顧德芳，南 勇

（上海交通大學醫(yī)學院附屬松江醫(yī)院<籌>急診危重病科，上海 201600）

感染性肺炎（infectious pneumonia）是由各種原因感染導致的肺部炎癥反應，部分患者可能因病情的加重、不及時就診、營養(yǎng)不良、治療中癥狀控制不佳、機體抵抗力下降等原因進一步發(fā)展為重癥肺炎[1]。重癥肺炎（severe pneumonia）具有治療難度高、病死率高的特點，給患者及社會帶來了極大的經(jīng)濟負擔及醫(yī)療負擔[2]。因此，早期診斷肺炎、早期制定合理的治療方案、及時評價重癥肺炎患者的預后，對于延緩肺炎的發(fā)展、降低相應病死率具有重要臨床意義。細胞外囊泡（extracellular vesicles）是由于各種生理、病理和/或外部刺激后，從細胞膜或細胞內(nèi)釋放出來的一組異質(zhì)性囊泡，是細胞間通信的重要介質(zhì)和細胞行為的調(diào)節(jié)器，其內(nèi)含有多種類型的RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和細胞器，通過多種途徑調(diào)節(jié)受體細胞的多種生物過程[3]。研究表明，細胞外囊泡具有作為某些疾病診斷和疾病預后的新型生物標志物的潛力[4]，而血漿細胞外囊泡和炎癥發(fā)展有密切關系，特別是炎癥與血液中細胞外囊泡水平的升高相關[5]。因此，細胞外囊泡在炎癥的診斷、預后和治療有望成為一個新的研究領域。本文現(xiàn)對細胞外囊泡的分類與作用、分離提取與鑒定、與重癥肺炎的相互關系進行綜述，旨在為重癥肺炎敏感診斷方法及有效治療措施提供參考。

1 細胞外囊泡的分類與作用

細胞外囊泡是由磷脂雙分子層組成的球形無核微粒，其內(nèi)包含多種mRNA、miRNA、蛋白質(zhì)、受體、DNA 和生物因子等[6]。根據(jù)細胞外囊泡的顆粒大小將其分為三類：外泌體（Exo）、微囊泡（MV）和凋亡小體（AB）。①外泌體（30～100 nm）是粒徑大小最小的亞群，富含mRNA、miRNA、DNA 和蛋白質(zhì)[7]；②微囊泡（100～1000 nm）被稱為脫落的囊泡、外小體、微?；蚣{米顆粒，是第2 大的囊泡，其表達豐富的膽固醇、磷脂酰絲氨酸、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺和細胞表面特異性分子[8]；③凋亡小體（100～5000 nm）的粒徑最大，是在細胞凋亡過程中由質(zhì)膜起泡形成的，包含片段DNA、非編碼RNA、組蛋白和細胞器等[9]。體細胞釋放細胞外囊泡后通過與靶細胞相互作用后將其特定內(nèi)容物作用到靶細胞，對靶細胞進行相應的生物調(diào)節(jié)。多種細胞來源的細胞外囊泡通常存在于血液、腦脊液、尿液、滑液、胸腔積液、精液、唾液和母乳等[10]。細胞外囊泡通過表面受體-配體相互作用、直接膜融合或細胞內(nèi)吞等不同方式作用于靶細胞，這些作用可直接刺激靶細胞或轉(zhuǎn)移囊泡內(nèi)各種信息分子。

2 細胞外囊泡的分離提取與鑒定

細胞外囊泡的分離提取方法主要是超速離心法、密度梯度離心法、過濾和色譜法[11]。目前提取細胞外囊泡的首選方法是連續(xù)超速離心法，該方法方便、廉價，并且能夠處理大量樣品。細胞外囊泡的鑒定方式為：流式細胞術、酶聯(lián)免疫吸附法、電子顯微鏡及納米顆粒跟蹤分析（NTA）等方法[12]。細胞外囊泡的鑒定最常用的方法是流式細胞術，其可檢測囊泡的顆粒大小、濃度等指標。然而，熒光流式細胞術可根據(jù)細胞外囊泡表面抗原鑒別細胞外囊泡的細胞來源。電子顯微鏡主要用于評估細胞外囊泡的粒徑大小、形態(tài)和表面特異性標記物。

3 細胞外囊泡在肺炎中的機制

3.1 促炎作用 研究表明[13]，初始的內(nèi)皮損傷可誘導肺泡內(nèi)皮細胞釋放細胞外囊泡，暴露于感染性刺激后進而啟動肺部嚴重的炎癥反應。肺泡上皮細胞分泌的細胞外囊泡的濃度可隨著炎癥損傷增強而增加，細胞外囊泡通過巨噬細胞的活化來誘導或加重肺炎進一步的發(fā)生發(fā)展[14]。另有研究表明[15]，氣管內(nèi)脂多糖可誘導肺泡巨噬細胞釋放細胞外囊泡進入損傷的肺泡，隨后觸發(fā)肺泡上皮細胞和中性粒細胞釋放相應的細胞外囊泡。在急性呼吸窘迫綜合征模型中，內(nèi)皮細胞分泌的細胞外囊泡可以增加肺部中性粒細胞的募集，從而導致肺損傷的嚴重程度進一步加重[16]。細胞外囊泡內(nèi)部特殊信息分子起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌感染的小鼠的支氣管肺泡灌洗液中，巨噬細胞來源的細胞外囊泡的miRNA-223 和miRNA-142 表達上調(diào)，并與抑制巨噬細胞激活相關[17]。Pe?aloza HF 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，多種細菌均能促進肺泡巨噬細胞細胞外囊泡中IL-36γ 的分泌，進而導致甚至加重肺損傷。Zhang S 等[19]研究結(jié)果提示，內(nèi)皮細胞來源性細胞外囊泡還可以誘導肺泡中性粒細胞募集，增加TNF-α、IL-1β 和過氧化物酶等炎癥因子的產(chǎn)生。研究顯示，隨著社區(qū)獲得性肺炎的嚴重程度的增加，在患者血漿內(nèi)的細胞外囊泡表達的細胞間粘附分子-1（ICAM-1）、主要組織相容性復合體Ⅰ（MHCⅠ）和MHCⅡ逐漸下調(diào)[20]，細胞外囊泡可能是通過誘導免疫激活的降低進而導致肺炎的進一步發(fā)展[21]。

3.2 抗炎作用 在肺炎病程中，部分炎性細胞分泌的細胞外囊泡具有明顯抗炎作用。研究發(fā)現(xiàn)，白細胞或中性粒細胞釋放的細胞外囊泡可能對肺損傷具有保護作用。體外實驗研究發(fā)現(xiàn)[22]，利用攜帶α2-巨球蛋白的白細胞源性細胞外囊泡治療，結(jié)果提示其可減弱內(nèi)皮細胞的通透性、增強中性粒細胞的吞噬作用。Neudecker V 等[23]研究顯示，中性粒細胞分泌的細胞外囊泡可能對巨噬細胞和肺泡上皮細胞有抗炎作用。Kolonics F 等[24]研究顯示，靜息的中性粒細胞釋放的細胞外囊泡對其他中性粒細胞具有抗炎作用。中性粒細胞分泌的細胞外囊泡含有miR-223，可能對巨噬細胞和肺泡上皮細胞有抗炎作用[25]。

3.3 抗病毒作用 在病毒性肺炎中，細胞外囊泡與病毒的相互作用影響肺炎的疾病病程。研究表明[26]，在流感病毒感染過程中，肺部上皮細胞分泌的細胞外囊泡主要起到滅活病毒顆粒的保護作用，這些細胞外囊泡攜帶流感受體α2,3 和α2,6 連接的唾液酸，通過捕獲病毒來發(fā)揮其抗病毒作用。此外，細胞外囊泡可以通過調(diào)節(jié)其目的細胞中抗病毒基因的表達來影響病毒的復制。研究發(fā)現(xiàn)[27]，在肺泡上皮細胞中過表miRNA-17-5p 可以通過下調(diào)抗病毒蛋白Mx1 來增強流感病毒的復制。流感病毒感染的小鼠肺泡上皮細胞分泌的細胞外囊泡攜帶細胞因子IL-36a，進而并促進小鼠肺泡上皮細胞和巨噬細胞分泌促炎細胞因子和趨化因子加重炎癥發(fā)展[28]。

4 細胞外囊泡在肺炎診療中的應用

4.1 診斷 目前，多種細胞源性細胞外囊泡在肺炎中的診斷應用得到不斷開發(fā)，并逐步應用于臨床。由于大部分的實體組織細胞分泌的細胞外囊泡最終會進入血液循環(huán)，因此很容易通過靜脈穿刺獲取相關樣本。Pe?aloza HF 等[18]在不同時間點分析了53 例嚴重的社區(qū)獲得性肺炎患者血清樣本，4 種miRNAs（miRNA-126，27a，146a 和155）可以區(qū)分患者后期是否發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征。Carpi S 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，血漿細胞外囊泡上表面蛋白的特征可以區(qū)分慢性獲得性肺炎患者曾經(jīng)是否患有急性加重或社區(qū)獲得性肺炎病史。細胞外囊泡中的1-磷酸鞘氨醇受體3 成為與急性肺損傷等炎癥性疾病嚴重程度相關和預后判定的潛在診斷標志物[30]。除血液樣本以外類型的樣本也可能是生物標志物的有用來源，吸入性胸腔積液含有細胞外囊泡，其內(nèi)的miRNA 含量可以提供有關積液的潛在病因信息，有助于區(qū)分積液源于肺炎、結(jié)核病或肺癌[29]。

4.2 治療 細胞外囊泡治療肺炎具有明顯效果，已有大量研究結(jié)果為后續(xù)應用于臨床治療提供有力依據(jù)。在各種細菌或病毒誘導的急性呼吸窘迫綜合征（嚴重的細菌性脂多糖誘導的肺炎或流感病毒感染）動物模型中，間充質(zhì)干細胞分泌的細胞外囊泡可減輕肺部炎癥和肺水腫的形成，具有較好治療效果[31]。機體宿主細胞通過將病毒顆粒與其分泌的細胞外囊泡暴露的唾液酸結(jié)合來降低流感的傳染性[26]。此外，細胞外囊泡還提供了藥物靶向遞送的良好性能[32]。Ma Q 等[33]研究了血小板源性細胞外囊泡作為藥物遞送載體的性能，將血小板來源的細胞外囊泡裝載TPCA-1（具有抗炎作用的IKK-1 和STAT3 抑制劑）進行藥物靶向，轉(zhuǎn)運到炎癥部位，具有較好的抑制肺部炎癥細胞的浸潤的效果。由于重癥肺炎期間機體向血漿中釋放細胞外囊泡的特點，通過抑制細胞外囊泡的生物學效應以期逆轉(zhuǎn)重癥肺炎的進展仍有待進一步研究。

5 總結(jié)與展望

細胞外囊泡在重癥肺炎的發(fā)生發(fā)展病程中發(fā)揮重要作用，由于其負載多種生物信息分子的載體特性及其通過抽血可采集的便利特點，使其成為了理想的生物標志物。細胞外囊泡作為生物標志物在診斷重癥肺炎和識別肺炎病因等方面具有重要作用。目前，針對細胞外囊泡或其內(nèi)在特定miRNA 治療肺炎/重癥肺炎的實驗研究已取得一定的成果。未來，細胞外囊泡在重癥肺炎領域的應用值得期待，將細胞外囊泡設計成特殊靶向藥物遞送系統(tǒng)到炎癥肺組織局部發(fā)揮作用，制備成疫苗預防呼吸道疾病及肺炎可能是未來研究熱點。此外，現(xiàn)有研究報道的細胞外囊泡的相關作用及機制多來自于動物模型或體外細胞為基礎的實驗研究，期待相關臨床研究的開展，以便更好地觀察細胞外囊泡的臨床應用潛能，為重癥肺炎的診治提供方向。