胡 邦，任東林

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的惡性腫瘤之一，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)發(fā)布的最新報告顯示，全球CRC總體發(fā)病率、死亡率分別上升至第三位和第二位。到2020年，CRC占全球新發(fā)癌癥病例的10%(190萬)和死亡病例的9.4%(90萬)。遺傳因素和環(huán)境危險因素在CRC的發(fā)生發(fā)展中都起著重要作用，家族遺傳背景主要影響個體患病風(fēng)險，而環(huán)境因素，包括飲食和生活方式，影響人群的發(fā)病率。僅10%～20%的CRC患者有陽性家族史，提示大多數(shù)CRC是散發(fā)性。根據(jù)世界癌癥研究基金(World Cancer Research Fund，WCRF)/美國癌癥研究所(American Institute for Cancer Research，AICR)持續(xù)更新的項目報告，吸煙、肥胖、低體力活動、西方飲食習(xí)慣和酒精增加了CRC發(fā)病風(fēng)險。TNM腫瘤分期系統(tǒng)由美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control，UICC)共同制定，是目前臨床對患者進行分層診治最可靠的預(yù)后參數(shù)。TNM分期系統(tǒng)描述了腫瘤侵入整個腸壁的深度(T)、轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)數(shù)量(N)和遠處轉(zhuǎn)移情況(M)。根據(jù)T、N和M分類將腫瘤分為4個不同的階段，具有不同的預(yù)后和治療結(jié)局。Ⅰ期CRC患者的5年生存率為94%，Ⅱ期CRC患者的5年生存率為82%，Ⅲ期CRC患者則下降至67%，而轉(zhuǎn)移性或Ⅳ期CRC的5年生存率只有11%。CRC治療策略高度依賴于診斷時的臨床分期，手術(shù)被認為是Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期CRC患者的一線治療方法，術(shù)后Ⅲ期和合并高危險因素的Ⅱ期CRC患者追加輔助化療。在Ⅳ期CRC患者中，可切除轉(zhuǎn)移瘤CRC患者的治療選擇包括新輔助化療、原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶切除術(shù)。如果存在廣泛不可切除的轉(zhuǎn)移病灶，主要行姑息性化療或放射治療緩解臨床癥狀。盡管CRC的治療在過去的20年里取得了明顯進展，但是，即使在相同的TNM分期階段，不同患者的生存率仍然有較大的差異。近10年來，研究人員認識到這些CRC患者預(yù)后的差異可部分用腫瘤生物學(xué)行為的差異來解釋，CRC被認為是一種高度異質(zhì)性和動態(tài)性的疾病，在整個腫瘤進化過程中通過多種分子途徑表現(xiàn)出來。近年對CRC基因組差異表達和腫瘤異質(zhì)性的認識，導(dǎo)致治療方式向個性化用藥的逐步轉(zhuǎn)變。腫瘤異質(zhì)性是近年來各類腫瘤研究的熱點方向，可分為腫瘤間異質(zhì)性和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。腫瘤間異質(zhì)性包括患者之間相同組織學(xué)類型腫瘤的差異，更罕見的是發(fā)生在單個患者內(nèi)的多原發(fā)CRC的差異。腫瘤內(nèi)異質(zhì)性可分為空間異質(zhì)性和時間異質(zhì)性。空間異質(zhì)性是指在原發(fā)腫瘤部位內(nèi)的不同亞群腫瘤細胞或原發(fā)腫瘤與轉(zhuǎn)移病灶之間的差異；時間異質(zhì)性是指CRC的動態(tài)進化性，隨著時間的推移，瘤內(nèi)腫瘤細胞發(fā)生基因改變。CRC的異質(zhì)性研究已經(jīng)在不同的細胞分子水平上進行了探討，包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、組織病理學(xué)特征和炎癥浸潤的特征。本文將概述CRC腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性研究進展，并進一步探討腫瘤異質(zhì)性對治療決策的影響以及不同生物標志物的預(yù)后價值。

1 腫瘤間異質(zhì)性

CRC在組織病理、細胞分子不同水平上存在差異，導(dǎo)致預(yù)后和治療反應(yīng)不同，即使是具有相同TNM分期的CRC患者。這些差異需要我們進一步完善現(xiàn)有的分期系統(tǒng)，以便更好地指導(dǎo)CRC的治療和預(yù)后預(yù)測。目前臨床上常用的CRC診斷檢查方案包括TNM分期、病理組織生物標志物分析和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI)分析。當CRC患者出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移時，KRAS、NRAS和BRAF突變狀態(tài)的確定是至關(guān)重要的，以優(yōu)化治療的選擇和指導(dǎo)抗表皮生長因子受體的靶向治療。

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腫瘤間組織病理學(xué)異質(zhì)性 WHO根據(jù)CRC組織病理學(xué)表現(xiàn)定義了CRC的不同組織學(xué)亞型。如果觀察癌組織中腺體的結(jié)構(gòu)且沒有過多的黏液產(chǎn)生，則腫瘤被評估為腺癌。當超過50%的腫瘤組織內(nèi)產(chǎn)生黏液時，該腫瘤被評估為黏液腺癌。黏液性癌占所有CRC的10%左右，主要位于右半結(jié)腸，其MSI-H比例較高，且KRAS、BRAF和PIK3CA突變率較高。CRC黏液腺癌的預(yù)后目前存在一些爭議，黏液腺癌最初被認為是CRC預(yù)后差的組織學(xué)類型。然而，當糾正術(shù)后TNM分期時，沒有觀察到腺癌和黏液腺癌患者的生存預(yù)后存在顯著差異。印戒細胞癌是CRC少見的組織學(xué)亞型，占CRC比例不到1%。它的特征是印戒細胞的增殖，細胞內(nèi)有黏液湖，將細胞核推向胞漿外周。印戒細胞癌通常在年輕患者中被診斷，在多達40%的病例中觀察到其與右半結(jié)腸和MSI狀態(tài)相關(guān)。印戒細胞癌在早期就容易轉(zhuǎn)移到肝臟、腹膜和卵巢等多個部位，而腺癌的轉(zhuǎn)移大部分只轉(zhuǎn)移到肝臟。髓樣癌是CRC另一種罕見的組織學(xué)亞型，每10萬例CRC中僅有5～8例。髓樣癌分化差，其特征是腫瘤細胞排列呈片狀或巢狀，上皮組織內(nèi)大量淋巴細胞浸潤，并罕見腺體形成。與黏液腺癌類似，髓樣癌在右半結(jié)腸更為常見，并與MSI(高達60%的病例)和BRAF突變(約85%的病例)密切相關(guān)。髓質(zhì)分化被認為是CRC的一個良好的預(yù)后標志物，髓樣癌通常不發(fā)生壁外浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。髓樣癌中的淋巴細胞浸潤促進了抗腫瘤相關(guān)炎癥反應(yīng)，從而防止腫瘤擴散和微轉(zhuǎn)移的發(fā)生。不同的組織學(xué)亞型闡明了CRC組織病理學(xué)特征的異質(zhì)性，對應(yīng)不同的進化途徑，并可預(yù)測治療反應(yīng)。雖然已經(jīng)有一些研究探討了不同組織學(xué)亞型對預(yù)后的預(yù)測價值，但很少有研究探討其在治療決策中的作用。此外，一些典型組織病理學(xué)特征，也有助于了解CRC的異質(zhì)性和生物學(xué)行為。腫瘤出芽是腫瘤組織中常見的病理特征，其在20%～40%的CRC病例中觀察到。腫瘤出芽被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移的第一步，出芽細胞被認為已經(jīng)通過細胞外基質(zhì)遷移，侵襲淋巴脈管組織，并在淋巴結(jié)或遠處形成轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞集落。同時，腫瘤出芽與低分化簇的存在密切相關(guān)，這種現(xiàn)象可以預(yù)測CRC預(yù)后不良。然而，腫瘤出芽在預(yù)測治療反應(yīng)方面的作用尚未明確。

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腫瘤間分子異質(zhì)性

1.2.1 發(fā)病機制的異質(zhì)性 CRC的發(fā)生主要有3種途徑：染色體不穩(wěn)定性(chromosome instability,CIN)導(dǎo)致70%～90%的CRC；CpG島甲基化表型(CpG island methylator phenotype,CIMP)導(dǎo)致10%～20%的CRC；錯配修復(fù)基因突變(different mis-match repair,dMMR)。根據(jù)Fearon和Vogelstein在1990年提出的模型，大多數(shù)散發(fā)性CRC(約占85%)來自腺瘤癌變，它們的特征是CIN、陰性的CIMP、微衛(wèi)星穩(wěn)定性(microsatellite stable，MSS)以及KRAS突變和BRAF野生型基因。約15%的CRC起源于鋸齒狀腺瘤癌變，其途徑以CIMP、MSI和BRAF突變?yōu)樘卣?。MSI這類腫瘤中的一部分具有顯著升高的基因突變率[高腫瘤突變負荷(tumor mutational burden,TMB)]，其特征是dMMR并MSI-H/L。左側(cè)和右側(cè)CRC腫瘤的不同來源導(dǎo)致不同的基因表達和突變譜，最終影響預(yù)后。右側(cè)腫瘤顯示出更高頻率的BRAF突變和MSI，并傾向于發(fā)生在具有CRC遺傳易感性的患者中。相反，左側(cè)腫瘤的特征是CIN和涉及表皮生長因子受體通路激活的基因突變。此外，與左側(cè)腫瘤相比，右側(cè)腫瘤的突變數(shù)量明顯增加。

1.2.2 MSI狀態(tài) MSI患者占CRC病例的15%，其特征是DNA錯配修復(fù)( mis-match repair,MMR)系統(tǒng)存在缺陷，導(dǎo)致微衛(wèi)星水平上的基因組不穩(wěn)定。MMR系統(tǒng)的缺陷導(dǎo)致DNA修復(fù)不足，從而導(dǎo)致高水平的DNA復(fù)制錯誤。在散發(fā)性CRC，MSI腫瘤是通過MMR基因的高甲基化修飾，而在Lynch綜合征患者，失活突變存在于MMR基因。MSI腫瘤通常位于右邊結(jié)腸，伴有組織分化低，以及大量腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)浸潤和腫瘤周圍Crohn樣反應(yīng)。MSI腫瘤不太容易發(fā)生淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移，是腫瘤預(yù)后良好的標志。

1.2.3 分子分型 在這個精準醫(yī)學(xué)的時代，傳統(tǒng)的腫瘤形態(tài)學(xué)分類不能完全體現(xiàn)CRC異質(zhì)性，不能適應(yīng)現(xiàn)代腫瘤治療的需要。需要依據(jù)CRC的異質(zhì)性特征進行分子分型，指導(dǎo)CRC的精準化治療。2015年，CRC亞型聯(lián)盟對這些數(shù)據(jù)集進行了聯(lián)合分析和聚類分析，得到了4個具有獨特特征的共識分子亞型(consensus molecular subgroups,CMS)，1個亞組缺乏特異性分子特征。CMS1，是一類以CD8細胞毒性免疫細胞浸潤和高突變頻率為特征的CRC；CMS2，是具有上皮標志物表達和Wnt通路激活的CIN腫瘤；CMS3，是一種同時包含MSI和MSS狀態(tài)、高代謝活性和KRAS突變的CRC；CMS4，被稱為間充質(zhì)亞型，包括具有較高的間質(zhì)含量和腫瘤生長的轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)，并且CMS4患者的總生存率最差。然而，仍有13%的CRC病例不能被分類，導(dǎo)致第5種亞型沒有明確的分子特征。這表明需要進一步對CRC基因組和表觀基因組分析，以增加對CRC生物學(xué)行為的了解，并獲得更好的疾病分層。

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炎癥異質(zhì)性 越來越多的證據(jù)表明，CRC的發(fā)生發(fā)展不僅取決于腫瘤細胞本身的基因變化，還取決于腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境之間復(fù)雜的相互作用。腫瘤微環(huán)境由上皮細胞、血液、淋巴管、基質(zhì)細胞和免疫細胞組成，其中起到重要作用的免疫細胞既可以通過識別并殺滅腫瘤細胞抑制腫瘤生長，也可以通過過度誘導(dǎo)腫瘤進展控制適應(yīng)性免疫反應(yīng)，刺激腫瘤細胞的增殖和存活，促進血管生成和轉(zhuǎn)移。大量研究已經(jīng)證明了MSI腫瘤被TIL高度浸潤，這提示TIL可能是一個有益的預(yù)后因素。Galon等發(fā)現(xiàn)，相比目前CRC組織病理學(xué)分期，腫瘤組織中免疫細胞的分布和密度可以更好地預(yù)測患者的預(yù)后。該研究設(shè)計了基于腫瘤中心和周圍T淋巴細胞(特別是細胞毒性T細胞和記憶T細胞)的定量免疫評分，同時該研究結(jié)果證明免疫評分是CRC患者的預(yù)后相關(guān)指標。近10年在腫瘤免疫學(xué)研究方面的進展也使CRC免疫治療取得了巨大進步。免疫檢查點阻斷治療(immune checkpoint therapy)是一個熱門研究方向，這類藥物的作用機制是通過解除腫瘤細胞對宿主的逃逸，進而促進宿主免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。

2 腫瘤內(nèi)異質(zhì)性

腫瘤內(nèi)異質(zhì)性被描述為在一個腫瘤中存在不同的亞克隆現(xiàn)象，這種腫瘤內(nèi)異質(zhì)性與進化過程中產(chǎn)生了基因不同的亞克隆腫瘤細胞有關(guān)，也與腫瘤組織中完全分化的癌細胞和未成熟的癌癥干細胞的共存有關(guān)。CRC內(nèi)異質(zhì)性主要表現(xiàn)為腫瘤內(nèi)組織病理學(xué)異質(zhì)性和腫瘤內(nèi)分子異質(zhì)性。

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腫瘤內(nèi)組織病理學(xué)異質(zhì)性 腫瘤內(nèi)組織病理學(xué)異質(zhì)性定義為一個腫瘤內(nèi)包含2種或以上形態(tài)學(xué)腫瘤細胞混合生長的特征，如腺癌、黏液或髓質(zhì)。與MSS腫瘤相比，MSI腫瘤組織病理學(xué)水平的異質(zhì)性已被證明更為廣泛。De Smedt等研究發(fā)現(xiàn)，超過50%的MSI腫瘤顯示混合形態(tài)生長模式，這種混合形態(tài)的特征僅在10%的MSS腫瘤中可見。除了存在形態(tài)學(xué)生長模式外，在同一個腫瘤組織病理中還觀察到炎癥浸潤(T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞)的變化。同樣，與MSS腫瘤相比，這些差異在MSI腫瘤中更為常見，并且與腫瘤的形態(tài)學(xué)生長模式高度相關(guān)。

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腫瘤內(nèi)分子異質(zhì)性

2.2.1 原發(fā)腫瘤內(nèi)分子異質(zhì)性 Baisse等研究表明，在腫瘤內(nèi)15～20個區(qū)域組織檢測基因改變和雜合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)時，發(fā)現(xiàn)67%的晚期CRC存在腫瘤內(nèi)分子異質(zhì)性，這表明了腫瘤取樣的重要性。在大多數(shù)研究中，當組織被福爾馬林固定和石蠟包埋時，沒有考慮到特定的組織區(qū)域圖譜，因此無法分析腫瘤內(nèi)特定位置之間的異質(zhì)性。當考慮術(shù)前新輔助治療時，方案制定通常是基于從腫瘤表面進行的抽樣活檢的狀態(tài)，故有時會導(dǎo)致不恰當?shù)闹委煕Q定。因此，建議從腫瘤的不同部位至少進行2次活檢，以避免取樣錯誤導(dǎo)致沒有準確地評估腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。Suzuki等研究發(fā)現(xiàn)，在不同的CRC患者中，使用靶向二代測序(next generation sequencing,NGS)和三代擴增子測序觀察到腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的差異。在對4例CRC患者的24例標本的分析中，通過NGS發(fā)現(xiàn)不同的腫瘤區(qū)域在APC、KRAS和TP53等驅(qū)動基因突變情況高度一致。然而，進一步通過擴增子測序方法發(fā)現(xiàn)在原發(fā)腫瘤周圍的亞克隆水平上存在大量突變，在MSI腫瘤中觀察到更廣泛的腫瘤內(nèi)分子差異。

2.2.2 原發(fā)性腫瘤與轉(zhuǎn)移瘤之間的分子差異 大多數(shù)情況下，原發(fā)性結(jié)直腸腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤的基因突變圖譜是一致的。Brannon等證明了KRAS、NRAS和BRAF的突變分析結(jié)果顯示，在原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移組織中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果完全匹配。這一發(fā)現(xiàn)也適用于其他驅(qū)動基因，如APC、TP53和PIK3CA。然而，數(shù)量遠多于驅(qū)動基因的“乘客性”突變，常常在原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤之間產(chǎn)生異質(zhì)性。在微衛(wèi)星狀態(tài)方面，Galon等也觀察到原發(fā)腫瘤與其轉(zhuǎn)移病灶之間的MSI狀態(tài)的高度一致性，只有在有限數(shù)量的病例中觀察到MSS轉(zhuǎn)移與MSI原發(fā)腫瘤。由于散發(fā)性背景下的MSI是MMR基因的表觀遺傳沉默的結(jié)果，因此原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤的MSI狀態(tài)的差異是非常可能的。人們普遍認為，MSI在腫瘤的起始階段很重要，而對腫瘤的進展并不重要。因此，MSI已經(jīng)表現(xiàn)在癌癥進展的早期階段，這也解釋了為什么在MSI原發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移中可見MSI的丟失。但迄今為止，在MSS腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中還沒有觀察到MSI的出現(xiàn)。

3 結(jié)語

CRC是一種高度異質(zhì)性的疾病，因此，非常需要精準的疾病分層來區(qū)別腫瘤間和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性。在病理報告中總結(jié)MSI狀態(tài)、TNM分期、淋巴管浸潤、腫瘤出芽、腫瘤分化以及BRAF、KRAS、NRAS突變狀態(tài)是很重要的。它們共同提供了疾病行為、疾病進展和預(yù)后的指示，并指導(dǎo)治療決策。預(yù)計腫瘤免疫評分和分子分型將被添加到未來的病理報告中，進一步提供大量關(guān)于預(yù)后和對靶向、免疫治療反應(yīng)的信息。展望未來，伴隨多區(qū)域和組學(xué)測序、單細胞測序以及縱向液體活檢方法的廣泛應(yīng)用，我們在臨床上對腫瘤異質(zhì)性的評估將更加精確，進而促進更有效的CRC個性化精準治療。