過0.22 μm濾膜，按照1.3中的色譜和質(zhì)譜條件上機測試。

1.4.5 沉淀蛋白時間的篩選

精確稱取樣品3份，每份0.050 0 g，分別加入1 250 μL水，渦旋混合均勻，超聲提取10 min，以16 400×g、4 ℃離心10 min；分別提取2次，合并所有上清液。各取上清液200 μL，加入乙腈600 μL沉淀蛋白，分別沉淀0.5、1.0、2.0、4.0、6.0和24.0 h，再次以16 400×g、4 ℃離心10 min，每個處理3個重復；取上清液過0.22 μm濾膜，按照1.3中的色譜和質(zhì)譜條件上機測試。

1.4.6 氨基固相萃取小柱凈化條件

1.4.6.1 淋洗液的篩選

固相萃取柱選擇氨基柱(100 mg，1 mL)，先用1 mL甲醇活化，然后取沉淀蛋白后的上清液500 μL上樣，棄去流出液，分別利用乙腈∶水(體積比70∶30)和乙腈∶水(體積比50∶50)500 μL進行淋洗，淋洗液過0.22 μm濾膜，按照1.3中的色譜和質(zhì)譜條件上機測定。

1.4.6.2 洗脫溶劑的篩選

固相萃取柱選用氨基柱(100 mg，1 mL)，先用1 mL甲醇活化，取沉淀蛋白后的上清液500 μL上樣，棄流出液，再分別用洗脫液1(500 μL水)，洗脫液2(250 μL水、250 μL 15 mmol/L的乙酸銨水溶液)以及洗脫液3(500 μL 15 mmol/L的乙酸銨水溶液)洗脫，收集洗脫液，分別加入500 μL乙腈混合均勻后，過0.22 μm濾膜，按照1.3中的色譜和質(zhì)譜條件上機測定。

1.5 標準工作曲線配制、線性范圍及檢出限

稱取3′-SL、6′-SLN、LSTa、3′-S,3-FL、LSTc、3′-SLN、DSL、6′-SL的標準品，用乙腈：水(體積比50∶50)溶解，濃度分別為1 048、1 000、940、100、500、1 000、500和1 070 μg/mL的單種標準儲備液。取各個標準物質(zhì)的儲備液，配制3′-SL、6′-SLN、LSTa、3′-S,3-FL、LSTc、3′-SLN、DSL和6′-SL濃度分別為50.00、2.50、2.35、2.50、5.00、2.00、3.00和16.10 μg/mL的混合標準溶液A，以此作為母液，配制一系列標準曲線，各標準曲線的樣品濃度見表2。目標化合物根據(jù)峰響應(yīng)強度進一步稀釋測定其定量限和檢出限。以各目標物的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作圖，得線性回歸方程；以目標物3倍信噪比的濃度為其檢出限，10倍信噪比的濃度為其定量限。

表2 標準曲線的樣品濃度Table 2 Sample concentration of standard curve ng/mL

1.6 方法學考察

以樣品濃度5的標準樣作為供試品，重復測定7次，考察所建立方法的精密性；以羔羊十二指腸內(nèi)容物為供試品，平行取樣3份，按照優(yōu)化前處理條件處理，考察所建立方法的重復性；以羔羊十二指腸內(nèi)容物為供試品，分別加入20、40和60 μL的混合標準溶液A，按照優(yōu)化的前處理條件處理，測定樣品的加標回收率。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 9.0軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用平均值±標準差表示，圖由軟件直接生成。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶液體積的優(yōu)化

由圖1可知，空腸內(nèi)容物中未檢出3′-S,3-FL、LSTa和LSTc；綜合比較已檢出的目標物發(fā)現(xiàn)，1 250 μL水提取的目標物峰面積最高。因此，在0.050 0 g樣品中加入1 250 μL水進行提取，即樣品(g)∶水(mL)=1∶25。

2.2 溶劑提取次數(shù)的篩選

由圖2可知，第2次提取比第1次提取得到的目標物明顯減少，第3次提取溶劑中幾乎檢測不到目標物。因此，提取次數(shù)確定為2次。

3′-SL：3′-唾液乳糖 3′-salivary lactose；6′-SLN：6′-唾液基-N-乙酰化乳糖6′-sialyl-N-acetylated lactose；DSL：二唾液酰乳糖 disasialyl lactose；6′-SL：6′-唾液乳糖 6′-salivary lactose；3′-SLN：3′-唾液基-N-乙酰乳糖胺 3′-sialyl-N-acetylated lactose；LSTa：唾液基乳糖-N-四糖a sialyl lactose-N-tetrasaccharide a，LSTa；LSTc：唾液基乳糖-N-四糖c sialyl lactose-N-tetrasaccharide c；3′-S,3-FL：3′-唾液基-3-巖藻基乳糖 3′-sialyl-3-fucosyl lactose。下圖同 the same as below。圖1 提取溶劑體積對目標物峰面積的影響Fig.1 Effects of extraction solvent volume on peak area of target analytes

圖2 提取次數(shù)對目標物峰面積的影響Fig.2 Effects of extraction times on peak area of target analytes

2.3 沉淀蛋白溶劑的篩選

由圖3可知，利用乙腈作為沉淀蛋白的溶劑，各個目標化合物的峰面積均較甲醇的理想。因此，選用乙腈作為沉淀蛋白溶劑。

圖3 沉淀蛋白溶劑對目標物峰面積的影響Fig.3 Effects of precipitated protein solvent on peak area of target analytes

2.4 沉淀蛋白溶劑比例的篩選

由圖4可知，當樣品與沉淀試劑的比例為1∶1和1∶2時，與其他比例相比，各個目標化合物的響應(yīng)值相對較高。因此，為確保樣品中的蛋白最大限度的沉淀，樣品與沉淀試劑的比例選用1∶2。

圖4 沉淀蛋白溶劑比例對目標物峰面積的影響Fig.4 Effects of precipitated protein solvent rate on peak area of target analytes

2.5 沉淀蛋白時間的篩選

由圖5可知，當沉淀蛋白時間在0.5～1.0 h時，各個目標化合物的響應(yīng)值較為穩(wěn)定，隨著沉淀蛋白時間的延長，各個目標化合物的響應(yīng)峰值略有下降，因此選擇0.5 h作為沉淀蛋白時間。

2.6 氨基固相萃取小柱凈化條件篩選

2.6.1 淋洗液的篩選

測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈∶水=70∶30和乙腈∶水=50∶50作為淋洗液，其中均有目標物3′-SL、6′-SL、6′-SLN和3′-SLN，用這2種淋洗液會造成目標物的損失，故不選用以上2種淋洗液淋洗。

圖5 沉淀蛋白時間對目標物峰面積的影響Fig.5 Effects of precipitated protein time on peak area of target analytes

2.6.2 洗脫溶劑的篩選

測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當用洗脫液1或洗脫液2洗脫時，DSL檢測到的量極少；當用洗脫液3洗脫時，8種目標物可以全部洗脫。因此選用15 mmol/L的乙酸銨水溶液(洗脫液3 500 μL)作為洗脫溶劑。

綜上所述，篩選的前處理是以水為提取溶劑，樣品(g)∶水(mL)為1∶25，以16 400×g，4 ℃離心10 min。超聲提取2次，合并2次上清液；以乙腈沉淀蛋白，上清液與乙腈之間的體積比為1∶2，沉淀時間為0.5 h。再次離心后取上清液，用氨基柱(100 mg，1 mL)作為固相萃取柱，先用1 mL甲醇活化，取上清液500 μL上樣，棄流出液；再用15 mmol/L的乙酸銨水溶液500 μL洗脫，洗脫液加入500 μL乙腈混合均勻，過0.22 μm濾膜，按照1.3的色譜和質(zhì)譜條件上機測定。標準品和十二指腸內(nèi)容物中目標化合物總離子流圖和提取離子流圖見圖6。

2.7 標準工作曲線配制、線性范圍及檢出限

由表3可知，3′-SL、6′-SLN、LSTa、3′-S,3-FL、LSTc、3′-SLN、DSL和6′-SL的線性范圍分別為5.00～2 000.00、2.50～100.00、9.59～94.00、10.0～100.00、27.80～200.00、4.00～80.00、6.00～120.00和16.10～642.00 ng/mL。8種目標物分別在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均達到0.991以上，檢出限在0.335～8.330 ng/mL，結(jié)果見表3。

2.8 方法的精密性、重復性和回收率考察

由表4可知，方法精密性檢測結(jié)果表明，各色譜峰的保留時間和峰面積的相對標準偏差分別不超過0.5%和5.0%，說明本方法精密性良好。方法的重復性檢測結(jié)果表明，各色譜峰的保留時間和峰面積的相對標準偏差分別不超過0.5%和11.0%?；厥章蕶z測結(jié)果表明，樣品加標平均回收率為77.3%～122.9%。

2.9 不同腸段樣本中目標物的測定

選取羔羊空腸、回腸、結(jié)腸和盲腸4個不同腸段內(nèi)容物樣品，冷凍干燥研磨成粉后，分別稱取0.025 0 g，按照優(yōu)化的條件，測定不同腸段內(nèi)容物中目標物的含量。由表5可知，4個腸段內(nèi)容物中均未檢出LSTc；不同腸段中檢出目標物的含量不同，3′-SLN除在空腸中含量較低外，其余3個腸段中的含量接近。其他檢出目標物的含量差異較大，空腸和回腸中的含量接近，盲腸中的含量除3′-SL高于結(jié)腸外，其他目標物的含量接近。

3 討 論

方法建立在樣品前處理條件優(yōu)化過程中，開展了進樣體積的篩選優(yōu)化，分別考察了1和3 μL進樣量的測定效果，由于樣品中部分目標物質(zhì)的濃度較低，目標物質(zhì)的含量差異較大，在不污染離子源的前提下，盡可能的提高目標物質(zhì)的響應(yīng)值，因此進樣體積確定為3 μL。

固相萃取小柱的篩選，基于腸道內(nèi)容物提取液中可能含有的物質(zhì)種類以及目標化合物的化學性質(zhì)，分別采用磷脂小柱和氨基固相萃取柱對樣品提取液進行凈化。腸道內(nèi)容物中含有部分脂質(zhì)物質(zhì)，有可能是主要雜質(zhì)，因此優(yōu)先選用磷脂小柱(30 mg，1 mL)作為固相萃取小柱進行凈化。但是檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目標物質(zhì)全部被磷脂小柱截留，無法用乙腈或水等洗脫溶劑洗脫下來。選用氨基柱(100 mg，1 mL)作為固相萃取柱進行預(yù)試驗，以混合標準溶液A作為樣本，用水洗脫后，發(fā)現(xiàn)除DSL外，目標物響應(yīng)值均與未過柱時接近，繼續(xù)用15 mmol/L的乙酸銨水溶液洗脫，發(fā)現(xiàn)DSL響應(yīng)值與未過柱時接近。因此，選用氨基固相萃取小柱可以凈化提取液，降低雜質(zhì)的干擾，從而獲得更高的回收率及質(zhì)譜檢測靈敏度。

圖6 標準品和十二指腸腸道內(nèi)容物樣本中目標化合物總離子流圖和提取離子流圖Fig.6 Total ion chromatogram and extracted ion chromatogram of target compounds in standard solution and duodenal intestinal content sample

表3 8種目標物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限以及定量限Table 3 Linear range, linear equation, correlation coefficient, detection limit and quantitation limit of eight target analytes

表4 樣品加標回收率Table 4 Spiked recoveries of samples

表5 不同腸段內(nèi)容物樣品中目標物測定結(jié)果Table 5 Results of target analytes in different intestinal content samples μg/g

本試驗中通過單次進樣，同時分析了8種酸性低聚糖，目標物在7 min內(nèi)全部分離，與Zhang等[10]的方法相比，保留時間更短，顯著提高了分析效率。Amanda等[11]建立的相關(guān)檢測方法，未給出目標分析物的檢出限，而本次建立的測定方法，明確了儀器的檢出限，與前者的方法相比更加有利于樣品的制備與分析。Ma等[12]建立了測定人乳中7種酸性低聚糖的高效液相色譜-質(zhì)譜法，與前者相比，本試驗建立的方法不僅檢測的種類多，而且相同目標物的線性范圍下限更低，表明該方法具有較高的靈敏度。由此可見，建立精準的測定分析酸性低聚糖在動物不同腸段含量以及變化規(guī)律的技術(shù)方法，可以更好地為深入系統(tǒng)研究動物腸道健康機制提供技術(shù)支撐。

4 結(jié) 論

本試驗通過優(yōu)化樣品冷凍干燥、水提取、乙腈沉淀蛋白以及固相萃取等前處理，建立了測定羔羊腸道內(nèi)容物中8種酸性低聚糖含量的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法。8種組分的保留時間和峰面積的相對標準偏差分別小于0.5%和11.0%，線性相關(guān)系數(shù)均在0.991以上，檢出限為0.335～8.330 ng/mL，樣品平均回收率為77.3%～122.9%。該方法可為系統(tǒng)研究酸性低聚糖對動物腸道健康的作用機制提供技術(shù)支撐。

致謝：感謝中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所公共技術(shù)中心(Institutional Center for Shared Technologies and Facilities of Institute of Subtropical Agriculture,CAS)對試驗順利開展提供的支持。