王 丹 劉玉蘭

(武漢輕工大學(xué)，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室，武漢 430023)

腸上皮是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，其具有獨特的結(jié)構(gòu)和細胞特征，不僅參與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而且在機體免疫防御中也發(fā)揮著重要作用。以往腸道體外研究主要以2D培養(yǎng)的腸道上皮細胞系為模型，但這些細胞系不能充分反映腸道形態(tài)生理的相關(guān)性和腸道分化功能，且在培養(yǎng)過程中也易突變。隨著腸道干細胞研究的發(fā)展，產(chǎn)生了一種新的研究模型，稱為腸道類器官。腸道類器官不僅能還原腸道組織復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，也能模擬腸道的生理環(huán)境，是腸道研究比較精準的體外模型。腸道類器官由位于隱窩底部的腸道干細胞分化而來。腸道干細胞增殖產(chǎn)生過渡擴增(transit amplifying,TA)細胞，這些細胞由隱窩底部向絨毛頂端遷移并分化，形成成熟的完全分化的腸道功能細胞，構(gòu)成了腸道的隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)[1]。腸道類器官的培養(yǎng)受多種信號通路的精準調(diào)控，例如Wnt、Notch和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)等。目前，隨著豬、雞、牛和羊等畜禽腸道類器官培養(yǎng)技術(shù)的建立[2-6]，腸道類器官已應(yīng)用于畜禽營養(yǎng)吸收評價、腸上皮發(fā)育以及腸道微生物等方面的研究。本文將綜述腸道類器官在畜禽營養(yǎng)中的研究進展，旨在為畜禽飼料添加劑的開發(fā)、動物腸道疾病的治療提供嶄新的思路和方向。

1 腸道干細胞與腸道類器官

1.1 腸道干細胞

腸道由單層上皮細胞組成，并具有典型的隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)。腸上皮通常3～4 d完成1次更新。這種快速更新使得腸道在復(fù)雜的環(huán)境中具有良好的屏障功能和自我保護能力。腸道干細胞是一種位于隱窩基底部，具有自我更新和分化為腸上皮功能細胞的成體干細胞。目前的研究認為，腸道干細胞存在2種類型：一種是位于隱窩基部的隱窩基部柱狀(crypt base columnar，CBC)細胞，也稱為活躍型腸道干細胞；另一種是位于隱窩+4位置(隱窩基底部之上的第4層細胞)的干細胞，也稱為沉默型腸道干細胞。2007年，有研究團隊使用體內(nèi)譜系追蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)，CBC細胞特異性表達富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5(Lgr5)基因，并發(fā)現(xiàn)整個隱窩的各種成熟細胞(包括潘氏細胞、杯狀細胞和腸內(nèi)分泌細胞)均來源于Lgr5細胞，首次證明隱窩底部的Lgr5+細胞為腸道干細胞[1]。CBC干細胞除分子標志物L(fēng)gr5外，還包括嗅質(zhì)蛋白4(Olfm4)和Achaete-Scute家族BHLH轉(zhuǎn)錄因子(Ascl2)等，這類細胞具有增殖快速且對放射線敏感等特點[7]。沉默型腸道干細胞的分子標志物有Bmi1、僅有同源結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)同源框(Hopx)和小鼠端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(m-Tert)等，這類細胞的特點是增殖緩慢且對放射線不敏感[7]。在正常生理條件下，CBC干細胞快速增殖為TA細胞并分化成各種腸道功能細胞來維持腸道自我更新和再生。當(dāng)腸道受損時，Lgr5干細胞會大量的丟失，且無法滿足腸上皮的快速修復(fù)，會進一步啟動沉默型腸道干細胞的功能。沉默型腸道干細胞會轉(zhuǎn)化為Lgr5干細胞或功能細胞的前體細胞(如潘氏細胞的前體)，進而分化為各種腸道功能細胞促進腸上皮再生[8]。

1.2 腸道類器官

腸道類器官由腸道干細胞增殖和分化而來，首先形成具有單個中央管腔的空心小球，隨后向外突出形成具有隱窩狀的萌芽結(jié)構(gòu)。2009年，Sato等[9]首次分離了小鼠的單個Lgr5腸道干細胞，將其與基質(zhì)膠混合形成3D骨架結(jié)構(gòu)，并添加一些必需生長因子，如表皮生長因子(EGF)、Noggin(BMP通路抑制劑)、Wnt3a和R-spondin1(Wnt信號激活)，成功培養(yǎng)了具有球狀3D結(jié)構(gòu)的腸道類器官。腸道類器官包含單層腸上皮的所有細胞，球體的內(nèi)部類似于腸腔，可容納脫落的細胞和代謝產(chǎn)物。腸道類器官成熟后，可通過出芽的方式形成更多的類器官，可持續(xù)傳代培養(yǎng)并保持遺傳信息的穩(wěn)定。與腸道組織類似，腸道類器官含有所有種類的腸上皮功能細胞，包括腸上皮吸收細胞、內(nèi)分泌細胞、杯狀細胞、潘氏細胞和簇細胞[9]。腸上皮中復(fù)雜的細胞種類決定了腸道的多種生理功能，如營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、激素的分泌、病原菌的抵御以及先天免疫反應(yīng)等。

2 腸道類器官生長的信號通路

2.1 Wnt信號通路

腸道類器官的生長主要依賴于腸道干細胞的增殖和分化。Wnt信號是調(diào)節(jié)腸道類器官生長關(guān)鍵的信號通路之一，常與BMP、Notch等信號通路發(fā)生協(xié)同或拮抗的相互作用。Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號能激活腸道干細胞中的Lgr5和Bmi1表達，并誘導(dǎo)干細胞增殖[10]。Wnt配體和膜上的卷曲受體蛋白(Frizzleds)以及共受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/6)結(jié)合后，會抑制大腸腺瘤息肉蛋白(APC)對β-catenin磷酸化引起的降解，β-catenin與核膜蛋白互作，進入細胞核與T細胞轉(zhuǎn)錄因子4(TCF4)結(jié)合，啟動下游靶基因c-Myc和細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的轉(zhuǎn)錄，促進細胞增殖。研究表明，激活Wnt/β-catenin信號通路可以促進干細胞對稱分裂和祖細胞去分化[11]。Wnt/β-catenin信號通路不僅調(diào)控Lgr5的表達，同時也受Lgr5的反饋調(diào)控[12]。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路只有在R-spondin存在的情況下才可能被激活，而腸道干細胞標志物L(fēng)gr5作為R-spondin的受體通過穩(wěn)定結(jié)合β-catenin增強Wnt信號傳導(dǎo)[13]。Lgr5在細胞膜上與Wnt受體LRP6和卷曲受體蛋白相互作用能增強Wnt/β-catenin信號通路[12]。因此，培養(yǎng)基中常添加Wnt信號通路的激活劑，如Wnt3a和R-spondin等生長因子來促進腸道類器官的擴增。

2.2 BMP信號通路

BMP參與腸道的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。BMP在腸上皮的絨毛區(qū)域中高度表達，但在隱窩底部表達量較低[14]。研究表明，BMP信號能夠促進上皮細胞的分化，且抑制隱窩的生長[15]。此外，BMP也能抑制β-catenin的活性以及負調(diào)控腸道干細胞的增殖[15]。轉(zhuǎn)基因表達Noggin能夠抑制BMP信號，誘導(dǎo)絨毛中異位隱窩的形成，并伴隨著腸道干細胞數(shù)量的增加[15]。條件性敲除BMP受體BMPr1a能夠引起腸道干細胞的過度增殖和隱窩數(shù)量的增加[15]。BMP的配體BMP2和BMP4通過結(jié)合其Ⅱ型受體和募集Ⅰ型受體(Bmpr1a或Bmpr1b)，將信號通過SMAD轉(zhuǎn)錄因子從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞核。BMP能夠防止一種抑癌基因同源性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)磷酸化失活，維持PTEN的活性。PTEN通過抑制磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，進而降低蛋白激酶B(Akt)的表達和β-catenin活性[15]。因此，培養(yǎng)基中常添加BMP拮抗劑Noggin以促進腸道類器官隱窩的形成[16]。

2.3 Notch信號通路

Notch信號通路對于控制腸道干細胞的分化至關(guān)重要[17]。當(dāng)Notch受體和其配體Delta樣配體1(Dll1)、Delta樣配體4(Dll4)結(jié)合時，能夠在γ-分泌酶(γ-secretase)的作用下釋放出Notch胞內(nèi)片段(NICD)，NICD轉(zhuǎn)移到核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合影響下游靶基因[Hes1和無調(diào)性同源蛋白1(Atoh1)]的表達，進而調(diào)控腸道干細胞的增殖和分化。多項研究表明，Notch信號通路能夠控制腸道干細胞向分泌型細胞分化的命運[18]。Notch能夠激活Hes1的表達進而抑制Math1基因轉(zhuǎn)錄，而Math1是腸道干細胞向分泌型細胞分化的調(diào)控者。Hes1缺失能夠增加分泌型細胞，減少腸上皮細胞數(shù)量[19]；而Math1的缺失將導(dǎo)致所有分泌型細胞的缺失[20]；Math1過量表達引起小鼠腸絨毛變短、TA細胞減少，分泌型細胞增多以及腸細胞的缺失[21]。因此，激活Notch信號將會引起隱窩增殖細胞擴增，并抑制其向分泌型細胞分化。在類器官培養(yǎng)中常通過添加Notch信號的調(diào)節(jié)因子如丙戊酸、組蛋白去乙?；敢种苿﹣砭S持干細胞的數(shù)量，促進其向成熟的腸上皮細胞分化。

2.4 Hippo信號通路

Hippo信號通路最初在果蠅中被認為是高度保守的信號。在哺乳動物中，機械刺激會導(dǎo)致核心Hippo通路的激活，其中絲氨酸/蘇氨酸激酶MST1/2、SAV1、LATS1/2和MOBKL1A/1B參與激酶級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP和TAZ的磷酸化。YAP和TAZ的磷酸化會導(dǎo)致它們被排除在細胞核之外并無法調(diào)控基因的表達。相反，在沒有Hippo通路信號傳導(dǎo)下，去磷酸化形式的YAP和TAZ位于細胞核，并與TEAD轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用并激活增殖相關(guān)基因的表達[22]。Hippo信號通路在腸道干細胞中的作用已被廣泛的研究。過表達YAP1的活性形式能抑制腸細胞的增殖并伴隨著Olfm4干細胞的丟失，而腸道上皮特異性敲除YAP1盡管不影響正常情況下的腸道功能，但在輻射損傷時會導(dǎo)致腸道過度生長和Lgr5+干細胞大量擴增[23]。相關(guān)研究表達，YAP1通過維持干細胞池參與早期腸道的再生，而晚期過度增殖與YAP和TAZ無關(guān)[24]。在腸道再生中，機械刺激調(diào)節(jié)Hippo通路可改變生態(tài)位和隱窩結(jié)構(gòu)來調(diào)控腸道干細胞的生物學(xué)功能。

3 腸道類器官在畜禽營養(yǎng)研究中的應(yīng)用

3.1 營養(yǎng)素吸收研究

腸道類器官模擬體外器官組織培養(yǎng)，能夠精準反映畜禽動物體內(nèi)營養(yǎng)素的吸收代謝特性。腸道類器官中的一些營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的關(guān)鍵酶和基因與腸道組織具有高度的一致性。研究表明，吸收細胞的分子標志物[腸道堿性磷酸酶(ALPI)、角蛋白20(KRT20)]、消化酶(蔗糖酶-異麥芽糖酶)和離子/營養(yǎng)轉(zhuǎn)運蛋白[單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白1(MCT1)、鈉依賴型葡萄糖共轉(zhuǎn)運蛋白1(SGLT1)和鈉氫交換蛋白3(NHE3)]均在豬、兔、雞和牛腸道類器官中表達[2-6,25-29]。在豬和雞的腸道類器官中也能觀察到成熟腸道組織的微絨毛[27,30]。此外，豬、兔和牛的腸道類器官中也表達內(nèi)分泌細胞的標記基因酪酪肽(PYY)和嗜鉻粒蛋白A(CHGA)，這些基因參與消化酶的分泌[27,29]。以往的研究常用2D單層細胞來評價營養(yǎng)素的吸收能力，即營養(yǎng)素從頂端轉(zhuǎn)運到上皮細胞的基底外側(cè)的過程[31]。最近，越來越多研究者采用腸道類器官來評價營養(yǎng)素對腸上皮穩(wěn)態(tài)的影響。Hou等[32]采用精氨酸處理雞腸道類器官后發(fā)現(xiàn)，精氨酸能通過維持腸道干細胞增殖和潘氏細胞數(shù)量來緩解炎性刺激引起的腸道類器官損傷。Zhu等[33]以豬的腸道類器官為模型探究了谷氨酸對腸上皮細胞自我更新的影響。Wang等[34]采用維生素A處理仔豬腸道類器官后發(fā)現(xiàn)，維生素A能減少分化細胞的出芽和標志基因的表達，同時增加干細胞標志物的表達?？傊?，以腸道類器官替代腸道細胞系為模型將會是未來營養(yǎng)學(xué)體外研究的重要方向。

3.2 病原菌與宿主互作研究

腸道類器官模型可用于模擬病原菌對腸道上皮的感染過程。借助腸道類器官，研究者可以深入剖析病原菌的入侵方式(在基底外側(cè)或頂端)、細胞內(nèi)復(fù)制和繁殖以及逃逸的分子機制。目前，已成功建立了多種病原體感染畜禽腸道類器官的模型。在豬的腸道類器官上，已成功建立了豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬三角冠狀病毒(PDCoV)的感染模型[35-37]。在牛上，也成功建立了感染鼠傷寒沙門氏菌、剛地弓形蟲和輪狀病毒的腸道類器官模型[38]。這些感染模型可以完全替代試驗動物，大大降低了動物的使用成本。采用類器官培養(yǎng)，研究者可以更進一步探究病原體的入侵機制，如病菌主要黏附于哪種腸上皮細胞類型或識別哪段腸道部位。例如，PEDV和PDCoV主要感染豬的腸上皮細胞、腸道干細胞和杯狀細胞，在豬小腸的易感性要比結(jié)腸高[28]。另外，腸道類器官也可用于研究由腸道病原體引發(fā)的上皮細胞先天免疫反應(yīng)，而用單一的腸道細胞系是無法實現(xiàn)的。

3.3 腸道微生物與上皮互作研究

腸道微生物在維持腸道上皮的消化吸收、屏障和防御功能中發(fā)揮著重要作用。腸道類器官作為一種精準的體外模型，已被廣泛地研究腸道微生物與上皮細胞之間的互作關(guān)系。這方面的研究目前主要集中在小鼠和人，在畜禽動物中的研究較少。以小鼠腸道類器官為模型，Hou等[39]發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌能保護腸道的屏障功能并激活腸道干細胞的增殖來促進腸道的損傷修復(fù)。在結(jié)腸類器官中通過顯微注射能成功建立一個模擬人類復(fù)雜的腸道微生物群與結(jié)腸互作的模型[40]。Pierzchalska等[41]以雞胚腸道類器官為模型，發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌能促進了雞胚腸道上皮細胞的生長。最近一項研究以兔盲腸類器官為模型來探究斷奶后腸道微生物死亡變化對腸道發(fā)育的影響，結(jié)果顯示，從哺乳到斷奶的過渡期腸道微生物代謝物的變化會調(diào)節(jié)上皮細胞中的基因表達，并有助于腸道屏障的成熟[42]。腸道微生物與類器官共培養(yǎng)體系的建立是微生物研究領(lǐng)域的重大突破。未來的研究需要進一步開發(fā)不同畜禽動物腸道類器官-微生物的共培養(yǎng)體系，以及多種腸道微生物與類器官共培養(yǎng)體系。

4 小 結(jié)

腸道類器官的培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展為畜禽動物的腸道研究提供了許多便利。經(jīng)過多年的努力，目前已成功培養(yǎng)了多種畜禽動物的腸道類器官。盡管如此，這些畜禽動物的腸道類器官培養(yǎng)體系還不夠完善，培養(yǎng)條件仍需要進一步優(yōu)化。例如：1)目前類器官的3D培養(yǎng)主要依賴動物來源的基質(zhì)膠，而這些基質(zhì)膠成分復(fù)雜，批次穩(wěn)定性不高，在質(zhì)控上難以把控；2)目前腸道類器官僅僅包含了腸上皮細胞，而不含有成纖維細胞、免疫細胞、血管細胞等基質(zhì)細胞，這些特征與腸道組織的環(huán)境還存在一定的差異，在很大程度上限制其在其他領(lǐng)域的應(yīng)用；3)由于腸道類器官的生長存在一定的邊緣效應(yīng)，往往處于基質(zhì)膠外圍的類器官尺寸較大，而處于基質(zhì)膠中間的尺寸偏小，導(dǎo)致腸道類器官的均一性較差，該一系列特點使得類器官的定量分析存在一定的難度。腸道類器官的共培養(yǎng)僅僅能反映營養(yǎng)素或微生物與腸道隱窩的互作，而體內(nèi)的這些物質(zhì)是直接與腸上皮細胞接觸的。因此，類器官腸腔顯微注射技術(shù)也許能更好地解決這一難點。目前，大多數(shù)畜禽動物腸道類器官僅僅是作為一種研究模型，未來可能在干細胞治療、器官移植等方面具有一定的應(yīng)用價值。