羅巔輝

(華僑大學 化工學院， 福建 廈門 361021)

石耳科(Umbilicariaceae)物種石耳隸屬于真菌界，多生長在巖石上.石耳入藥已有悠久的歷史，民間常用來消腫，治療腸炎、鼻出血和痢疾等病癥.2015年，石耳正式被陜西省藥材標準收錄[1]，據(jù)記載，石耳無毒，具有消炎和去毒的功效[2].石耳科兩個屬Umbilicaria和Lasallia因其子囊盤盤面平坦光滑，二者形態(tài)極其相似，民間并沒有區(qū)分使用，早年間一直被歸為石耳科同屬物種[3].

炎癥因子的過量表達會引起多種慢性疾病，如導致腦出血患者二次腦損傷.腦出血患者發(fā)病后會釋放大量的炎癥因子，從而增加血腦屏障的通透性，引起腦水腫等腦出血后二次損傷[4].本文以2個不同產(chǎn)地石耳科物種石耳(U.esculenta)和皰臍衣(L.papulose)為研究對象，制備多糖類天然活性成分，以期從理化特性、微觀結構和抗炎癥作用方面對石耳科形態(tài)難以區(qū)分的兩個物種進行深入對比，并為炎癥因子過表達引起的相關慢性疾病藥物的開發(fā)提供方向.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

兩個原材料分別購自重慶市城口縣巴山物語農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司和江西省宜春市志東貿易銷售商行，由華僑大學生物系教研組通過形貌鑒定，并基于ITS序列的聚類分析[5]，確定其分別隸屬于石耳科石耳屬常見種U.esculenta和皰臍衣屬物種L.papulosa.

單糖標準品、葡聚糖標準品和脂多糖(美國Sigma公司)；胎牛血清(德國PAN-Biotech公司)；DEAE-Segharose CL-6B型層析介質(瑞士Pharmacia公司)；反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒(美國普洛麥格公司)；其他試劑均為分析純.

CKX41型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；HP1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；4800II型實時熒光定量PCR系統(tǒng)(瑞士Roche公司)；H-7650型透射電子顯微鏡(日本Hitachi High-Technologies公司)；Forma 3111型二氧化碳培養(yǎng)箱、Nicolet Nexus 470型紅外光譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖的制備 將干燥的原材料粉碎，在料液比(g∶mL)為1∶30，提取溫度90 ℃，提取時間2 h的條件下，提取得到多糖粗提液.將所得粗提液過濾，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至小體積，冷卻后加入無水乙醇，獲得沉淀.將沉淀溶解后進行反復凍融，使用Sevag法脫蛋白，冷凍干燥后得到粗多糖[6]，分別命名為CUE和YUF.

取300 mg上述粗多糖溶于20 mL蒸餾水中，上樣于DEAE-Sepharose CL-6B型層析柱.首先，用蒸餾水洗脫(流速為1 mL·min-1，每12 min收集1管)，再進行直線梯度洗脫(0～1 mol·L-1NaCl各600 mL)，采用苯酚-硫酸法在波長490 nm下檢測糖分布[7].從U.esculenta和L.papulosa中分別收集到1種純化多糖，經(jīng)過濃縮、冷凍干燥后，分別命名為CUEP和YUFP.

1.2.2 單一性和分子質量鑒定 采用高效體積排阻色譜(HPSEC)法，使用SUGAR KS-804型色譜柱(柱溫為50 ℃)和示差折光檢測器，鑒定上述純化多糖的單一性.將超純水作為流動相(1 mL·min-1)，根據(jù)各葡聚糖標準品的出峰時間，制作分子質量標準曲線，從而分析各多糖的分子質量[8].為了檢測樣品的純度，取1 mg·mL-1純化多糖樣品液在190～800 nm下進行紫外光譜掃描，鑒定樣品是否含有核酸及蛋白類物質.

1.2.3 成分分析 采用苯酚-硫酸法測定糖含量(質量分數(shù))；取2 mg樣品進行KBr壓片后，使用Nicolet Nexus 470型紅外光譜儀測定純化產(chǎn)物的特征官能團[7].

1.2.4 單糖組成和微觀結構研究 取30 mg樣品溶于4 mL 1 mol·L-1硫酸中，100 ℃烘箱水解8 h，反應液用碳酸鋇中和、離心后，取上清液冷凍干燥得水解產(chǎn)物.取1 mg·mL-1水解產(chǎn)物經(jīng)0.22 μm尼龍膜過濾后，進行高效液相色譜分析(使用SUGAR SP0810型色譜柱，超純水作為流動相，流速為0.5 mL·min-1，柱溫為85 ℃，采用示差折光檢測器檢測[9]).

將1 mg·mL-1純化多糖樣品液與1 mg·mL-1的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液等體積混合，80 ℃溫浴后，稀釋到適當倍數(shù)，取1滴稀釋液滴加到碳支持膜(200目)上，干燥5 h后，使用透射電子顯微鏡觀察微觀結構[9-10].

1.2.5 多糖的抗炎癥作用 將RAW264.7細胞置于DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后進行傳代，炎癥模型的建立通過1 μg·mL-1脂多糖(LPS)誘導完成，設置空白組、陰性對照組、陽性對照組和樣品組進行抗炎癥實驗研究.細胞在6孔板中培養(yǎng)24 h后，陽性對照組更換2 mL含75 μg·mL-1地塞米松(DXMS)的完全培養(yǎng)基，樣品組更換2 mL含75 μg·mL-1純化多糖樣品的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，20 h后分別在陰性對照組、陽性對照組和樣品組中添加1 μg·mL-1LPS后，繼續(xù)培養(yǎng)4 h[11].提取各組細胞內的總RNA，進行cDNA的反轉錄及實時熒光定量PCR(qPCR)檢測.qPCR擴增共進行45個循環(huán)，擴增條件是95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s.以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參基因，使用相對定量方法(2-ΔΔCT法)計算TNF-α，IL-6，IL-1β，COX-2 的mRNA相對表達量[11-12].

2 實驗結果與分析

2.1 CUEP和YUFP的制備

使用熱水提取和無水乙醇沉淀后，從兩種原材料中提取得到粗多糖CUE和YUF，提取率分別為15.91%，9.30%.CUE和YUF經(jīng)凍融和脫蛋白后進行柱層析純化，得到糖分布曲線，如圖1所示.圖1中：D490為波長490 nm下的吸光值.根據(jù)糖分布情況，按照糖主峰收集洗脫液，洗脫液經(jīng)透析袋(截留相對分子質量3 500)透析后，得到純化樣品CUEP和YUFP，得率分別為25%和27%.

(a) CUE (b) YUF

2.2 CUEP和YUFP的成分分析

CUEP和YUFP的單一性鑒定結果，如圖2所示.圖2中：t為保留時間.由圖2可知：CUEP由分子質量為162～474 u的多糖鏈聚合而成，而YUFP單一性較好，由分子質量為98 u的單一成分組成.

(a) CUEP (b) YUFP

根據(jù)葡萄糖標準曲線y=0.017 4x+0.011 45(R2=0.999)，CUEP和YUFP的糖含量(質量分數(shù))分別為(97.00±3.03)%和(97.00±1.72)%.紫外光譜掃描結果顯示，CUEP和YUFP均不含有蛋白質和核酸.

利用FTIR檢測CUEP和YUFP的特征官能團，其紅外光譜圖如圖3所示.圖3中：σ為波數(shù).由圖3可知：CUEP和YUFP在3 410 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰是由-OH伸縮振動引起，2 900 cm-1附近的弱峰是由C-H伸縮振動產(chǎn)生，1 640 cm-1附近的吸收峰是由C=O基引起，而1 050 cm-1處的吸收峰則是由C-O-C振動吸收產(chǎn)生的.這4處的吸收峰為糖類物質的特征官能團吸收峰，說明CUEP和YUFP均為糖類物質[13].

圖3 CUEP和YUFP的紅外光譜圖

使用硫酸將多糖CUEP和YUFP完全水解為單糖，對水解產(chǎn)物進行高效液相色譜分析，從而確定多糖的單糖組分.CUEP和YUFP的高效液相色譜圖，如圖4所示.參照標準圖譜[9]可知，CUEP和YUFP均由葡萄糖、木糖、半乳糖和甘露糖組成，其摩爾比分別為177.96∶1.00∶4.45∶3.19和33.21∶3.17∶1.00∶2.40.兩種多糖主要由葡萄糖組成，但CUEP所含的葡萄糖比例是YUFP的5倍以上.

(a) CUEP (b) YUFP

CUEP和YUFP的透射電鏡圖，如圖5所示.由圖5可知：CUEP是由長短不一的線狀結構組成，各單鏈之間高度聚集，彼此相互纏繞在一起；YUFP同樣由多股鏈聚合組成，但形狀相對規(guī)則，各單鏈之間相互纏繞組成一個個小的蝴蝶結狀結構.相比之下，CUEP鏈長且纏繞聚集度高，在相同質量濃度的SDS溶液中更不容易解聚分散.

(a) CUEP (b) YUFP

2.3 抗炎癥作用

首先，判斷CUEP和YUFP對RAW264.7細胞的細胞毒性，以確保后續(xù)抗炎癥實驗是在無細胞毒狀態(tài)下進行的.細胞毒性實驗結果表明：當CUEP或YUFP添加劑量為75 μg·mL-1時，RAW264.7細胞生長狀態(tài)良好，說明該劑量下無細胞毒性.

CUEP和YUFP對RAW264.7細胞炎癥因子mRNA相對表達量的影響，如圖6所示.圖6中：*表示P<0.05；**表示P<0.000 1.由圖6可知：與空白組相比，添加LPS可顯著增加陰性對照組中炎癥因子TNF-α，IL-1β，IL-6，COX-2的mRNA相對表達量(P<0.000 1)，說明炎癥模型已成功構建.

由圖6(b)可知：與陰性對照組相比，陽性對照組顯著降低了LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子IL-1β的mRNA相對表達量(P<0.05)，抑制率為61.60%；添加75 μg·mL-1CUEP或YUFP的樣品組均能顯著降低IL-1β(P<0.000 1)的mRNA相對表達量，抑制率分別為60.58%和88.12%，其中，YUFP樣品組的抑制效果顯著優(yōu)于陽性對照組(P<0.000 1).由圖6(c)可知：陽性對照組和CUEP樣品組均能顯著降低炎癥因子IL-6的mRNA相對表達量(P<0.05)，抑制率分別為76.80%和66.62%，而YUFP樣品組無顯著抑制效果.由圖6(d)可知：陽性對照組和CUEP樣品組中COX-2的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.000 1)，抑制率分別為83.90%和66.92%.

(a) TNF-α (b) IL-1β

綜上所述，YUFP對炎癥因子IL-1β的抑制效果顯著優(yōu)于陽性對照組，CUEP對IL-1β，IL-6，COX-2的抑制效果與陽性對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其綜合抗炎癥作用更好.

3 結論

從石耳科兩個相近物種U.esculenta和L.papulosa中分離純化得到多糖CUEP和YUFP.CUEP是由分子質量為162～474 u的多糖鏈聚合而成，YUFP則由分子質量為98 u的單一多糖組成.二者的單糖組成均為葡萄糖、木糖、半乳糖和甘露糖，但CUEP所含葡萄糖比例明顯高于YUFP.CUEP和YUFP具有不同的微觀結構，CUEP呈線狀，而YUFP呈蝴蝶結狀，CUEP聚合度更高更不易解聚.質量濃度為75 μg·mL-1的CUEP和YUFP對RAW264.7細胞無毒，且能顯著降低LPS誘導的RAW264.7細胞中炎癥因子TNF-α，IL-6，IL-1β，COX-2的mRNA相對表達量，CUEP綜合效果好，而YUFP則主要能顯著降低IL-1β的mRNA相對表達量，且優(yōu)于地塞米松的抑制效果(P<0.000 1).

U.esculenta和L.papulosa外貌形態(tài)極其相似，不易區(qū)分，但其主要的多糖類物質在分子質量、單糖組成和微觀結構上均有差異，這些特征使它們的生物活性顯著不同[14].分子質量高、葡萄糖占比高和螺旋程度高的CUEP能更好地抑制炎癥因子的過表達.多糖的微觀結構對其生物活性影響較大，螺旋纏繞結構的多糖可能具有更好的生物活性[15-16].CUEP相對螺旋纏繞程度更高更不易解聚，這可能與其擁有更好的抗炎癥因子過表達能力相關聯(lián).炎癥因子的過量表達與很多慢性疾病相關，如炎性因子IL-1β能引起腦水腫，該炎癥因子在腦出血急性期會大量表達，是腦出血后炎性反應的重要標志[4].從上述研究結果看，石耳科多糖能有效抑制炎癥細胞中IL-1β的過量表達，且多糖沒有毒副作用，其有效成分結構明確，可用于輔助治療炎癥因子過表達引起的相關慢性病，尤其可作為腦出血患者預防二次腦損傷的輔助藥物.