黃亦欣， 鄒景， 林金彬， 馬紅芳， 陳秀峰， 楊浩宇

(華僑大學 土木工程學院， 福建 廈門 361021)

吲哚是一種典型的氮雜環(huán)芳烴化合物，廣泛地存在于焦化、印染、醫(yī)藥、農藥等工業(yè)廢水中[1-2].由于吲哚具有累積性及生物毒性，廢水中的吲哚一旦進入環(huán)境中，就會在生物體內積累，對生物體的細胞造成不可逆的損害，進而產生致畸、致癌和致突變等不良作用[3-7].此外，由于吲哚的化學結構穩(wěn)定，很難被微生物高效降解去除.臭氧、高鐵酸鹽等化學氧化法和納米材料吸附法已被運用于吲哚的去除中[4，7-9]，但存在藥劑材料投入成本高、操作復雜、易產生二次污染等問題.

近年來，酶催化氧化法作為一種常見的高級氧化技術，已運用于廢水中苯酚、雌激素等酚類及苯胺類有機污染物的降解，但對污染物降解的效率較低[10-19].由于能夠產生具有更高氧化活性的中間體來高效地降解污染物，加入有機小分子作為電子轉移體的酶介導體系逐漸成為研究熱點.現(xiàn)有研究表明，1-羥基苯并三氮唑(HBT)、丁香醛(SA)等多種電子轉移體可有效地強化漆酶/O2體系降解污染物，并拓寬該體系可降解的污染物種類[20-21].然而，漆酶價格昂貴，且漆酶/O2體系僅在pH值為酸性的條件下對污染物具有良好的去除效能.由于在pH值為中性的條件下對酚類及苯胺類有機污染物具有較高的降解效能，辣根過氧化物酶催化過氧化氫(HRP/H2O2)體系受到了水處理研究者的廣泛關注[1，10，15，17].據(jù)報道，氯丙嗪和HBT可作為電子轉移體強化HRP/H2O2體系降解污染物，但這些加入的電子轉移體會隨著污染物的降解而不斷分解[22-23].因此，有必要探尋其他高效、穩(wěn)定的電子轉移體來強化HRP/H2O2體系降解污染物.

作為一種常用的還原劑，2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)可通過單電子轉移反應生成具有較高氧化活性的ABTS自由基(ABTS·+).作為電子轉移體，ABTS已運用于強化高鐵酸鹽[24]、高錳酸鹽[25-26]及漆酶/O2體系[16，27-28]的有機污染物降解中.同時，課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，HRP/H2O2體系可迅速氧化ABTS生成ABTS·+[29].因此，ABTS作為電子轉移體強化HRP/H2O2體系降解吲哚在理論上是可行的，但目前尚未有相關報道.基于此，本文以ABTS為電子轉移體，強化HRP/H2O2體系降解吲哚.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

辣根過氧化物酶(HRP，4 166.7 nkat·mg-1)、2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS，質量分數(shù)為98%)、吲哚(AR級)及腐殖酸(上海市上海阿拉丁試劑有限公司)；過氧化氫(H2O2，質量分數(shù)為30.0%)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4，AR級)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4，AR級)、硼酸鈉(Na2B4O7，AR級)、硼酸(H3BO3，AR級)、氫氧化鈉(NaOH，AR級)、高氯酸(HClO4，AR級)、碳酸氫鈉(NaHCO3，AR級)、氯化鈉(NaCl，AR級)、硫酸鈉(Na2SO4，AR級)、硝酸鈉(NaNO3，AR級)及硫代硫酸鈉(Na2S2O3，AR級)(上海市上海國藥集團)；色譜級乙腈和甲醇(液相色譜分析中使用，德國默克公司).

表1 實際水體的主要水質指標

1.2 實驗步驟

吲哚降解實驗在(25±2) ℃下恒溫水浴，并用磁力攪拌器攪拌.首先，將11 mL的超純水、5 mL的磷酸緩沖母液(50 mmol·L-1，pH值分別為5.0，7.0)或硼酸緩沖母液(50 mmol·L-1，pH值分別為9.0，11.0)、1.5 mL的ABTS母液(0.5 mmol·L-1)、0.5 mL的吲哚母液(0.3 mmol·L-1)及5 mL的H2O2母液(2.5 mmol·L-1)依次加入25 mL的玻璃錐形瓶中.然后，再加入2 mL的HRP母液(1 667 nkat·L-1)，啟動反應.模擬廢水中的吲哚濃度為6 μmol·L-1.間隔一定的時間，從錐形瓶中取出500 μL反應液轉移至含有過量Na2S2O3的液相色譜小瓶，并通過高效液相色譜儀測定吲哚濃度.

1.3 分析方法

吲哚濃度通過Agilent 1220型高效液相色譜儀(HPLC，德國Agilent公司)進行測定，HPLC色譜柱型號為Agilent TC-C18(2)(4.6 mm×150.0 mm(內徑×長度)，5.0 μm(粒徑))，流動相由含體積分數(shù)為0.1%乙酸的水相和色譜級乙腈構成，二者體積比為20∶80，流速為1.0 mL·min-1，測定波長為270 nm，進樣量為50 μL.

采用TU-1901型紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)分別在340，732 nm處測定吸光度，再根據(jù)朗伯-比爾定律換算為ABTS和ABTS·+的濃度.

吲哚的中間降解產物通過Agilent 1290-6545型高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜儀(LC/Q-TOF/MS，德國Agilent公司)負離子模式進行分析.液相色譜柱為C18柱(3.0 mm×50.0 mm(內徑×長度)，1.8 μm(粒徑))，流動相由色譜級甲醇(A相)和超純水(B相)構成，流速為0.2 mL·min-1.采用梯度洗脫模式，A相比例在10 min內從10%提高到90%.吲哚降解過程中的生物毒性變化采用熒光發(fā)光菌法進行監(jiān)測，詳細步驟參考文獻[30].

2 實驗結果與討論

2.1 ABTS強化HRP/H2O2體系降解吲哚的效能

ABTS加入前后HRP/H2O2體系對吲哚的降解效能，如圖1所示.圖1中：HRP的酶活力為133.3 nkat·mL-1；ABTS濃度為30 μmol·L-1；H2O2濃度為500 μmol·L-1；吲哚濃度為6 μmol·L-1；反應溫度為(25±2) ℃；實驗至少重復兩次，點和誤差棒分別表示重復實驗結果的平均值和相對標準偏差；t為反應時間；δ為吲哚濃度剩余率，δ=ct/c0，c0為吲哚的初始濃度，ct為當前時刻的吲哚濃度.

(a) ABTS加入前 (b) ABTS加入后

由圖1可知：ABTS加入前，在pH值為5.0～11.0的范圍內，HRP/H2O2體系降解吲哚的速度緩慢；當pH值為7.0時，HRP/H2O2體系在15 min內僅降解了約20%的吲哚；ABTS加入后，在pH值為5.0～11.0的范圍內，可顯著提升HRP/H2O2體系中吲哚的降解效能.

課題組之前的研究[29]表明，HRP可快速地催化H2O2氧化ABTS，生成ABTS·+.同時，文獻[16]的研究表明，ABTS·+具有較強的氧化活性，可快速地氧化降解吲哚.因此，可推測HRP/H2O2體系中加入的ABTS被氧化生成ABTS·+，反應式為

HRP+H2O2+ABTS→ABTS·+，

(1)

進而促進吲哚的降解，反應式為

ABTS·++吲哚→ABTS+吲哚降解產物.

(2)

前期報道發(fā)現(xiàn)，ABTS·+的氧化活性隨著反應溶液pH值的升高而提高[31]，這與HRP/H2O2/ABTS體系在pH值為9.0時對吲哚的降解效能遠高于pH值為7.0時的實驗結果吻合(圖1(b)).然而，該體系在pH值為11.0時對吲哚的降解效能遠遠低于pH值為9.0時，這可能是因為在pH值為11.0時，有相當比例的H2O2電離為具有較強還原能力的HO2-(H2O2的解離系數(shù)為11.62[32-33])，進而與吲哚競爭消耗大量ABTS·+，導致HRP/H2O2/ABTS體系對吲哚的降解效能降低.此外，文獻[34]的研究表明，離子形態(tài)的吲哚比分子形態(tài)的吲哚更易被氧化降解，故HRP/H2O2/ABTS體系在pH值為5.0時對吲哚的降解效能反而高于pH值為7.0時，這主要歸因于離子形態(tài)的吲哚在pH值為5.0時的比例更高，以及HRP/H2O2體系在pH值為5.0時對吲哚的降解具有更好的協(xié)同作用.

2.2 ABTS的強化作用機制

2.2.1 ABTS·+的生成及其對吲哚降解的作用 節(jié)2.1的分析認為，加入ABTS后，HRP/H2O2體系吲哚降解效能的顯著提高歸因于體系中ABTS·+的生成.文獻[29，35-36]的研究表明，ABTS被氧化后生成的ABTS·+在可見光光譜區(qū)有顯著吸收，且在415，650，732，820 nm等4個波長處有特征吸收峰.因此，為了驗證ABTS·+的生成，對HRP/H2O2/ABTS體系反應溶液進行可見光光譜掃描.

各體系的可見光光譜圖，如圖2所示.圖2中：HRP的酶活力為133.3 nkat·mL-1；ABTS濃度為0～30 μmol·L-1(分別取0，5，10，20，30 μmol·L-1，下同)；H2O2濃度為500 μmol·L-1；吲哚濃度為6 μmol·L-1；初始pH值為7.0±0.1， 反應溫度為(25±2) ℃；D為吸光度；λ為波長.由圖2可知：HRP/H2O2體系反應溶液在可見光光譜區(qū)沒有明顯的吸收；ABTS的可見光譜也僅在340 nm波長處有特征吸收峰，在ABTS·+的4個特征波長均沒有明顯的吸收(與文獻[37]的研究結果一致)；加入ABTS后，出現(xiàn)了ABTS·+的4個特征吸收峰，表明確實有ABTS·+生成；隨ABTS濃度的提高，檢測到的4個ABTS·+特征吸收峰峰高也成比例提高，進一步證實了體系中ABTS·+的存在.

圖2 各體系的可見光光譜圖

需要注意的是，當存在過量H2O2時，ABTS·+可能會被進一步氧化生成在518 nm處有特征吸收峰的ABTS2+[38]，但可見光光譜圖在518 nm處沒有特征吸收峰，進而排除HRP/H2O2/ABTS體系中ABTS2+的生成.

ABTS·+是由HRP催化H2O2氧化ABTS產生的，其生成量受ABTS濃度影響較為顯著.為了探究ABTS·+在HRP/H2O2/ABTS體系中對吲哚降解的作用，進一步考察不同ABTS濃度下吲哚的降解效能及其與ABTS·+生成量之間的關系.ABTS濃度對HRP/H2O2/ABTS體系的影響，如圖3所示.圖3中：HRP的酶活力為133.3 nkat· mL-1；ABTS濃度為0～30 μmol·L-1；H2O2濃度為500 μmol·L-1；吲哚濃度為6 μmol·L-1；初始pH值為7.0±0.1；反應溫度為(25±2) ℃；kobs為表觀速率常數(shù)；c(ABTS)，c(ABTS·+)分別為ABTS，ABTS·+的濃度.

(a) 吲哚降解 (b) ABTS·+生成 (c) 反應速率

由圖3(a)，(b)可知：吲哚的降解效能隨著ABTS濃度的增加而不斷提高；加入30 μmol·L-1的ABTS后，HRP/H2O2/ABTS體系對吲哚降解的表觀速率常數(shù)高達0.564 5 min-1，相比HRP/H2O2體系(0.015 6 min-1)提高了36.2倍；隨著ABTS濃度的增加，ABTS·+的生成濃度也成比例提高.在不同ABTS濃度下，對HRP/H2O2/ABTS體系中吲哚降解的表觀速率常數(shù)與ABTS·+生成濃度(t=15 s時)進行線性擬合，發(fā)現(xiàn)兩者之間具有良好的線性相關性(R2>0.99).由此可知，HRP/H2O2/ABTS體系中生成的ABTS·+對吲哚降解起主要作用.

2.2.2 ABTS的電子轉移體作用 據(jù)報道，氯丙嗪和HBT等有機小分子可作為電子轉移體強化水中有機污染物的降解.然而，氯丙嗪和HBT在強化有機污染物降解的過程中，其本身也會隨污染物的降解而不斷消耗，并不是完美的電子轉移體[22-23].同時，ABTS作為電子轉移體在強化高鐵酸鹽、高錳酸鹽降解污染物的過程中也存在分解[24，26].因此，進一步對HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚過程中成分的濃度變化進行監(jiān)測，結果如圖4所示.圖4中：HRP酶活力為133.3 nkat·mL-1；ABTS濃度為30 μmol·L-1；H2O2濃度為500 μmol·L-1；吲哚濃度為6 μmol·L-1；初始pH值為7.0±0.1；反應溫度為(25±2) ℃；c為濃度.由圖4及相關分析可知：大部分ABTS先迅速通過單電子轉移反應轉變?yōu)锳BTS·+；然后，隨著反應的進行，生成的ABTS·+被吲哚及吲哚降解中間產物還原回ABTS，導致ABTS穩(wěn)態(tài)濃度緩慢上升，而ABTS·+穩(wěn)態(tài)濃度及兩者的疊加濃度均緩慢下降；隨著吲哚的降解，ABTS和ABTS·+的疊加濃度在15 min內由30 μmol·L-1下降至25 μmol·L-1左右，即ABTS的消耗比例約為17%；ABTS的少量消耗可能是由于生成的ABTS·+被氧化劑進一步氧化破壞所致[24，26].因此，在HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚的過程中，盡管ABTS起到了電子轉移體的作用，但依然稱不上“完美”的電子轉移體.

圖4 HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚過程中成分的濃度變化

2.2.3 ABTS強化吲哚降解的作用機制 由上述分析可知，ABTS·+是HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚的主要活性物質，并且強化劑ABTS在體系中可作為電子轉移體循環(huán)作用于吲哚的降解.文獻[10，39]的研究表明，HRP催化H2O2可生成具有氧化性的中間體化合物.因此，推測ABTS強化HRP/H2O2體系降解吲哚的反應機制為:首先，HRP被H2O2氧化，生成氧化性中間體；然后，氧化性中間體通過單電子轉移的方式氧化ABTS，生成具有較強氧化活性的ABTS·+(式(1))；隨后，生成的ABTS·+快速氧化降解吲哚，且其自身被還原回ABTS(式(2))，即ABTS在HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚過程中主要起電子轉移體的作用.

HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚的反應機制圖，如圖5所示.

圖5 HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚的反應機制圖

2.3 水質背景的影響

(a) 共存物質 (b) 腐殖酸質量濃度 (c) 實際水體

由圖6(b)可知：當腐殖酸質量濃度從5 mg·L-1提高至20 mg·L-1，HRP/H2O2/ABTS體系對吲哚的降解效能沒有顯著影響，說明HRP/H2O2/ABTS體系對較高質量濃度的腐殖酸具有良好的抗干擾性能，可以運用于較高濃度腐殖酸水體中吲哚的降解.

由圖6(c)可知：HRP/H2O2/ABTS體系可在10 min內將超純水、湖水及二沉池出水中外加的6 μmol·L-1吲哚降解完全，呈現(xiàn)出高效的降解效能.這些現(xiàn)象表明，HRP/H2O2/ABTS體系應用于吲哚的降解時對實際水體具有良好的抗干擾性能；湖水和二沉池出水水質背景對吲哚降解有微弱抑制作用，主要是因為實際水體中存在的天然有機物會與吲哚競爭部分ABTS·+.

2.4 吲哚降解路徑及生物毒性分析

2.4.1 吲哚降解的產物和路徑 采用LC/Q-TOF/MS對HRP/H2O2/ABTS體系中吲哚的可能降解產物進行檢測分析，結果如表2所示.表2中：tR為保留時間；RSD為相對標準偏差.除吲哚本身外，還檢測出了5種吲哚降解產物.

表2 吲哚降解產物的信息

基于產物檢測結果，推測出兩種吲哚降解的路徑，如圖7所示.圖7中：DP1*和DP5*表示未檢測到.由圖7可得以下兩種吲哚降解的可能路徑.

圖7 HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚的途徑

圖8 HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚過程中的生物毒性變化

此外，由于吲哚對綠藻表現(xiàn)出顯著的毒性[31]，采用ECOSAR軟件進一步模擬評估HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚過程中對綠藻急性毒性及慢性毒性的變化，確定吲哚及其降解產物的危險等級.

吲哚及其降解產物對綠藻的急性毒性和慢性毒性，如表3所示.表3中：EC50定義為96 h的半最大效應質量濃度，是指引起50%最大效應的質量濃度；ρChV為最大無可見不利影響質量濃度和最低可見不利影響質量濃度的幾何平均值.根據(jù)HJ-T 154-2004 《新化學物質危害評估導則》，將危險等級分為極高(EC50/ρChV≤1 mg·L-1)、高(1 mg·L-1100 mg·L-1).

由表3可知：吲哚對綠藻具有很強的急性毒性及慢性毒性，但其降解產物對綠藻的毒性均顯著低于吲哚，且其中降解產物DP7的毒性達到低危險等級，這個結果進一步說明了HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚可以顯著改善吲哚的毒性.

表3 吲哚及其降解產物對綠藻的急性毒性和慢性毒性

3 結論

ABTS的加入顯著強化了HRP/H2O2體系在pH值為5.0～11.0范圍內對6 μmol·L-1吲哚的降解效能，且其強化效能隨著ABTS濃度的增加而提高.當pH值為7.0時，30 μmol·L-1ABTS的加入可將HRP/H2O2體系中6 μmol·L-1吲哚降解的表觀速率常數(shù)提高36.2倍.HRP催化H2O2氧化ABTS生成的具有較高氧化活性的ABTS·+對吲哚降解起到主要作用，并且ABTS·+生成濃度與吲哚降解的表觀速率常數(shù)具有良好的線性關系(R2>0.99).