陳垚鑫， 鄧芝花， 錢進先

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension， PAH)是由多種已知或未知原因致肺血管重塑而引起的肺動脈壓異常升高的一種病理生理狀態(tài)，主要表現(xiàn)為血管內(nèi)皮完整性的喪失和細胞外基質(zhì)的積累，包括膠原蛋白沉積、血管平滑肌細胞的增殖和肥大，導致動脈中層肥厚、向心或偏心性內(nèi)膜增生和血管肌肉化，進而導致肺動脈進行性閉塞、肺動脈壓力持續(xù)升高，甚至發(fā)展為右心室功能障礙[1-2]。目前臨床治療藥物(包括前列環(huán)素、內(nèi)皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶5抑制劑等)主要是通過選擇性舒張肺動脈，降低肺動脈壓力，從而改善其臨床癥狀，但是在改善肺血管重塑方面的作用有限，PAH患者一年病死率仍高達15%。一些研究[3]已經(jīng)證實，間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells， MSCs)是一種不斷自我更新、分裂增殖，且具有多向分化潛能的細胞，能夠有效地降低PAH中的肺動脈壓力，改善右心功能。然而，MSCs不穩(wěn)定且定向分化能力較差，因此推測其主要通過旁分泌方式分泌生物因子發(fā)揮治療作用。外泌體則是MSCs與靶細胞間通訊交流的一種介質(zhì)。本文就MSCs源性外泌體的生物學特征，以及其在PAH中的作用及其潛在作用機制作一綜述。

1 MSCs與外泌體

1.1MSCs的作用 MSCs是一種能不斷自我更新、分裂增殖，且具有多向分化潛能的細胞。一方面，其干細胞的特性賦予其多種生物功能，如分化為各譜系細胞進而修復(fù)組織損傷、促進組織再生，調(diào)節(jié)炎癥及免疫系統(tǒng)等[1]；另一方面，MSCs是最容易獲取的干細胞，可以從骨髓、脂肪組織及臍帶血等多種途徑提取，因此，MSCs在各種疾病研究領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用[4-5]。然而，MSCs不穩(wěn)定，直接使用干細胞有潛在的免疫排斥或染色體變異及致瘤等可能[6]，且其定向至受損組織發(fā)揮作用的方式容易受多種環(huán)境的因素影響，作用效率不高，有很大的局限性。經(jīng)過大量研究[5]證實，MSCs培養(yǎng)上清或其成分可以介導MSCs的一些生物功能，它主要以旁分泌方式分泌生物因子去發(fā)揮作用的。

1.2外泌體的生物學特征

外泌體(Exosome， Exo)在20世紀80年代首次被發(fā)現(xiàn)，被定義為由脂質(zhì)雙分子層組成的具有“碟狀”形態(tài)的微小小泡，屬于細胞外囊泡的一種。細胞外囊泡是由多種細胞分泌的納米級囊泡，根據(jù)囊泡的大小和形成方式，分為外泌體(30～150 nm)及微囊泡(50～1000 nm)、微?；虻蛲鲂◇w(50～5000 nm)[7]。它們功能相似，在形成過程中攜帶母體細胞的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及核酸等分子，在細胞間的信息交流過程中起到了重要作用。不同的是微囊泡等是細胞質(zhì)膜受刺激后直接脫落而成，而外泌體的形成是細胞膜內(nèi)部出芽，逐漸形成多囊泡(MVB)和腔內(nèi)囊泡(ILV)后通過胞吐作用釋放的。外泌體幾乎可以由所有細胞類型釋放，并可存在于血液、尿液和母乳等體液中[5,7]。

外泌體最初被認為是清除機體代謝廢物的“垃圾車”，通過不斷的探索，目前更多觀點[7]認為，其是細胞間信息交流的關(guān)鍵，在此過程中發(fā)揮著不可替代的作用。主要有以下幾方面的原因：第一，外泌體形成方式使其具有低免疫原性及可運輸性等，這些特性使得外泌體成為良好的細胞間信息交流的介質(zhì)；第二，外泌體作用方式廣泛，可以通過受體配體相結(jié)合，以及與受體細胞胞膜直接結(jié)合或相互融合的方式，調(diào)節(jié)受體細胞，從而起到傳遞生物信息的作用[5, 7-8]；第三，不同來源的外泌體可以攜帶其來源的生物信息分子參與不同的生理或病理過程，還可以直接影響受體細胞的基因表達及細胞表型，從而調(diào)節(jié)受體細胞的生物學功能，發(fā)揮相應(yīng)作用[7, 9]。

2 MSCs、外泌體對PAH的治療作用及機制

MSCs功能機制及外泌體的應(yīng)用均是當前各種疾病的研究熱點。MSCs來源的外泌體(MSCs-Exo)具有MSCs相似的生物功能，它們在各種疾病模型中被廣泛研究。Jason等[1]通過建立野百合堿誘導的肺動脈高壓小鼠模型證明，胞外囊泡發(fā)揮治療作用主要是通過外泌體實現(xiàn)的，靜脈注射MSCs-Exo可以抑制低氧誘導的PAH的血管重建，但是給予去除外泌體的MSCs培養(yǎng)上清和成纖維細胞來源的外泌體并沒有此作用[10]。許多研究[11]表明，MSCs-Exo對改善PAH是有作用的，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：改善心肺血流動力學、改善血管重塑、減緩右心室肥厚及右心衰竭的程度等。這幾個方面的作用并不是獨立體現(xiàn)的，這其中的關(guān)鍵點是改善肺血管的重塑，緩解肺動脈壓力的升高，從而改善右心病理改變及相應(yīng)的臨床癥狀。

2.1MSCs-Exo抑制肺動脈平滑肌細胞(PASMC)的異常增殖

PASMC的異常過度增殖是PAH肺血管重建病理過程中的關(guān)鍵，已有研究表明，MSCs-Exo可通過抑制該過程發(fā)揮治療作用。

一方面，外泌體可作為細胞間物質(zhì)傳遞載體直接影響受體細胞基因表達，因此，MSCs-Exo調(diào)控PASMC增殖過程中的基因表達是常見的作用機制。Zhang等[11]研究表明，人臍帶血MSCs來源的外泌體可通過Wnt非典型信號通路下調(diào)細胞周期蛋白D1(CyclinD1)的表達，干擾細胞增殖周期，從而抑制PASMC的過度增殖。另一方面，有研究[12-13]表明，PASMC在受到環(huán)境等刺激時會發(fā)生細胞表型轉(zhuǎn)換，這可能是導致肺血管重塑的原因之一。相應(yīng)的研究[11]表明，糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK3β)信號通路可能誘發(fā)PASMC的增殖表型，給予MSCs-Exo可觀察到PASMC的增殖受到抑制，同樣也觀察到了GSK3β的表達下降。因此，MSCs-Exo可以通過調(diào)節(jié)PASMC表型轉(zhuǎn)換，從而在改善血管重建方面發(fā)揮部分作用。

2.2MSCs-Exo抑制肺血管內(nèi)皮細胞(PAEC)凋亡、遷移

越來越多的證據(jù)表明，PAEC的功能失調(diào)是PAH發(fā)生、發(fā)展的又一重要事件，血管內(nèi)皮的完整性是血流動力學穩(wěn)定的關(guān)鍵，在缺氧、炎癥、氧化應(yīng)激等刺激下，PAEC損傷凋亡的影響是多方面的(包括肺血管張力、炎癥、凝血、代謝和重構(gòu))。同時，PAEC釋放的旁分泌因子也可能調(diào)節(jié)PASMC的存活、增殖及其功能表型，導致PASMC不受控制的增殖，并最終導致肺血管重構(gòu)[14]，還有研究[15]表明，PAEC釋放的外泌體可作為載體將翻譯控制腫瘤蛋白(translationally controlled tumor protein， TCTP)從內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)移到PASMC，從而促進PASMC的增殖和凋亡抵抗。另外，內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-to-mesenchymal transition, EndoMT)是一個內(nèi)皮細胞逐漸將其內(nèi)皮表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)或肌成纖維細胞表型的生物學過程，在此過程中，細胞間黏附相關(guān)蛋白及表型丟失，并且獲得遷移能力，向組織內(nèi)部遷移導致血管內(nèi)膜增厚，血管閉塞[16]。

研究[11]表明，MSCs-exo對缺氧誘導的PAEC損傷具有保護作用：一方面，MSCs-exo對缺氧誘導的PAEC凋亡和EndoMT具有抑制作用，細胞內(nèi)抗凋亡基因上調(diào)，促凋亡基因受到抑制，抑制PAEC的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而提高內(nèi)皮細胞的存活率；另一方面，MSCs-exo提高了PAEC血管生成能力、促進細胞黏附和收縮，均有利于肺動脈血管重塑的改善。

2.3MSCs-exo調(diào)控細胞的炎癥激活途徑

炎癥反應(yīng)的激活可以導致內(nèi)皮細胞的凋亡、PASWC的增殖及免疫炎性細胞的聚集，引起肺血管重構(gòu)和PAH的形成。多項研究表明，外泌體可以通過抑制炎癥激活途徑，減輕肺部炎癥反應(yīng)，緩解肺血管重塑。

在野百合堿誘導的PAH模型中，MSCs源性外泌體使抗炎、抗增殖的miRNA表達明顯增加(如miR-34a、miR-122、miR-124和miR-127)，從而降低了右心肥厚指數(shù)[1]。研究[10]表明，信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)是多種細胞因子和生長因子信號通路中所必需的轉(zhuǎn)錄因子，在低氧性PAH小鼠中，它與肺血管細胞的炎性水平及高增殖表型等相關(guān)。MSCs-exo可通過抑制STAT3信號通路，降低了白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、單核細胞趨化蛋白-1(chemoattractant protein-1, MCP-1)等促炎性因子水平，抑制炎癥及缺氧相關(guān)信號通路的激活，從而改善PAH。James等[4]從免疫調(diào)節(jié)角度證明了血管重塑的改善與減少巨噬細胞招募到肺組織、減少巨噬細胞促炎性細胞因子的表達、巨噬細胞的經(jīng)典炎癥激活途徑轉(zhuǎn)變?yōu)榱丝寡准せ钔緩接嘘P(guān)。這些研究[2]表明，MSCs源性外泌體對PAH炎癥激活途徑具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，可能是治療PAH的一種有效的新療法。

2.4MSCs-Exo調(diào)控細胞的代謝途徑

代謝紊亂是PAH的重要特征之一，PAH能使右心室及肺血管的病理改變過程中所涉及很多代謝相關(guān)生物分子水平改變[17-18]。Weiling等[19]總結(jié)了與PAH病理變化相關(guān)的7種主要代謝途徑(包括葡萄糖和脂肪酸氧化、谷氨酰胺分解、精氨酸代謝、一碳代謝、氧化還原反應(yīng)、三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循環(huán)和電子傳遞鏈。同時也表明，線粒體是生物合成途徑和細胞信號傳導過程中介導代謝途徑的主要細胞器。缺氧可引起線粒體功能障礙，一方面線粒體功能障礙后繼發(fā)胰島素抵抗和葡萄糖不耐受，具體表現(xiàn)為糖酵解的增加、葡萄糖氧化磷酸化的減少，為PAH過程中異常增殖的細胞持續(xù)提供能量和生物分子原料，在PAH發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要的作用，這種代謝方式被稱作有氧糖酵解，亦稱作“華寶效應(yīng)”[20-21]。另一方面，線粒體參與的穩(wěn)態(tài)氧感應(yīng)系統(tǒng)(homeostatic oxygensensing system, HOSS)是體內(nèi)感知生理范圍內(nèi)氣道氧水平和動脈氧分壓微小變化的特殊組織構(gòu)成的，當環(huán)境氧水平或體內(nèi)氧分壓水平有變化時，線粒體內(nèi)的傳感器改變活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生，ROS被線粒體超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2, SOD2)局部快速轉(zhuǎn)化為過氧化氫，過氧化氫從線粒體擴散到細胞膜，調(diào)節(jié)離子通道和酶，激活缺氧誘導因子1α，從而擾亂線粒體代謝和動力學，加速細胞增殖和抑制細胞凋亡[22]。研究表明，MSCs-Exo可以改善PAH缺氧暴露后的葡萄糖代謝轉(zhuǎn)變和線粒體功能。MSCs-Exo可以增加丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase, PDH)和谷氨酸脫氫酶1(glutamate dehydrogenase 1, GLUD1)的表達，GLUD1將谷氨酸轉(zhuǎn)化為TCA循環(huán)代謝物α-酮戊二酸、PDH將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，均將糖酵解連接到TCA循環(huán)中，提高氧化磷酸化水平，改善線粒體功能，從而降低了細胞凋亡和壞死[23]。

PAH的病理變化主要有肺血管的重塑、炎性途徑的激活及血管的閉塞等，表現(xiàn)為肺血管細胞的過度增殖和凋亡、膠原蛋白的沉積等[2, 10]。目前對PAH的治療方法有限，大量研究已表明，MSCs來源的外泌體可以預(yù)防甚至逆轉(zhuǎn)PAH的進展，從而為PAH治療提供了一種新的選擇。但是，MSCs源性外泌體在PAH治療中仍存在一些不足，一方面，MSCs來源的外泌體包含的物質(zhì)種類頗多(包括蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子)，參與調(diào)節(jié)PAH的關(guān)鍵性分子及通路機制尚不明確；另一方面，適用于臨床治療的靶點及療效評估的標志物尚不清楚。因此，這也是未來需要進一步探索的方向。