黃佳南， 張媛莉

膿毒癥是由多種細(xì)菌等病原體感染入侵人體而引起各種生化、生理及病理異常的綜合癥，其發(fā)病率和病死率較高[1]。有研究[2]發(fā)現(xiàn)，血小板胞外囊泡在膿毒癥中發(fā)揮不可替代的作用，被建議作為膿毒癥的生物標(biāo)志物。本綜述將從血小板胞外囊泡參與膿毒癥的炎癥反應(yīng)、凝血功能障礙、心肌損傷等多方面進(jìn)行闡述，旨在進(jìn)一步明確血小板胞外囊泡在膿毒癥的作用機(jī)制，并為膿毒癥的治療提供一定的參考和依據(jù)。

1 血小板與膿毒癥

在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中，血小板扮演著重要的角色。隨著膿毒癥促炎及促凝機(jī)制的發(fā)生，血小板是最先反應(yīng)的細(xì)胞之一[2]。血小板是由巨核細(xì)胞脫落形成的無(wú)核細(xì)胞碎片，作為最小的血細(xì)胞在健康個(gè)體的數(shù)量為(100～300)×109/L。血小板膜上表達(dá)著與炎癥、免疫相關(guān)的分子，包括補(bǔ)體受體、黏附分子、各種受體及與其他細(xì)胞相互接觸所必需的介質(zhì)，這些結(jié)構(gòu)決定了其重要功能[3]。在從巨核細(xì)胞脫落后，血小板在循環(huán)中存在5～7天，主要作為止血和血栓形成的調(diào)節(jié)劑。在正常情況下，血管損傷后，血小板在血液中被激活，黏附于內(nèi)皮下暴露的細(xì)胞外基質(zhì)上，形成血小板血栓，最終與纖維蛋白等組成完整的血栓[4]。但目前關(guān)于血小板在膿毒癥中發(fā)揮的作用仍有異議，有部分研究[5-6]認(rèn)為，血小板會(huì)加重炎癥反應(yīng)。也有研究[7-8]表明，血小板在膿毒癥中能夠抑制炎癥的發(fā)生、發(fā)展。還有大量研究[9-10]證實(shí)，血小板胞外囊泡能夠通過(guò)不同機(jī)制參與到對(duì)固有免疫的調(diào)控中，進(jìn)一步控制膿毒癥炎癥的發(fā)生。

2 血小板胞外囊泡

細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles)是從細(xì)胞質(zhì)膜(微囊泡或微粒)或細(xì)胞內(nèi)體區(qū)室(外泌體)釋放的膜囊泡[11]。由于文獻(xiàn)中對(duì)術(shù)語(yǔ)的使用不一致，且難以證明特定的生物發(fā)生途徑，現(xiàn)今細(xì)胞外囊泡是一個(gè)總稱(chēng)，涵蓋細(xì)胞釋放的各種亞型膜結(jié)構(gòu)，包括微囊泡、微粒、外泌體、腫瘤小體、凋亡小體和許多其他名稱(chēng)[12]。血小板胞外囊泡含直徑30 nm 至1 μm 的球形細(xì)胞外囊泡、1～5 μm長(zhǎng)的管狀細(xì)胞外囊泡，主要存在于外周血液中，在血小板活化、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡時(shí)其數(shù)量增加，但因刺激因素的不同，所釋放的血小板胞外囊泡的類(lèi)型會(huì)有所差異[13]。血小板胞外囊泡充當(dāng)多種功能分子，包括信號(hào)介質(zhì)、生長(zhǎng)因子、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等，它們介導(dǎo)細(xì)胞間合作、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和修復(fù)等[14]。

3 血小板胞外囊泡與膿毒癥

3.1血小板胞外囊泡參與膿毒癥的炎癥反應(yīng)

在膿毒癥中，活化的血小板能夠誘導(dǎo)對(duì)感染的急性期反應(yīng)[6]。血小板的細(xì)胞質(zhì)中含有致密顆粒、α顆粒和溶酶體。致密顆粒含有鈣離子(Ca2+)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)等。而α顆粒則含有凝血酶、血管性血友病因子(VWF)、P選擇素(P-selectin)、生長(zhǎng)因子、趨化因子，且α顆粒的形成與人類(lèi)的疾病狀況相關(guān)[15-16]。這些顆粒、信號(hào)分子、蛋白質(zhì)部分被組裝包裹形成血小板胞外囊泡。在活化激動(dòng)劑(如ADP、凝血酶、血栓素A2等)通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體或其他受體結(jié)合時(shí)，通過(guò)Ca2+/蛋白激酶C(PKC)通路磷酸化可溶性N-乙基馬來(lái)酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(SNARE)后，血小板分泌胞外囊泡來(lái)釋放各種分子，進(jìn)一步促進(jìn)血小板活化、黏附、聚集和分泌，形成瀑布效應(yīng)，放大炎癥反應(yīng)[17]。而在膿毒癥中脂多糖(LPS)通過(guò)與血小板上Toll樣受體(TLR)4結(jié)合后，激活蛋白激酶B(Akt)/c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路，促進(jìn)血小板胞外囊泡的分泌上升，使釋放的白細(xì)胞介素(IL)-1β等炎癥因子增加[18]。此外，膿毒癥中葡萄球菌超抗原樣蛋白5(SSL5)能夠誘導(dǎo)血小板胞外囊泡通過(guò)單核細(xì)胞中CD40/腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路激活單核細(xì)胞表達(dá)和釋放炎癥介質(zhì)，包括IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)，且呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性[19]。

與此同時(shí)，這些血小板胞外囊泡也參與到與其他炎癥細(xì)胞的調(diào)節(jié)中，如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的募集，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞活化、分泌和黏附等[20]。Sung等[21]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外囊泡通過(guò)C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族5成員A(CLEC5A)/TLR2途徑誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)形成和促炎細(xì)胞因子釋放，增強(qiáng)登革熱病毒誘導(dǎo)疾病的致死率。Chimen等[22]從血小板衍生的細(xì)胞外囊泡中提取出血小板膜糖蛋白Ibα(GPIbα)，并發(fā)現(xiàn)GPIbα支持單核細(xì)胞在全身炎癥中的募集。French等[23]發(fā)現(xiàn)，血小板衍生的細(xì)胞外囊泡在炎癥期間浸潤(rùn)并改變骨髓，從而參與到免疫反應(yīng)中。值得一提的是，血小板胞外囊泡在活化和凋亡時(shí)從血小板中釋放出具有特異性的膜表位，這些分子在膿毒癥中可以作為個(gè)體化治療標(biāo)志物[24]。

3.2血小板胞外囊泡參與膿毒癥的凝血功能障礙

由于大量炎癥細(xì)胞和炎癥因子激活凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致大量血小板被消耗，血栓形成，最終形成凝血功能障礙[25-26]。血小板胞外囊泡是凝血系統(tǒng)調(diào)節(jié)的重要組成部分，具有促凝的特性[27]。血小板胞外囊泡的凝血能力大約是單獨(dú)血小板的50～100倍，其凝血能力的增加是由于翻轉(zhuǎn)酶在活化狀態(tài)下導(dǎo)致血小板胞外囊泡表面上的磷脂酰絲氨酸表面積增加。Reddy等[28]使用成像流式細(xì)胞儀技術(shù)觀(guān)察到在活化狀態(tài)下具有胞外囊泡的血小板表面上暴露出大面積磷脂酰絲氨酸。Meijden等[29]發(fā)現(xiàn)，來(lái)自血小板和紅細(xì)胞的胞外囊泡不僅通過(guò)暴露磷脂酰絲氨酸促進(jìn)凝血，而且還以凝血因子X(jué)Ⅱ(FXⅡ)依賴(lài)性方式獨(dú)立于組織因子(TF)，啟動(dòng)凝血酶生成。Lopez等[30]使用大鼠失控出血模型來(lái)評(píng)估血小板胞外囊泡的促凝效果，發(fā)現(xiàn)凝血酶生成速率和數(shù)量以及整體凝塊強(qiáng)度與血小板胞外囊泡的劑量存在依賴(lài)性增加的關(guān)系，且出現(xiàn)血壓上升、乳酸水平降低、堿過(guò)量下降和血漿蛋白濃度增加等結(jié)果。

此外，血小板胞外囊泡的促凝作用不僅涉及促凝表面積的增殖，而且與損傷部位不同細(xì)胞參與者的交聯(lián)和轉(zhuǎn)移其他細(xì)胞類(lèi)型的激活信號(hào)相關(guān)[31]。Gasecka等[32]通過(guò)使用P2Y12拮抗劑及P2Y1拮抗劑，抑制P2Y1和P2Y12受體，導(dǎo)致血小板聚集減少，并使血小板胞外囊泡的釋放量下降。而血小板活化后，在血小板表面表達(dá)P選擇素，并與免疫循環(huán)細(xì)胞表面所表達(dá)的P選擇素糖蛋白1(PSGL-1)相結(jié)合，從而促使單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞向活化的內(nèi)皮細(xì)胞募集、滾動(dòng)及黏附，促進(jìn)血栓形成[33]。Ssmajo等[34]發(fā)現(xiàn)，活化蛋白質(zhì)S和凝血因子V是抑制因子Ⅷa的協(xié)同輔助因子，而活化的蛋白C系統(tǒng)具有抵抗血小板胞外囊泡促凝能力的功能。血小板胞外囊泡的促凝功能加重了膿毒癥創(chuàng)傷，甚至導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)的發(fā)生，這是膿毒癥最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。Ohuchi等[35]收集患者的基礎(chǔ)臨床資料，分析血小板胞外囊泡的分泌水平與住院病死率或DIC之間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)血小板胞外囊泡與DIC具有相關(guān)性，但與住院病死率無(wú)關(guān)。Wang等[36]通過(guò)構(gòu)建盲腸結(jié)扎穿刺法(CLP)膿毒癥小鼠模型，發(fā)現(xiàn)血小板胞外囊泡是磷脂酰絲氨酸暴露和激活內(nèi)源性和外源性凝血途徑的總凝血酶(TG)的有效誘導(dǎo)劑，能夠調(diào)節(jié)膿毒癥凝血酶的產(chǎn)生，加重凝血功能障礙，促進(jìn)DIC的發(fā)生。

3.3血小板胞外囊泡參與膿毒癥的NETs形成 NEFs是一種基于染色質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可釋放到細(xì)胞外環(huán)境中以幫助清除病原體，但它們也與導(dǎo)致組織損傷、自身免疫增強(qiáng)和血管內(nèi)血栓形成的過(guò)度炎癥有關(guān)[37]。在膿毒癥期間，LPS能夠通過(guò)與血小板表面表達(dá)的TLR4相結(jié)合，以誘導(dǎo)血小板與中性粒細(xì)胞黏附，從而促使NEFs的形成[38]。在膿毒癥期間，NEFs通過(guò)提供高濃度的抗菌分子對(duì)細(xì)菌的隔離和殺滅，從而介導(dǎo)宿主的免疫防御[39]。盡管參與人血小板介導(dǎo)的NETs生成的介質(zhì)和分子途徑仍不明確，但仍有證據(jù)表明，血小板胞外囊泡參與到膿毒癥中的NETs形成。Mcvey等[40]假設(shè)來(lái)自于血小板和神經(jīng)酰胺依賴(lài)性的細(xì)胞外囊泡形成誘導(dǎo)了輸血相關(guān)性急性肺損傷，且列舉了小鼠血小板儲(chǔ)存過(guò)程中形成的細(xì)胞外囊泡，并將其應(yīng)用于小鼠輸血相關(guān)性急性肺損傷模型和體外內(nèi)皮屏障評(píng)估，以此證明血小板細(xì)胞外囊泡通過(guò)鞘脂變阻器失衡介導(dǎo)輸血相關(guān)的急性肺損傷。Jiao等[41]通過(guò)將健康對(duì)照者和感染性休克患者的血漿分離獲取外泌體，再將獲取的外泌體、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)及LPS刺激人血小板后獲取的上清液與多形核中性粒細(xì)胞(PMN)共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)外泌體高遷移率組蛋白1(HMGB1)和(或)微小RNA(miR)-15b-5p和miR-378a-3p，通過(guò)Akt/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)自噬途徑誘導(dǎo)NETs形成，結(jié)果表明，IκB激酶(IKK)控制感染性休克中血小板衍生的外泌體分泌。

3.4血小板胞外囊泡參與膿毒癥的心肌損傷

膿毒癥心肌病是膿毒癥患者常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，但膿毒癥心肌病的定義仍有異議[42]。膿毒癥產(chǎn)生的活性氧(ROS)將激活血小板，釋放含有高水平煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的外泌體，這些外泌體增加內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的一氧化氮(NO)與ROS，這將導(dǎo)致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，促使內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Monteiro等[43]發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥中血小板通過(guò)ROS激活后，將含有高濃度的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的外泌體在心臟血管中釋放，而這些外泌體被內(nèi)皮細(xì)胞活化，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞死亡和心臟功能障礙。此外，Azevedo等[44]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，來(lái)自膿毒癥患者的循環(huán)血小板衍生外泌體在離體心臟和乳頭肌制劑中誘導(dǎo)心肌功能障礙，并且這種現(xiàn)象因LPS刺激而增強(qiáng)。

另一方面，血小板外泌體中含有miR-223，能夠下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞間黏附分子1(ICAM1)、轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、信號(hào)素3A(Semaphorin)及心肌細(xì)胞中的TNF-α、IL-6和IL-1β，從而減少內(nèi)皮細(xì)胞損傷和保護(hù)心肌。Li等[45]通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)膿毒癥患者的miR-132和miR-223，發(fā)現(xiàn)miR-132聯(lián)合miR-223對(duì)膿毒癥誘發(fā)的心肌病預(yù)后的敏感性及特異性分別為85.96%和65.22%，miR-132聯(lián)合miR-223可用于心肌病的早期診斷和預(yù)后評(píng)估。Wang等[46]通過(guò)盲腸結(jié)扎穿孔構(gòu)建膿毒癥小鼠模型，發(fā)現(xiàn)相較于miR-233-KO的小鼠，野生型小鼠的胞外囊泡具有更高水平的miR-233，可將其傳遞至心肌細(xì)胞，導(dǎo)致信號(hào)素3A和STAT3下調(diào)，減少炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞死亡。

綜上所述，血小板來(lái)源的胞外囊泡在膿毒癥中發(fā)揮著重要作用，不僅能夠調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和凝血功能障礙，而且可以協(xié)助NETs的形成，甚至可以減輕膿毒癥心肌病損傷，是具有一定潛力的膿毒癥治療靶點(diǎn)[47-48]。當(dāng)然膿毒癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，僅針對(duì)血小板胞外囊泡治療膿毒癥無(wú)法達(dá)到最佳療效，未來(lái)還需探索更多的治療膿毒癥的新方案，更好地服務(wù)于人民大眾。