張丙麗，王曉娟，孟菲，王愛(ài)青

1.洛陽(yáng)市中醫(yī)院，河南 洛陽(yáng) 471003；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450012；3.洛陽(yáng)市藥品檢驗(yàn)所，河南 洛陽(yáng) 471003

洛陽(yáng)市中醫(yī)院制劑室始建于1982年，2000年初具規(guī)模，并于2016年進(jìn)行擴(kuò)充改建，共有制劑批準(zhǔn)文號(hào)42個(gè)，以水丸（濃縮丸）為主，涵蓋了口服液、糖漿劑、散劑、顆粒劑等多個(gè)劑型，在臨床應(yīng)用廣泛。目前，本院已對(duì)部分制劑進(jìn)行了關(guān)于制備工藝、有效性、藥理毒理等方面的相關(guān)研究［1-5］。參附舒絡(luò)丸具有活血化瘀、舒筋活絡(luò)、散結(jié)止痢的功效，用于治療氣滯血瘀、脈絡(luò)痹阻、各種骨關(guān)節(jié)疼痛、頸肩腰腿疼痛、腰肌勞損等疾病，在骨科、疼痛科應(yīng)用廣泛，是建設(shè)本院制劑室之初的老方劑，制備工藝簡(jiǎn)便，療效確切，但一直未對(duì)其制備工藝、質(zhì)量控制、藥理毒理進(jìn)行研究，本研究首先須明確其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

參附舒絡(luò)丸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)有外觀性狀檢查，鑒別項(xiàng)包括了薄層色譜，檢查項(xiàng)包括了水分、重量差異、裝量差異、溶散時(shí)限、微生物限度檢查等項(xiàng)目，尤其關(guān)注了烏頭堿的含量檢查，采用了薄層色譜限量檢查的方法，檢測(cè)項(xiàng)目完善，較全面的反映了參附舒絡(luò)丸的質(zhì)量，但也有不足之處，比如烏頭堿含量測(cè)定的方法、藥理毒理的相關(guān)研究等還不太全面。

中藥管理中的毒性藥品一般指1988年11月頒布的《醫(yī)療用毒性藥品管理辦法》中規(guī)定的28種毒性中藥飲片［6-9］，28種毒性中藥飲片多為生品，其實(shí)臨床中應(yīng)用的多為炮制品，炮制品可以不按照此規(guī)定管理，但考慮到雖為炮制品，毒性大大減弱，但仍含有毒性成分，具有一定毒性，尤其是醫(yī)院制劑品種中含有含毒性成分的飲片時(shí)，更是缺乏相關(guān)毒理學(xué)研究［10-13］，考慮到臨床上服藥劑量、服用時(shí)長(zhǎng)、患者年齡、機(jī)體體質(zhì)等因素均可能影響到毒性的發(fā)揮，因此，有必要關(guān)注此類制劑的安全性。

參附舒絡(luò)丸處方中含有制川烏、制草烏兩種含毒性成分的中藥飲片，不存在中藥十八反、十九畏等相關(guān)禁忌情況。制川烏、制草烏化學(xué)成分為雙酯型二萜類生物堿，包括烏頭堿、次烏頭堿、杰斯烏頭堿、異翠雀堿等，是烏頭中的主要毒性成分［14-17］。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，制川烏、制草烏的毒性主要表現(xiàn)在消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等，如流涎、惡心、嘔吐、腹瀉、呼吸困難、手足抽搐、大小便失禁，抽步態(tài)蹣跚、角弓反張，甚至心臟衰竭與呼吸抑制導(dǎo)致死亡［18-21］。本研究為充分暴露潛在的不良反應(yīng)，采用灌胃給藥的方式考察了參附舒絡(luò)丸單次給藥的急性毒性反應(yīng)。

1 材料

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)ICR小鼠60只，體質(zhì)量17～22 g，雌雄各半，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011。動(dòng)物試驗(yàn)流程及相關(guān)操作遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2 藥物與試劑參附舒絡(luò)丸（洛陽(yáng)市中醫(yī)院澗西院區(qū)制劑室，批號(hào)：20200212）；乙醚、乙酸乙酯、苯、乙酸、無(wú)水乙醇、正己烷、氨、NaOH、碘化鉍鉀（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：190125、20191101、20191008、20191005、20191106、20191101、20191005、20190907、20180608）；丹參對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品鑒定研究所，貨號(hào)：110766-201520）硅膠G薄層板（青島海洋化工有限公司，規(guī)格：100 mm×100 mm批號(hào)：20190526）。

1.3 儀器超聲清洗儀（寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司，型號(hào)：KS-500D）；電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（上海市崇明實(shí)驗(yàn)儀器廠，型號(hào)：101-1型）；分析天平（上海上平儀器有限公司，型號(hào)：FA1004）購(gòu)自；崩解時(shí)限儀（天津廣譜光學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：BJ-1）；生物安全柜（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：BSC-1100IIB2-X）；醫(yī)用潔凈工作臺(tái)（濟(jì)南新貝西生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：BBS-SDC）；細(xì)菌培養(yǎng)箱（濟(jì)南新貝西生物技術(shù)有限公司；型號(hào)：SPX-150）；霉菌培養(yǎng)箱（濟(jì)南新貝西生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：MJ-160）。

2 方法

2.1 質(zhì)量控制

2.1.1 性狀與鑒別本品為棕色至棕褐色水丸，味苦。取本品5 g，粉碎成粉末，加入乙醚20 mL，超聲處理5 min，過(guò)濾，濾液干燥，殘?jiān)尤胍宜嵋阴? mL溶解，作為試驗(yàn)溶液。此外，以丹參為對(duì)照藥材，采用相同方法制備對(duì)照藥材溶液。根據(jù)測(cè)試的薄層色譜法（《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版通則0502），吸取5μL的上述兩種溶液，并把它們點(diǎn)在同一硅膠G薄層板，分別以苯-醋酸（benzene-benzene-ethyl 19：1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，干燥。

2.1.2 質(zhì)量檢查烏頭堿 取本品30 g，研碎，置具塞錐形瓶中，加氨試液10mL，拌勻，加乙醚150mL，振搖1 h，放置1～2 h，過(guò)濾，濾液蒸干，加無(wú)水乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇至刻度，搖勻，制成供試品應(yīng)用。另外，取烏頭堿對(duì)照品，加入無(wú)水乙醇，制成2.5 g·L-1的參比溶液。按薄層色譜法檢驗(yàn)《中華人民共和國(guó)藥典》，取試驗(yàn)液20μL和對(duì)照液4μL，點(diǎn)在0.5%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，展開(kāi)，以正己烷-乙酸乙酯（1∶1）為展開(kāi)劑，取出干燥，噴以稀碘化鉍鉀試液。

2.2 急性毒性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 藥物制備制備方法：按照參附舒絡(luò)丸復(fù)方比例，取牛膝、生地黃、黃芪、當(dāng)歸、桑寄生、秦艽等，加水煎煮3次。第1次2 h，第2次1 h，第3次40 min，合并藥液，濃縮至相對(duì)密度約為1.20。余藥材烘干粉碎成細(xì)粉，以濃縮液為賦形劑，混合烘干，粉碎成一定細(xì)度，并過(guò)篩，混合均勻后泛制成丸，打光，即得1 000 g水丸。

2.2.2 分組及給藥將60只ICR小鼠按體質(zhì)量和性別隨機(jī)分為6組，分別為參附舒絡(luò)丸組（8 g·kg-1）、參附舒絡(luò)丸組（6.0 g·kg-1）、參附舒絡(luò)丸組（4.5 g·kg-1）、參附舒絡(luò)丸組（3.4 g·kg-1）、參附舒絡(luò)丸組（2.6 g·kg-1）、參附舒絡(luò)丸組（2.0 g·kg-1），每 組 各10只。各 組 均 給 予20 mL·kg-1灌胃，給藥前禁食14～16 h，給藥后觀察6 h，每日觀察1次，共14 d。

2.2.3 一般狀況觀察包括外觀、飲食、分泌物、排泄物、行為等。記錄以及所有動(dòng)物中毒反應(yīng)的開(kāi)始時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、嚴(yán)重程度、可逆性，以及中毒癥狀、死亡。

2.2.4 體質(zhì)量測(cè)量給藥后1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、11 d和14 d分別測(cè)量動(dòng)物的體質(zhì)量，包括垂死或死亡的動(dòng)物。

2.2.5 臟器檢查瀕臨死亡的動(dòng)物或中毒死亡的動(dòng)物應(yīng)及時(shí)進(jìn)行解剖，在觀察期結(jié)束后的其他動(dòng)物，經(jīng)頸椎脫臼處理進(jìn)行大體解剖。當(dāng)大體解剖顯示器官顏色、體積、質(zhì)地等變化時(shí)，用質(zhì)量濃度10%中性福爾馬林固定異常器官，并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。一般解剖學(xué)檢查器官包括食道、氣管、胸腺、腎上腺、胰腺、膀胱、前列腺、睪丸（包括附睪）、子宮、卵巢、心臟、肺、肝、脾、腎、腦、淋巴結(jié)、胃、腸。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 質(zhì)量控制結(jié)果質(zhì)量控制的各項(xiàng)指標(biāo)均符合《中華人民共和國(guó)藥典》的標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 小鼠的一般狀況 參附舒絡(luò)丸組（8 g·kg-1）有7只在給藥30 min后先后出現(xiàn)呼吸加快或急促、活動(dòng)減少、低伏、俯臥不動(dòng)、步履不穩(wěn)、翻正反射消失、抽搐、尿失禁、呼吸減慢或加深中的多種狀態(tài)，先后在給藥后的5 h內(nèi)死亡。3只出現(xiàn)俯臥不動(dòng)或活動(dòng)減少的狀態(tài)，但3 h內(nèi)都基本恢復(fù)，后續(xù)一般狀態(tài)觀察中無(wú)明顯異常。參附舒絡(luò)丸組（6 g·kg-1）有4只在給藥65 min后先后出現(xiàn)活動(dòng)減少、步履不穩(wěn)、排稀便、低伏、俯臥不動(dòng)、抽搐、尿失禁、翻正反射消失中的多種狀態(tài)，先后在給藥后的7 h內(nèi)死亡。有2只在給藥60 min后先后出現(xiàn)活動(dòng)減少，但3 h內(nèi)基本恢復(fù)，后續(xù)一般狀態(tài)觀察中無(wú)明顯異常。參附舒絡(luò)丸組（4.5 g·kg-1）有1只在給藥82 min后出現(xiàn)活動(dòng)減少、步履不穩(wěn)、低伏、俯臥不動(dòng)、呼吸減慢或加深、排稀便、尿失禁、翻正反射消失中的多種狀態(tài)，在給藥后7 h內(nèi)死亡。有1只在給藥35 min后，出現(xiàn)活動(dòng)力減弱，但6 h內(nèi)基本恢復(fù)。有2只給藥3 h后出現(xiàn)排稀便，但給藥后第2天至第14天一般狀態(tài)觀察無(wú)明顯異常。參附舒絡(luò)丸組（3.4 g·kg-1）有4只在給藥后1 h內(nèi)先后發(fā)生活動(dòng)減少的狀態(tài)，但在3 h內(nèi)基本恢復(fù)，后續(xù)一般狀態(tài)觀察中無(wú)明顯異常。參附舒絡(luò)丸組（2.6 g·kg-1）在給藥當(dāng)天以及給藥后的第2天至第14天一般狀態(tài)觀察無(wú)明顯異常。參附舒絡(luò)丸組（2.0 g·kg-1）在給藥當(dāng)天以及給藥后的第2天至第14天一般狀態(tài)觀察無(wú)明顯異常。參附舒絡(luò)丸組（8.0 g·kg-1）可致7只死亡，參附舒絡(luò)丸組（6.0 g·kg-1）可致4只死亡；參附舒絡(luò)丸組（4.5 g·kg-1）可致1只死亡。參附舒絡(luò)丸組（3.4 g·kg-1、2.6 g·kg-1、2.0 g·kg-1）不會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物死亡。據(jù)此計(jì)算出參附舒絡(luò)丸的半數(shù)致死量為6.7 g·kg-1。

3.3 各組小鼠體質(zhì)量比較參附舒絡(luò)丸組（8.0 g·kg-1）中有3只小鼠（雌性2只、雄性1只）觀察期14 d內(nèi)體質(zhì)量保持增長(zhǎng)。參附舒絡(luò)丸組（6.0 g·kg-1）有6只小鼠（雌性3只、雄性3只）在觀察期14 d內(nèi)體質(zhì)量均保持增長(zhǎng)。參附舒絡(luò)丸組（4.5 g·kg-1）有9只小鼠（雌性5只、雄性4只）在觀察期14天內(nèi)體質(zhì)量均保持增長(zhǎng)。其余各組小鼠在觀察期14 d內(nèi)體質(zhì)量均保持增長(zhǎng)，見(jiàn)表1、表2。

表1 ICR雄性小鼠體質(zhì)量變化情況 （±s，g）

時(shí)間 參附舒絡(luò)丸組（8.0 g·kg-1）參附舒絡(luò)丸組（6.0 g·kg-1）參附舒絡(luò)丸組（4.5 g·kg-1）參附舒絡(luò)丸組（3.4 g·kg-1）參附舒絡(luò)丸組（2.6 g·kg-1）參附舒絡(luò)丸組（2.0 g·kg-1）第1天 21.0±0.0 20.5±0.7 21.2±0.8 20.8±1.1 21.3±0.8 21.6±0.9第2天 23.1±0.0 22.6±0.5 23.2±0.6 23.7±0.7 24.4±0.7 24.8±0.9第3天 24.1±0.0 24.3±0.8 24.8±0.8 25.8±0.6 26.8±0.6 25.8±0.8第5天 26.8±0.0 25.9±0.4 26.0±1.1 27.5±0.6 28.3±0.9 28.6±1.2第7天 28.6±0.0 28.9±1.0 29.1±0.9 28.7±0.8 30.4±0.7 29.7±1.2第11天 30.8±0.0 29.9±1.2 31.6±0.8 31.9±0.9 32.4±0.5 31.9±0.8第14天 31.7±0.0 31.6±0.9 32.4±1.0 33.6±1.3 33.1±0.5 32.8±0.9總增重 10.7±0.0 11.2±0.8 9.1±0.8 11.2±1.2 12.8±0.8 13.1±1.0

表2 ICR雌性小鼠體質(zhì)量變化情況 （±s，g）

時(shí)間 參附舒絡(luò)丸組（8.0 g·kg-1）參附舒絡(luò)丸組（6.0 g·kg-1）參附舒絡(luò)丸組（4.5 g·kg-1）參附舒絡(luò)丸組（3.4 g·kg-1）參附舒絡(luò)丸組（2.6 g·kg-1）參附舒絡(luò)丸組（2.0 g·kg-1）第1天 19.8±0.8 18.4±0.7 17.8±0.9 18.6±0.7 19.2±0.9 20.1±1.0第2天 21.5±0.8 20.4±0.7 19.7±0.1 20.0±0.6 21.2±1.2 21.6±0.7第3天 22.6±1.0 21.9±0.4 21.7±0.7 22.1±1.0 22.9±1.4 23.1±1.0第5天 23.7±0.4 24.1±0.1 23.5±0.5 24.3±1.0 24.1±0.9 24.7±1.2第7天 25.6±1.3 25.8±0.0 25.1±1.0 26.2±1.1 25.3±0.7 26.0±0.8第11天 27.3±0.8 27.1±0.7 26.1±1.0 27.8±0.8 26.8±0.9 27.4±1.3第14天 28.1±0.4 27.9±0.5 26.9±1.2 29.6±1.0 27.8±1.0 28.3±0.8總增重 8.3±0.9 9.2±0.6 8.9±0.9 9.1±1.1 8.7±1.0 8.2±1.3

3.4 臟器檢查各組動(dòng)物大體解剖肉眼觀察均未見(jiàn)異常變化。

4 討論

參附舒絡(luò)丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)比較完善，但其中烏頭堿的含量測(cè)定采用薄層色譜法，該方法比較粗略，并不夠精確。烏頭堿的含量測(cè)定方法很多，主要有高效液相色譜法、反相高效液相色譜法、液相-質(zhì)譜聯(lián)用方法、雙波長(zhǎng)薄層掃描法、高效毛細(xì)管電泳法和分光光度法［22-25］，質(zhì)譜聯(lián)用的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描方法在測(cè)定含烏頭類生物堿時(shí)，具有較強(qiáng)的靈敏性和專屬性，也適用于基質(zhì)成分比較復(fù)雜的情況。薄層色譜法因設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，且其具備分離與定量的雙方面作用，在醫(yī)院制劑定性及含量測(cè)定中應(yīng)用廣泛，其他色譜法受醫(yī)院實(shí)驗(yàn)條件的限制，在現(xiàn)在批準(zhǔn)的醫(yī)院制劑室中應(yīng)用較少。分光光度法設(shè)備簡(jiǎn)單，可以嘗試應(yīng)用。高效液相色譜法是常用含量測(cè)定方法，高效液相色譜法靈敏度、準(zhǔn)確度、自動(dòng)化程度高，且重現(xiàn)性好，也是廣泛應(yīng)用的方法，下一步應(yīng)探索高效液相色譜法的在院內(nèi)制劑生產(chǎn)中的應(yīng)用，這樣能更準(zhǔn)確地反映有效成分、毒性成分的含量，這樣有助于提高院內(nèi)制劑的整體標(biāo)準(zhǔn)，并為進(jìn)一步提高藥品質(zhì)量提供保障。

參附舒絡(luò)丸在臨床使用中并未發(fā)現(xiàn)有不良反應(yīng)。本研究首選了含毒性中藥飲片的方劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，初步考察了本類制劑的急性毒性反應(yīng)，為院內(nèi)該類制劑的急性毒性試驗(yàn)提供了方法學(xué)上的探索。參附舒絡(luò)丸中含有的川烏、草烏水煎液灌胃給藥，產(chǎn)生毒性的主要靶器官為心、肝、脾、肺、腎等，對(duì)小鼠消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等均具有不同程度的毒性，甚至出現(xiàn)神志不清、昏迷，循環(huán)系統(tǒng)衰竭死亡［26］。本研究確定了該制劑的半數(shù)致死量，相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，毒性反應(yīng)與劑量成正相關(guān)。