伍會琴,劉輝

癌癥是危害人類健康的主要原因之一，已經(jīng)發(fā)展成為全球性的公共衛(wèi)生問題。宮頸癌是全球第四大常見的女性惡性腫瘤[1]，對女性健康構(gòu)成嚴重威脅。在發(fā)展中國家，宮頸癌是導致女性癌癥死亡的第二大原因[2]。因此，揭示宮頸癌的發(fā)病機制、尋找新的治療靶點、探索宮頸癌特異性的生物標志物，儼然成為了當下最為迫切的問題。目前，巴氏涂片和病毒DNA分析等診斷方法以及人乳頭瘤病毒 (human papilloma virus,HPV) 疫苗的應用，對于降低宮頸癌的發(fā)病率做出了巨大的貢獻。然而，宮頸癌的治療與診斷仍是巨大的挑戰(zhàn)。

蛋白質(zhì)組學以一個基因組、細胞或完整生物所包含的一整套蛋白質(zhì)為研究對象，研究生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能，并對其進行定性定量分析。這一概念由Wilkins等[3]在1995年提出，被認為是后基因組時代的關鍵技術之一。近年來，蛋白質(zhì)組學技術逐漸成為解決有關醫(yī)學或分子生物學研究等問題的強有力工具，已經(jīng)廣泛地應用于對宮頸癌的研究中，尤其是在宮頸癌相關生物標志物的篩選中，發(fā)揮著不可替代的作用[2,4]。同時，也為探索宮頸癌的發(fā)病機制及靶向藥物的研究提供了新的方法與途徑。本文概括并總結(jié)了蛋白質(zhì)組學及其相關技術在宮頸癌研究中的應用與進展，對其涉及到的分析技術和方法進行匯總，旨在為宮頸癌的診斷及治療提供參考。

1 定量蛋白質(zhì)組學技術

1.1 二維凝膠電脈

二維凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)由Smithies和Poulik[5]在1956年提出。它是基于兩種電泳過程的集合，借助梯度pH膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)完成對蛋白質(zhì)的雙向分離，從而在蛋白質(zhì)混合物的分離中獲得更高的分辨率[5]。2-DE的凝膠根據(jù)蛋白質(zhì)在分子量以及等電點上的差異分離蛋白質(zhì)，在單次實驗中即可實現(xiàn)對4 000～5 000種蛋白質(zhì)的分離，從而實現(xiàn)大規(guī)模的蛋白質(zhì)分析[6-7]。該技術的主要優(yōu)勢在于促進蛋白質(zhì)圖譜的可視化，這有助于和其他蛋白質(zhì)圖譜直接進行比較。

使用2-DE的蛋白質(zhì)組學研究已經(jīng)應用于分析宮頸癌等惡性腫瘤。Guo等[8]采用2-DE聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)的方法篩選鱗狀宮頸癌(squamous cervical cancer，SCC)的化療敏感性生物標志物，發(fā)現(xiàn)Hsp70可能是預測鱗狀宮頸癌患者化療療效的潛在生物標志物。Jin等[9]使用蛋白質(zhì)組學方法與2-DE結(jié)合質(zhì)譜法探索Mycoepoxydiene(MED)的細胞靶標并分析MED在HeLa細胞中的抗腫瘤活性分子機制，發(fā)現(xiàn)MED可以顯著下調(diào)糖酵解和磷酸戊糖途徑中丙糖磷酸異構(gòu)酶 (triose phosphate isomerase，TPI) 和 6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶 (6-phosphogluconolactonase，PGLS)的表達水平，進而抑制糖酵解和磷酸戊糖途徑，并抑制HeLa細胞的生長。二維差異凝膠電泳(two-dimensional difference gel electrophoresis，2D-DIGE)是2-DE的一種改進形式。與傳統(tǒng)的2-DE相比，基于2D-DIGE的定量蛋白質(zhì)組學利用熒光染料(Cy3和Cy5)對蛋白質(zhì)樣品進行預標記，具有更高的靈敏度、準確度和重現(xiàn)性等優(yōu)勢。Serafín-Higuera等[10]使用2D-DIGE分析了正常宮頸細胞和感染HPV16的宮頸癌細胞之間的差異蛋白，與正常的宮頸細胞相比，感染了HPV16的宮頸癌細胞中，Mimecan、主動脈平滑肌肌動蛋白和 Lumican的表達水平增加，角蛋白、II 型細胞骨架 5、Peroxiredoxin-1和14-3-3蛋白 sigma的表達水平下降，這些蛋白可以作為識別宮頸癌的生物標志物。

1.2 非標記定量蛋白質(zhì)組學技術

非標記定量蛋白質(zhì)組學技術(label-free quantitative proteomics，LFQP)主要應用于對蛋白質(zhì)的肽段進行定量分析。肽段的定量是基于對不同生物樣品中提取的肽段質(zhì)譜峰強度的比較(基于強度的定量)，或者基于對同一肽段獲得的串聯(lián)質(zhì)譜檢測次數(shù)(光譜計數(shù)方法)來代表肽段在混合物中的相對豐度，可以在復雜樣本中實現(xiàn)對目的蛋白的鑒定與分析，適用于大規(guī)模的生物樣品研究。同時，其憑借低成本、樣本制備簡單等特點，廣泛應用于對蛋白質(zhì)及生物標志物的篩選。

Hao等[11]采用非標記定量蛋白質(zhì)組學技術分析了來自C-33A、Caski和SiHa 宮頸癌細胞系的分泌蛋白，并使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和液相色譜平行反應監(jiān)測/質(zhì)譜(liquid chromatography parallel reaction monitoring/mass spectrometry， LC-PRM/MS)等進行了相對與絕對定量驗證，結(jié)果顯示FBLN1和ANT3可以作為宮頸癌和HPV感染的血清蛋白標志物，也為相關ELISA試劑盒的開發(fā)提供參考。此外，非標記定量蛋白質(zhì)組學技術也適用于宮頸癌相關蛋白翻譯后修飾的分析。Zhang等[12]對3例宮頸鱗狀細胞癌患者的原發(fā)癌組織和相應的鄰近正常組織進行了基于質(zhì)譜(MS)的定量乙酰蛋白質(zhì)組學分析，并采用免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)及蛋白質(zhì)印跡(western blot，WB)方法進行驗證，以探討蛋白質(zhì)的乙?；趯m頸癌發(fā)生過程中的作用。研究發(fā)現(xiàn)與鄰近的正常組織相比，宮頸癌組織中的CREBBP和p300 被上乙?；f明了組蛋白乙酰化在宮頸癌進程中發(fā)揮著重要作用。近年來，由于生物信息學分析技術的不斷發(fā)展，基于非標記定量的蛋白質(zhì)組學技術也經(jīng)常和生物信息學分析結(jié)合起來，實現(xiàn)對宮頸癌相關蛋白以及生物標志物的篩選。Starodubtseva等[13]基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)的方法對宮頸腫瘤轉(zhuǎn)化不同階段的宮頸陰道液(cervicovaginal fluid，CVF)蛋白質(zhì)組進行篩選，通過繪制Venn圖、熱圖、火山圖等生物信息學分析手段，對篩選出的蛋白進行分析，并借助PLS-DA方法建立統(tǒng)計模型，對獲得的CVF蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)進行分析，該模型的敏感性為77%，特異性為94%，證明了CVF蛋白質(zhì)組可以用來反映宮頸上皮腫瘤的進程。

1.3 標記定量蛋白質(zhì)組學技術

標記定量蛋白質(zhì)組學技術(labeled quantitative proteomics，LQP) 通過使用穩(wěn)定同位素對蛋白質(zhì)或肽段進行標記并實現(xiàn)蛋白質(zhì)定量。經(jīng)過穩(wěn)定同位素標記后的蛋白質(zhì)或肽段與原來相比，除了在質(zhì)量上有差異，其基本的化學性質(zhì)并沒有發(fā)生改變，通過識別肽段的質(zhì)量差，從而實現(xiàn)對目的肽段及目的蛋白的篩選及定量。標記定量根據(jù)標記方式的不同，可以分為體內(nèi)標記和體外標記，體外標記又分為化學標記和酶促標記。

細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標記(stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC)是一種在蛋白質(zhì)合成過程中將含有“輕”或“重”同位素標記的氨基酸(精氨酸或賴氨酸)摻入到細胞蛋白質(zhì)組中，從而實現(xiàn)對全細胞蛋白質(zhì)進行標記的一種高通量定量蛋白質(zhì)組學技術，由Ong等[14]在2002年提出。該技術自面世以來，受到廣泛關注。該技術的主要優(yōu)勢在于含有同位素標記的氨基酸摻入后，差異標記的樣品在細胞裂解后立即與之混合，可以最大限度地減少處理樣品所造成的定量誤差[15]。于此同時，SILAC是一種簡單、廉價且準確的手段，可用作任何細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的定量蛋白質(zhì)組學研究，是研究蛋白質(zhì)表達、細胞信號轉(zhuǎn)導和蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要技術[16]。Zhang等[16]采用SILAC的方法評估了Zeylenone (Zey)誘導的HeLa細胞蛋白質(zhì)組的變化，結(jié)合質(zhì)譜分析并采用qPCR進一步驗證，發(fā)現(xiàn)Zey通過影響B(tài)cl-2和14-3-3蛋白家族之間的相互作用以及對HSP70和RP家族蛋白的抑制來誘導HeLa細胞凋亡，該研究對于發(fā)現(xiàn)宮頸癌潛在的抗癌靶標具有重要意義。Yang等[17]使用表達人乳頭瘤病毒(HPV16)的永生化人角質(zhì)形成細胞,通過向培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細胞(正?？谇唤琴|(zhì)形成細胞，NOKs)培養(yǎng)基中加入了標記的精氨酸與賴氨酸，以評估癌基因表達對宿主細胞的影響。借助RNA-Seq分析以及生物信息學分析等方法驗證了先前研究中已被證明受HPV影響的基因，包括上調(diào)基因IL1A、UCHL1、TYMS、EGFR、TP63和PCNA以及下調(diào)基因STAT1、FN1和ISG15。對于在SILAC技術中存在的精氨酸轉(zhuǎn)化為脯氨酸的問題，在Taga等[18]的研究中，通過向培養(yǎng)基中添加200～300 mg/L的脯氨酸即可有效抑制這種轉(zhuǎn)化并降低實驗誤差。同時，Super-SILAC 技術[19]的應用，也打破了SILAC只能應用于活細胞研究的限制，為SILAC技術的發(fā)展與應用開拓了新的方向。

同位素標記相對和絕對定量技術(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)由Ross等[20]在2004年提出，這是一種基于串聯(lián)質(zhì)譜的多重蛋白標記技術。利用多種iTRAQ試劑標記肽段氨基末端或賴氨酸側(cè)鏈基團，并使用串聯(lián)質(zhì)譜進行分析，最多可同時對八組樣品的蛋白進行定量分析和比較，是一種具有高通量、高穩(wěn)定性和廣泛適用性的分析方法。與非標記定量蛋白質(zhì)組學技術相比，該技術在統(tǒng)計學分析以及定量分析上具有更加明顯的優(yōu)勢[21]。串聯(lián)質(zhì)譜標簽法(tandem mass tag，TMT)與iTRAQ原理類似，由Thompson等[22]提出，采用等壓標記的方法對胰蛋白酶消化的肽段進行化學標記，該化學標簽會產(chǎn)生不同的報告離子(報告基團、平衡基團、反應基團)，不同的報告離子會表現(xiàn)出不同樣式的質(zhì)譜峰，對比質(zhì)譜峰的信號強度和峰面積，即可得出同一肽段在不同樣品之間的含量。

迄今為止，使用化學標記法(例如iTRAQ和TMT)進行同位素標記的技術已經(jīng)廣泛應用于蛋白質(zhì)組學研究，通過使用化學標記法成功地發(fā)現(xiàn)了許多潛在的癌癥生物標志物以及治療靶標。為研究宮頸癌組織中蛋白質(zhì)組學的復雜性并尋找疾病相關的生物標志物和治療靶點提供了有效的方法。

He等[23]對正常的SiHa細胞和用紫杉醇(Paclitaxel)和卡鉑(Carboplatin)處理14 d的SiHa細胞進行了基于iTRAQ技術的定量蛋白質(zhì)組學分析，探討抗腫瘤藥物耐藥機制的相關蛋白，GO和KEGG分析用于識別相關過程和差異表達的蛋白質(zhì)。與對照細胞相比，APOA1在抗紫杉醇和卡鉑處理的SiHa細胞中均過表達。免疫組織化學結(jié)果顯示APOA1在紫杉醇和卡鉑耐藥的宮頸鱗狀細胞癌中高度表達。因此，APOA1蛋白可以作為監(jiān)測和預測紫杉醇和卡鉑耐藥水平的潛在標志物，并且，iTRAQ技術是一種在蛋白質(zhì)水平上研究影響耐藥性因素的有效方法。Xia等[24]通過將平行反應監(jiān)測(parallel reaction monitoring，PRM)分析和 iTRAQ技術相結(jié)合，分析了Astragaloside IV (AS-IV) 處理的宮頸癌細胞中差異蛋白的表達和AS-IV抑制宮頸癌細胞侵襲的分子機制。實驗結(jié)果表明，共有32種差異表達蛋白，其中16種表達增加，另外16種表達減少。經(jīng)過GO與PPI分析，發(fā)現(xiàn) AS-IV上調(diào)Atg12并通過DCP1A和TMSB4X誘導癌細胞自噬，抑制宮頸癌侵襲。其中DCP1A和TMSB4X在自噬過程中可作為AS-I的靶標，也可作為用于宮頸癌治療的抗癌化合物篩選的靶標。同時，PRM與iTRAQ的組合可用于大分子目標化合物的鑒定，也可被視為篩選用于治療宮頸癌的抗癌化合物的新技術。Han等[25]對正常宮頸組織(N)、高級鱗狀上皮內(nèi)病變組織(HSIL)和宮頸癌組織(CC)進行了基于iTRAQ技術的差異蛋白分析，在宮頸癌樣本中鑒定了72 種差異表達的蛋白質(zhì)，其中，以核酸結(jié)合蛋白為主。HMGB2蛋白在宮頸癌樣本中呈現(xiàn)出明顯的上調(diào)，且其上調(diào)與原發(fā)腫瘤大小、浸潤深度和FIGO分期有關，并參與腫瘤的進展。最終結(jié)果表明，HMGB2可能促進宮頸癌的進展，宮頸癌組織中HMGB2的存在可能是宮頸癌疾病的生物標志物和預后指標。Grassett等[26]通過TMT分析了五氟苯基(pentafluorophenyl,PFP)作為高pH反相色譜(high pH reversed phase，Hi-pH RP)和強陽離子交換(strong cation exchange，SCX)的替代品，對在從人宮頸癌 (HeLa)細胞中分離的肽和磷酸肽進行預分餾的性能，結(jié)果顯示，復雜肽和磷酸肽樣品的離線PFP分餾減少了樣品處理和處理時間，并降低樣品復雜性。

同位素親和標簽技術(isotope-coded affinity tags，ICAT)由Gygi等[27]提出。通過使用生物素化的碘乙酰胺衍生物對蛋白質(zhì)中的半胱氨酸巰基進行標記，并使用胰蛋白酶對蛋白質(zhì)進行酶解。隨后，采用親和層析法將標記肽段與未標記肽段分離，最后進行質(zhì)譜分析與鑒定[28]。該方法允許從復雜的樣品混合物中分離含半胱氨酸的肽，從而大大減少引入質(zhì)譜儀的肽段數(shù)量。Zhang等[29]使用氧化同位素編碼親和標簽(oxidative isotope-coded affinity tags，OxICAT)分析HPV感染的宮頸癌細胞中蛋白質(zhì)的整體氧化還原狀態(tài)，以確定基因治療的潛在目標。 研究發(fā)現(xiàn)電壓依賴性陰離子通道1(voltage-dependent anion channel1，VDAC1)在HPV陽性宮頸癌細胞中被高度氧化，VDAC1與HPV16 E7相互作用促進宮頸癌發(fā)展。因此針對VDAC1的研究可能是治療宮頸癌的潛在策略。

目前質(zhì)譜定量技術主要采取數(shù)據(jù)依賴采集(data dependent analysis，DDA)和數(shù)據(jù)非依賴采集(data independent analysis，DIA)兩種方法，傳統(tǒng)的DDA在一次掃描循環(huán)中，對母離子碎裂產(chǎn)生的子離子進行分析，然而實際情況更傾向于選擇肽段樣品中的高豐度肽段，這會導致低豐度肽段的信息丟失。DIA的出現(xiàn)解決了這一問題，根據(jù)其分析原理，DIA可以將整個質(zhì)譜分析掃描窗口分為若干個小窗口，在一次掃描循環(huán)中對所有母離子進行碎裂，并記錄全部子離子的信息，并且不需要指定目標肽段且掃描點數(shù)均勻，利用譜圖庫即可完成定量離子篩選與確認，具備極佳的重復性[30]。DIA可以對所有離子碎片進行無差別的分析而不受限于目的肽段本身，適用于大規(guī)模的蛋白定量分析。如今基于DIA技術的SWATH(sequential window acquisition of all theoretical spectra)方法已被應用到宮頸癌的研究中。Shen等[31]使用SWATH-MS技術對miR-26a敲除的HeLa細胞中蛋白質(zhì)表達變化進行了分析，并創(chuàng)建了HeLa細胞中miR-26a靶向轉(zhuǎn)錄物的清單。結(jié)果顯示，NUF2、CDK6和USP47作為HeLa細胞中miR-26a的靶標。此外，首次發(fā)現(xiàn) MYPN、DNAJC9和 PPA1 作為 mi-RNA 靶標，這6個基因的表達在miR-26a過表達系中均受到抑制。

2 定性蛋白質(zhì)組學技術

鳥槍法(shotgun)是一種對蛋白質(zhì)進行全譜分析的技術，其基本方法是先使用酶消化混合物中的蛋白質(zhì)，然后通過液相色譜法(LC)分離得到肽段，并使用串聯(lián)質(zhì)譜法(MS/MS)鑒定肽段，在肽段水平實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的分析與鑒定，適用于各種蛋白質(zhì)混合物，如血清、組織、各種體液以及尿液等，是一種高通量的蛋白質(zhì)組學技術[32-33]。鳥槍法宏基因組DNA測序為了解各種生物的系統(tǒng)發(fā)育、生物多樣性、代謝能力和功能多樣性提供了有效的手段。Kwon等[34]采用鳥槍法宏基因組測序的方法，研究宮頸癌發(fā)生時宮頸微生物組的組成和功能變化。與對照組相比，宮頸癌患者宮頸微生物群以嗜堿菌屬(Alkaliphilus)、假熱菌屬(Pseudothermotoga)和沃爾巴克氏菌屬(Wolbachia)為主。宮頸上皮內(nèi)瘤變 (cervical intraepithelial neoplasia，CIN) 患者的宮頸微生物中三分之二為乳桿菌(Lactobacillus)、葡萄球菌(Staphylococcus)和內(nèi)膜念珠菌(Candidatus Endolissoclinum)。正常組宮頸微生物富含假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)和嗜冷菌屬(Psychrobacter)。結(jié)果表明，宮頸病變患者和正常受試者的宮頸微生物群落組成及其宏基因組學特征存在差異。Yang等[35]的研究也同樣證明了HPV16陽性女性陰道微生物組的組成發(fā)生了改變，例如乳酸桿菌減少和加德納菌增加，包括其他機會性病原體，這表明伴隨 HPV 感染的陰道微生物群失調(diào)很有可能導致HPV持續(xù)感染，甚至加速病變的進展。

3 結(jié)語

迄今為止，雖然對于宮頸癌的診斷和治療已經(jīng)取得了重大進展，如巴氏細胞學 (Pap)、陰道鏡檢查、醋酸肉眼檢查 (visual inspection with acetic acid，VIA) 和組織病理學檢查，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)、測序以及放療、化療、手術、免疫治療和靶向治療等治療方法，宮頸癌仍是影響全人類健康及生存的主要疾病之一，尤其是在發(fā)展中國家[36-38]。與此同時，蛋白質(zhì)組學及其相關領域的研究取得了顯著的進步，各種分析技術不斷完善，高通量、高靈敏性、高穩(wěn)定性的定量方法與定量策略也在不斷更新，使我們對于蛋白質(zhì)的組成、功能和表達有了更加深刻的認知。通過一系列的蛋白質(zhì)組學技術，我們可以對宮頸癌相關蛋白進行詳細地分析和鑒定。同時，宮頸癌生物標志物的發(fā)現(xiàn)，可以增加早期診斷和良好預后的機會，基于這些生物標志物，也可以開發(fā)新的有效療法。 未來，隨著蛋白質(zhì)組學方法策略的不斷改進和新技術的引入，蛋白質(zhì)組學在宮頸癌的診斷和治療中將會發(fā)揮越來越重要的作用。