王欣慧，王穎，姚明東，肖文海

（1 天津大學化工學院，天津 300072； 2 天津大學合成生物學前沿科學中心和系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300072； 3 天津大學前沿技術研究院，天津 301700）

引 言

維生素A（vitamin A，VA）是首個被發(fā)現(xiàn)，并且在人體正常代謝網(wǎng)絡中不可缺少，同時也是容易缺乏的脂溶性維生素。早在1000多年前，中國唐代醫(yī)學家孫思邈在其著作《千金方》中就記載了動物肝臟可用于治療夜盲，而巴西人發(fā)現(xiàn)魚肝油可以治療干眼病。當時人們對維生素并不了解，由于它是一種黃色黏稠的液體，因此其被命名成“脂溶性A”（A是德文干眼病“Augendarre”的首字母）。隨著科學家們逐漸發(fā)現(xiàn)一些新的脂溶性物質(zhì)，到1920 年，維生素A才被正式提出。

維生素A，其化學式為C20H30O。根據(jù)側鏈連接官能團的不同（圖1），可以分為類異戊二烯家族的視黃醇，視黃醛和視黃酸等疏水化合物[1]。這類化合物在體內(nèi)既不是構成身體組織的基礎材料，也不是能量的來源，而是一類具有調(diào)節(jié)作用的營養(yǎng)素，在代謝中起重要作用。維生素A在視覺、生殖、免疫系統(tǒng)和上皮細胞分化、骨骼正常生長發(fā)育等多種生理功能過程中至關重要[2]。當體內(nèi)缺少維生素A 時會出現(xiàn)夜盲癥、免疫力下降、生長受限等問題[3]，維生素A缺乏癥是一個值得全球關注的健康問題[4]，據(jù)統(tǒng)計現(xiàn)有接近3億學齡前兒童缺乏維生素A[5]。

圖1 維生素A結構及功能Fig.1 Structure and function of vitamin A

20 世紀末，全世界食品藥品、營養(yǎng)保健品、化妝品、飼料等行業(yè)每年消耗的各種維生素原料的市值已達25 億美元。維生素A 主要應用于保健品、醫(yī)藥品、動物飼養(yǎng)等，是國際市場上用途廣泛、產(chǎn)銷量巨大的維生素品種，與維生素C、維生素E 并列為維生素系列三大支柱產(chǎn)品[6]。維生素A 目前市場上供貨緊缺，行業(yè)集中度較高，全球僅巴斯夫、帝斯曼、安迪蘇、新和成、金達威、浙江醫(yī)藥6 家維生素A 生產(chǎn)企業(yè)（表1）。

維生素A 生產(chǎn)方式主要包括天然提取、化學合成和微生物合成。天然提取維生素A主要從魚肝油中獲得，主要成分為視黃醇，但存在資源相對分散、步驟復雜且成本較高等問題，因此商品維生素A 大多數(shù)都是化學合成產(chǎn)品。維生素A的化學合成主要有瑞士Roche 和德國BASF 兩條合成工藝路線。兩者主要以β-紫羅蘭酮為起始原料，格氏反應為特征，選擇加氫等一系列步驟生成維生素A 醋酸酯[7]?；瘜W生產(chǎn)雖然可以大規(guī)模提供維生素A，緩解生產(chǎn)壓力，但為了減少產(chǎn)物的分解，多在最后進行酯化反應，很難滿足對維生素A組分的把控，同時由于國家對綠色發(fā)展的要求，化學合成也受到了限制。

隨著全世界對環(huán)保以及可持續(xù)發(fā)展的重視，我國提出了“雙碳”目標下的綠色轉型升級之路的要求，人們開始將代謝工程應用到化學物質(zhì)的生產(chǎn)，利用重組DNA、基因編輯等技術，對生物體的代謝網(wǎng)絡進行定向修飾和改造，目前已實現(xiàn)氨基酸[8]、有機酸[9]和維生素[10-11]等產(chǎn)品的生物合成。近些年，維生素A 的生物合成已經(jīng)有了很大進展。基于此，本文主要綜述近年來維生素A 生物合成的相關情況，包括基本路徑優(yōu)化策略和發(fā)酵儲存條件優(yōu)化策略，并分析維生素A 的市場需求和生物合成前景，最后對生物合成維生素A 的現(xiàn)狀進行總結與展望。

1 維生素A生物合成途徑研究進展

1.1 維生素A的天然合成研究

天然維生素A 主要存在于動物和魚類肝臟等，視黃醇大多存在于咸水魚和動物肝臟中，視黃醛常常存在于淡水魚肝臟中。維生素A的直接前體是天然類胡蘿卜素[12]，也稱其為維生素A 原[13]。β-胡蘿卜素作為主要的維生素A 原，其轉化為維生素A 主要有兩種途徑：偏心裂解和中心裂解[14-15]。偏心裂解是β-胡蘿卜素先轉變?yōu)棣?脫輔基-胡蘿卜醛，經(jīng)氧化變?yōu)橐朁S酸。而中心裂解是β-胡蘿卜素在β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶的作用下產(chǎn)生兩分子視黃醛，視黃醛經(jīng)氧化或者還原生成視黃酸或視黃醇。一般認為，β-胡蘿卜素轉化為維生素A 主要依靠中心裂解途徑[16]。β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶是一種溶解于細胞溶質(zhì)的酶，最早是從大鼠肝臟與腸道發(fā)現(xiàn)[17]。隨后的研究表明在一些動物的肝臟、肺、腎臟和皮膚組織中也存在該基因[18-19]，但在人類的肝臟中未發(fā)現(xiàn)[20]。很多生物體內(nèi)含有β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶且含量可觀，例如斑馬魚[21]、老鼠[22]、果蠅[23]和人類[24]。

維生素A 的合成過程主要有以下步驟（圖2）：第一步是通過β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶切割β-胡蘿卜素，合成視黃醛；第二步是在視黃醛脫氫酶或視黃醛還原酶催化下氧化或還原視黃醛，分別生成視黃酸或視黃醇[25]。在一些生物體內(nèi)還會發(fā)生第三步，即卵磷脂視黃醇?；D移酶LRAT 在視黃醇結合蛋白CRBP 的轉運下[26]，將視黃醇的羥基末端脂肪酰基酯化合成視黃醇酯，從而達到視黃醇在體內(nèi)穩(wěn)定儲存的目的[27]。

圖2 維生素A生物合成路徑Erg10—乙酰輔酶a C-乙酰轉移酶;Erg13—羥甲基戊二酰輔酶a合酶;MVA—真核微生物和古細菌甲羥戊酸途徑;MEP—原核微生物2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑;Bts1—法尼基轉移酶;CrtE—GGPP合成酶;CrtB—八氫番茄紅素合成酶;CrtI—八氫番茄紅素脫氫酶;CrtY—番茄紅素β-環(huán)化酶;實線箭頭表示直接催化生成;虛線箭頭表示部分路徑信息省略;灰色標注表示維生素A合成基因Fig.2 Vitamin A biosynthetic pathway

β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶是主要的限速酶，關于該酶的性質(zhì)和作用方式已有前人報道。Devery等[28]從倉鼠得到的β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶，能夠將1 mol β-胡蘿卜素裂解成1.5～2 mol 的視黃醛。Nagao 等[29]研究發(fā)現(xiàn)豬腸中1 mol β-胡蘿卜素可以轉化1.88 mol 視黃醛，與摩爾比2.0 的理論值接近。此外，Kim 等[30]將經(jīng)過重組獲得的雞肝來源β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶通過His-Trap HP 和Resource Q層析純化，轉化得到了120%（mol∕mol）的產(chǎn)率。

β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶對于維生素A 的合成有著重要意義。Peck 等[31]通過分析鹽桿菌NRC-1 基因組功能，發(fā)現(xiàn)與野生菌株對比，敲除brp和blh基因后，細胞內(nèi)β-胡蘿卜素水平升高，視紫紅質(zhì)積累量下降，對于此現(xiàn)象，認為鹽生鹽桿菌中視紫紅質(zhì)和視黃醛的合成需要brp和blh，它們通過編碼類似的蛋白催化調(diào)節(jié)β-胡蘿卜素轉化為視黃醛。

1.2 維生素A的異源合成研究進展

隨著合成生物學技術的不斷成熟，細胞工廠逐漸應用于合成精細化學品和天然產(chǎn)物。以酵母和大腸桿菌為代表的模式生物具有遺傳操作簡單、代謝路徑清晰、生長速率快等特點，在進行異源合成路徑搭建時，此類底盤細胞會被優(yōu)先考慮，并針對不同的天然產(chǎn)物開發(fā)特有的代謝改造途徑。

在鑒定完維生素A 的生物合成關鍵基因后，目前已采取多種策略在異源底盤細胞實現(xiàn)維生素A的生產(chǎn)（表2）。Kim 等[32]成功地通過使用大腸桿菌系統(tǒng)優(yōu)化反應條件表達活性酶進而實現(xiàn)工業(yè)酶法生產(chǎn)視黃醛，此外純化的酶顯示出最高比活性0.51 U∕mg。Jang 等[33]在大腸桿菌中構建維生素A 合成路徑，并且對β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶來源進行篩選，基于海洋細菌66A03的細菌視紫紅質(zhì)蛋白類似物Blh合成視黃醇合成蛋白SR，結果表明SR顯示出最高的β-胡蘿卜素裂解活性，細胞內(nèi)沒有殘留的β-胡蘿卜素。在大腸桿菌原有2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑（methylerythritol-4-phosphate pathway，MEP）的前提下，為了提高代謝通量，引入外源甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway，MVA），產(chǎn)生了8.7 mg∕L 的視黃醛，產(chǎn)量提高4 倍。同時還發(fā)現(xiàn)視黃醇和乙酸維甲酸酯視黃醛衍生物的存在。為了防止細胞內(nèi)維生素A 通過原位提取發(fā)生降解，發(fā)酵時采用了含有十二烷有機相的兩相培養(yǎng)系統(tǒng)，經(jīng)過72 h 搖瓶發(fā)酵，維生素A 產(chǎn)量達到136 mg∕L。Sun等[38]首次實現(xiàn)在釀酒酵母中維生素A的生產(chǎn)，通過將β-胡蘿卜素生物合成途徑和β-胡蘿卜素15，15'-氧化酶（BCMO）編碼基因blh引入釀酒酵母，最終獲得的維生素A 產(chǎn)量為3350 mg∕L，其中包括2094 mg∕L 視黃醛和1256 mg∕L 視黃醇。Han 等[34]構建維甲酸生物合成途徑，引入兩個異源基因blhSR和RALDH2，實現(xiàn)模塊化表達，刪除內(nèi)源編碼醛還原酶的ybbO基因，采用mRNA 穩(wěn)定區(qū)工程方法，利用mRNA 穩(wěn)定序列對基因blhSR和raldhHS的50 個非翻譯區(qū)進行了工程化，提高mRNA 表達水平，最后在生物反應器中優(yōu)化維甲酸生產(chǎn)菌的培養(yǎng)條件（溫度、pH、氧濃度），視黃酸產(chǎn)量達到（8.20±0.05）mg∕L。

表2 維生素A相關的代謝工程改造進展Table 2 Progress in metabolic engineering transformation related to vitamin A

2 維生素A的生物合成優(yōu)化

2.1 前體β-胡蘿卜素合成路徑的優(yōu)化

目前已經(jīng)從自然界中分離出來600多種天然類胡蘿卜素，其中約有50 種具有維生素A 原活性[41]。β-胡蘿卜素具有對稱分子結構，由兩個尾部相連的視黃醇分子構成，因此β-胡蘿卜素是最具有維生素A原活性的前體物質(zhì)。

β-胡蘿卜素的產(chǎn)量對于維生素A 的生產(chǎn)起著直接作用。生產(chǎn)β-胡蘿卜素不僅需要加強底物到目標產(chǎn)物的代謝，還需要減少不必要的副產(chǎn)品或中間代謝產(chǎn)物的積累。CrtE、CrtI、CrtZ 和CrtW 是經(jīng)常被改造的限速酶[42]。Yamada等[43]通過使用來自酵母Xanthophyllomyces dendrorhous的CrtE，CrtYB和CrtI重復三輪δ 整合構建了工程菌株YPH499∕Mo3Crt79，在96 h 內(nèi)產(chǎn)生52.3 mg∕L 的β-胡蘿卜素，其值比CrtE，CrtYB和CrtI共表達的菌株更高。Larroude 等[44]通過篩選每個轉錄單位的最佳啟動子-基因對，最終使耶氏解脂酵母中β-胡蘿卜素的產(chǎn)量達到了6.5 g∕L（89.6 mg∕g DCW）。Wang 等[45]利用易錯PCR構建轉錄因子Yl-SPT15的突變文庫，調(diào)控胞內(nèi)脂質(zhì)積累，使β-胡蘿卜素產(chǎn)量較原始菌株提高了4.7 倍。Zhao 等[46]考慮到釀酒酵母對于β-胡蘿卜素和親脂性化合物的生產(chǎn)能力有限，在底盤細胞內(nèi)調(diào)節(jié)了脂質(zhì)代謝路徑[圖3(a)]，結果顯示，磷脂酸磷酸酶（PAP）基因PAH1、DPP1、LPP1的缺失以及甾醇酯合成基因ARE1和ARE2的過度表達都可以增加β-胡蘿卜素的積累，通過結合這兩種策略，YZ30 菌株產(chǎn)生了8.98 mg∕g 干細胞重量的β-胡蘿卜素，比起始菌株YZ03 高2.4 倍，這意味著脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)可以影響親脂性β-胡蘿卜素的生物合成。Ma 等[47]發(fā)現(xiàn)番茄紅素環(huán)化酶的底物抑制可能是工程微生物生產(chǎn)化學品的主要障礙，為此采取了兩種手段，通過完全失去底物抑制而不降低酶活性為結構導向對CarRB 酶進行突變，獲得最佳突變體Y27R[圖3(b)]；通過建立轉移代謝流量使其遠離抑制性代謝物香葉基焦磷酸合酶介導的流量限制器[圖3(c)]，既高效形成產(chǎn)物，又可以免于底物抑制的困擾，得到了一株β-胡蘿卜素生產(chǎn)率0.165 g∕(L·h)的菌株（比初始菌株提高1441 倍），產(chǎn)量為39.5 g∕L。

圖3 維生素A前體β-胡蘿卜素生物合成策略Are1,Are2—甾醇酰基轉移酶;pah1,lpp1,dpp1—磷脂酸磷酸酶;PA—磷脂酸;DAG—二?；视?TAG—三?；视?SE—甾醇酯;FPP—法呢基焦磷酸;GGPP—牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸;R—酶結構域Fig.3 Biosynthesis strategy of vitamin A precursor β-carotene

2.2 輔因子優(yōu)化改造策略

維生素A 組分之間的轉化多為氧化還原反應，氧化還原輔酶在路徑代謝中發(fā)揮著重要的作用，細胞內(nèi)的生物轉化包含大量的反應并且需要特定的輔因子，而輔因子不足常常是限制因素，因此維持細胞內(nèi)輔酶的平衡對于細胞的生長和產(chǎn)物的積累有著重要的意義。在輔因子家族中[48]，氧化還原輔因子煙酰胺腺嘌呤二核苷酸[NAD（H）]和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[NADP（H）]能夠維持氧化還原的平衡并以電子載體的形式提升酶的催化性能，參與多個化學反應，酵母中僅與NADPH 相關的反應就超過100 個，大腸桿菌中存在80 個NADPH 相關的酶[49]，因此調(diào)控氧化還原輔因子代謝成為優(yōu)化生物反應的重要手段[50]。

釀酒酵母中NADPH 的產(chǎn)生來源主要是磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）的氧化部分以及異檸檬酸脫氫酶、乙醛脫氫酶和蘋果酸酶的催化反應。但是操作PPP氧化部分實現(xiàn)NADPH上升，會消耗碳源導致產(chǎn)量下降。此外，中心代謝還可能會對細胞整體的代謝造成較大影響，而通過引入單獨靶向輔因子的酶可以精準調(diào)控輔因子水平[51]。Lee等[39]在構建一株高效生產(chǎn)視黃醇的酵母菌株時，通過對發(fā)酵產(chǎn)物甘油產(chǎn)量的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)存在氧化還原失衡的問題[圖4(a)]，引入乳球菌來源的NADH氧化酶的noxE，改造后的菌株甘油下降52%，視黃醇產(chǎn)量上升30%。Hu等[40]在選擇生產(chǎn)維生素A親本菌株時就考慮到了過表達截短的Hmg1（tHmg1），提升了異戊烯基焦磷酸鹽（IPP）∕二甲基烯丙基焦磷酸鹽（DMAPP）的比率，增大了MVA 路徑的通量，該過程NADPH 作為輔助因子。除此之外，在親本菌株中分別過表達NADP（H）氧化還原酶Zwf1 和YMR315W 及其轉錄因子Stb5，線粒體NADH 激酶Pos5，以及切除17 位氨基酸線粒體信號肽后的tPos5，結果顯示，過表達tPos5效果最明顯，視黃醇產(chǎn)量達到47.01 mg∕L，這意味著NADPH參與了內(nèi)源性脫氫酶將視黃醛轉化為視黃醇的過程。

E.coli作為研究最常用的模式生物之一，磷酸戊糖途徑（PPP）[52]、三羧酸循環(huán)（TCA）和轉氫酶系統(tǒng)是NADPH再生的三個主要來源，這三種途徑已成為提高NADPH 利用率的常用方法[53-54]。Satowa 等[55]通過敲除編碼磷酸葡萄糖異構酶的pgi基因，增加了細胞中的NADPH∕NADP+比率，促進了NADPH 再生。Xiong 等[56]將在生產(chǎn)ε-己內(nèi)酯的大腸桿菌表達了乙醇脫氫酶（ADH）與環(huán)己酮氧化酶（CHMO），獲得了一個自給自足的NADPH 輔因子再生系統(tǒng)[圖4(b)]，實現(xiàn)126 mmol∕Lε-己內(nèi)酯的生產(chǎn)，摩爾產(chǎn)率高達0.78 mol∕mol。Du等[57]通過將來自枯草芽孢桿菌168的NADP+依賴性gapB和來自大腸桿菌MG1655的NAD 激酶yfjB，進一步加強細胞內(nèi)NADPH 供應，該策略使細胞內(nèi)NADPH 量增加了134.4%。維生素A產(chǎn)物的生物合成涉及多個氧化還原反應，NADPH作為參與此類反應的通用輔因子，其調(diào)控策略可以運用到維生素A 的生物合成中，提升維生素A 的生物合成效果。

圖4 維生素A輔因子改造優(yōu)化策略ADH—乙醇脫氫酶;CHMO—環(huán)己酮氧化酶;ACS1—乙酰輔酶連接酶1;ZWF1—葡萄糖-6-磷酸脫氫酶;noxE—NADH氧化酶;NADH—煙酰胺腺嘌呤二核苷酸;NADPH—煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸Fig.4 Optimization strategy of vitamin A cofactor transformation

2.3 維生素A的組分調(diào)控

維生素A是由四個具有環(huán)狀端基的類異戊二烯單元組成的化合物，端基的變化產(chǎn)生了不同類別的化合物[58]。由于不同組分的存在，維生素在機體發(fā)揮著多樣的功能，視黃醇用于制造食品、藥品、營養(yǎng)品和動物飼料添加劑等；視黃醛參與視覺循環(huán)[59]；視黃酸可以保護成纖維細胞和其他皮膚細胞免受紫外線輻射（會引起皮膚損傷）[60]；視黃酯是一種更穩(wěn)定的視黃醇酯化形式，作為一種高效的抗衰老劑，是醫(yī)藥和化妝品中的活性成分[61]，因此對于維生素A組分調(diào)控的研究意義重大[圖5(a)]。

早在2015 年，Jang 等[37]在大腸桿菌中整合了β-胡蘿卜素生物合成途徑和BCMO 基因，構建了維生素A 的合成路徑。由于大腸桿菌內(nèi)源氧化還原酶ybbO 和編碼氯霉素乙酰轉移酶的氯霉素抗性基因cat的非特異性活性，同時也產(chǎn)生視黃醇和視黃醇醋酸酯。作者通過在重組大腸桿菌中增加ybbO基因的拷貝數(shù)和敲除cat基因，最終實現(xiàn)視黃醛、視黃醇、視黃醇醋酸酯的比例為6%、88%、6%，這表明未來選擇性生產(chǎn)維甲酸的可行性。Choi等[35]篩選了三個編碼β-胡蘿卜素裂解酶的基因：blh、brp和bcox，采用mRNA 穩(wěn)定區(qū)工程提高blh 催化效率，測試UTR12，UTR37 和UTR46 合成調(diào)控序列，以促進視黃醇的合成，共同表達合成視黃基棕櫚酸酯路徑基因LRAT和CRBP，最終視黃基棕櫚酸酯產(chǎn)量為（69.96±2.64）mg∕L。Lee 等[39]在一株生產(chǎn)維生素A 的釀酒酵母中表達了人來源的RDH10和RDH12以及大腸桿菌來源的ybbO視黃醇脫氫酶，結果顯示攜帶人來源RDH12的釀酒酵母視黃醛全部轉化為視黃醇，產(chǎn)量為97.09 mg∕L。2022 年，Hu 等[40]在NCBI 基于與ybbO 的同源性選擇了酵母內(nèi)源的fSps19、YMR226C、Ifa38和Env9（同源性分別為：25.62%、41.34%、31.49%和29.49%）和來自M.tratuosa物種的AKR、AKR1B10 氧化還原酶以及大腸桿菌來源的ybbO基因進行測試，結果顯示大腸桿菌來源的ybbO可以使95.79%的視黃醛轉化為視黃醇。當Env9過表達時，視黃醇的產(chǎn)量明顯提高，達到83.63 mg∕L，這表明釀酒酵母中Env9 具有視黃醛還原酶活性[圖5(b)]。除此之外，當酵母內(nèi)源Env9與大腸桿菌ybbO同時過表達時，視黃醇的產(chǎn)量高達115.28 mg∕L。

圖5 維生素A組分調(diào)控優(yōu)化策略RDH—視黃醇脫氫酶;ADH—乙醇脫氫酶;BCMO—β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶;LRAT—卵磷脂視黃醇?；D移酶;SR8A—維生素A酵母生產(chǎn)出發(fā)菌株1;RDH10—人來源視黃醇脫氫酶10;ybbO—NADP+依賴型醛還原酶;RDH12—人來源視黃醇脫氫酶12;Y03—維生素A酵母生產(chǎn)出發(fā)菌株2;sps19—2,4-二烯酰輔酶a還原酶;Ifa38—極長鏈3-氧代?；o酶a還原酶;Env9—短鏈乙醇脫氫酶Fig.5 Optimization strategy of vitamin A component regulation

當?shù)妆P細胞引入β-胡蘿卜素生物合成途徑和β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶時，β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶可以將一分子的β-胡蘿卜素切割成兩個視黃醛分子，由于胞內(nèi)氧化還原酶非特異性催化，視黃醛可以少量轉化為視黃醇和視黃酯[38]。為了增強此過程的轉化，可以通過挖掘和改造的方式獲取更優(yōu)異的候選酶，增加基因的拷貝數(shù)和采用不同強度的啟動子等策略。

2.4 維生素A的生物發(fā)酵優(yōu)化

發(fā)酵產(chǎn)量受多種因素影響，包括生產(chǎn)菌株、培養(yǎng)基組成（碳源、氮源和離子種類等）、發(fā)酵條件（pH、溫度、攪拌速度和溶氧）以及發(fā)酵模式（分批、補料分批和連續(xù)發(fā)酵）[62]。為實現(xiàn)高效生產(chǎn)以滿足商業(yè)需求，維生素A 生產(chǎn)菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化具有重要意義。

由于葡萄糖具有被吸收速度快的特性，它是所有微生物的主要碳源。除葡萄糖外，近些年來以其他糖或者碳水化合物作為碳源的微生物細胞工廠也取得了進展。其中木糖作為新興碳源，是木質(zhì)纖維素的組成成分，與葡萄糖作為碳源相比，釀酒酵母在利用木糖時，提高了細胞質(zhì)內(nèi)乙酰輔酶A 的通量。Sun 等[38]在酵母菌株SR8A 引入木糖代謝途徑和維生素A生產(chǎn)路徑，當以木糖為碳源時，其生長比使用葡萄糖時高57%，乙醇積累量微乎其微，產(chǎn)生60.90 mg∕L β-胡蘿卜素和20.74 mg∕L 維生素A，是葡萄糖條件下生產(chǎn)水平的3 倍和5 倍。同時SR8A菌株木糖中麥角甾醇的含量高于葡萄糖（21.48vs17.32 mg麥角甾醇∕g DCW），再次證實了木糖條件下乙酰輔酶A 的供應以及MVA 途徑的代謝通量高于葡萄糖條件（表3）。

表3 維生素A生產(chǎn)下游改造策略Table 3 The downstream transformation strategy of vitamin A production

維生素A 屬于親脂性化合物，通過細胞膜的低滲透性和低溶解度阻礙產(chǎn)物分泌到胞外。油和表面活性劑常常被添加到親脂性化合物發(fā)酵過程，調(diào)節(jié)菌株生長和生產(chǎn)產(chǎn)物過程[63]。Sun 等[38]發(fā)現(xiàn)維生素A 生產(chǎn)菌株加入十二烷時，促進β-胡蘿卜素向維生素A 的轉化，維生素A 產(chǎn)量比對照組高出2～4 倍。考慮到十二烷用于維生素A工業(yè)生產(chǎn)的可行性和安全問題，Sun等通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中以1∶1的體積比添加橄欖油，發(fā)現(xiàn)工程菌的發(fā)酵曲線和產(chǎn)品產(chǎn)量情況與使用十二烷時相似，證明了橄欖油替代十二烷提取維生素A 的可行性，橄欖油可能比十二烷更適合用于營養(yǎng)、醫(yī)藥和化妝品產(chǎn)品。Lee等[36]發(fā)現(xiàn)表面活性劑Span80 濃度保持10 g∕L 時，對細胞生長最有效，細胞積累量為15.2 g∕L，比不含Span80 的培養(yǎng)基高2.7倍。

催化β-胡蘿卜素轉化為視黃醛的β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶，在酶催化時，F(xiàn)e2+協(xié)調(diào)His-21、His-78、His-188 和His-192 活性位點[64]。Hu 等[40]考慮到亞鐵離子在空氣中容易被氧化為三價鐵離子，在發(fā)酵36 h 后向培養(yǎng)物中添加1.44 mmol∕L Fe2+以保持blh 的催化活性。結果顯示，β-胡蘿卜素的積累減少，視黃醇產(chǎn)量進一步提高9.03%，達到443.43 mg∕L，占總維生素A的98.76%。

確定最佳生產(chǎn)工藝對于商業(yè)化生產(chǎn)至關重要，傳統(tǒng)的發(fā)酵優(yōu)化方法需要對每個因素進行單獨處理，存在費力、不完整和耗時等弊端?，F(xiàn)在新興的實驗析因設計可用于研究相互作用的因素，已成功應用于生物制造工藝的優(yōu)化[65-66]，未來可以與維生素A細胞工廠優(yōu)化結合，有望提高其生產(chǎn)效率。

2.5 維生素A儲存條件優(yōu)化

視黃醇作為一種抗氧化劑，由于其結構中存在連續(xù)的共軛雙鍵，當暴露在光、熱和空氣中，容易被氧化或異構化[67]。在一項關于維生素A抵抗UVA和UVB 射線的實驗中，與固體脂質(zhì)納米粒、環(huán)糊精包合物和聚合物包封相比，抗氧化劑丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）表現(xiàn)出優(yōu)異的保護功能[68]，添加BHT是防止視黃醇降解的簡單、經(jīng)濟和安全的方法[69]。

Hu 等[40]在多株工程改造的維生素A 酵母生產(chǎn)菌中添加抗氧化劑BHT，可以有效阻止視黃醇的氧化，顯著提高維生素A 中視黃醇占比，并且維生素A總體產(chǎn)量也有所提升。在生產(chǎn)菌Y03-43 中加入BHT 后視黃醇產(chǎn)量達到401.65 mg∕L，這表明抗氧化劑對視黃醇易氧化產(chǎn)品生產(chǎn)及存儲的必要性[圖6(a)]。為了測試其他抗氧化劑是否對維生素A 生成具有促進作用，Hu 等[40]研究了其他疏水性抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚（butyl hydroxyanisole，BHA）、綠茶多酚（green tea polyphenol，GTP）和沒食子酸丙酯（propyl gallate，PG）對菌株生產(chǎn)維生素A 的影響，發(fā)現(xiàn)BHA 嚴重損害了細胞的生長，而GTP 和PG 也降低了兩株試驗菌株的單位OD，但GTP 和PG 的加入提高了維生素A 的產(chǎn)量，該研究意味著在實際生產(chǎn)中有必要選擇對細胞生長影響較小的抗氧化劑。

Chmykh 等[70]發(fā)現(xiàn)用脂質(zhì)體包封可提高視黃醇的穩(wěn)定性[圖6(b)]，在這項研究中，比較了在紫外線或標準室內(nèi)空氣條件下，視黃醇在添加和不添加抗氧化劑的磷脂酰膽堿脂質(zhì)體中的穩(wěn)定性。BHT 和專有混合物（StoppOx）都將穩(wěn)定性從小于10 d 提高到30 d 以上。在紫外線照射下，StoppOx 保護視黃醇的時間明顯長于BHT。

圖6 維生素A儲存條件優(yōu)化策略Fig.6 Optimal strategy of vitamin A storage conditions

由于視黃醇對光和氧高度敏感，紫外線會導致其降解成各種潛在的有害產(chǎn)品，輻照后的視黃醇也能激活光敏劑，如葉綠素、孟加拉玫瑰紅或核黃素[71]，這些產(chǎn)品可能直接或間接損害DNA 和細胞膜，因此視黃醇儲存條件的優(yōu)化十分必要。

3 維生素A 的市場需求和生物合成前景

隨著對維生素A 的研究越來越深入，其在市場上的需求量也越來越大[圖7(a)]。據(jù)中國產(chǎn)業(yè)信息網(wǎng)統(tǒng)計，2018 年全球維生素A 需求量約2.7 萬噸，較2017 年增長約5%，需求與產(chǎn)能比約為73%。假設2019～2022 年維生素A 需求量仍以5%的增速增長，則2022 年全球需求量約能達到3.3 萬噸，2022 年全球市場規(guī)模將達到約10億美元[圖7(b)]。

圖7 維生素A市場供應情況Fig.7 Market supply of vitamin A

維生素A 雖然可以從動物組織中提取，但資源分散、步驟繁雜、成本高，目前維生素A 主要依靠化學合成。Roche 工藝技術成熟、收率穩(wěn)定，但其缺陷是原輔材料多達40 種，反應步驟多，導致整體收率較低。BASF 工藝反應步驟少，工藝路線短，收率較高，但其核心技術難點Witting 乙炔化反應條件嚴苛，且該工藝中原料三苯基膦價格較高。

以可再生的糖為原料，微生物發(fā)酵生產(chǎn)維生素A可能比基于石化的生產(chǎn)工藝更具有成本效益和環(huán)境友好等優(yōu)點。釀酒酵母工業(yè)生產(chǎn)維生素A具有優(yōu)越性，包括易于遺傳操作、方便規(guī)模發(fā)酵，目前維生素A 最高生產(chǎn)水平為在酵母細胞發(fā)酵120 h，維生素A 總 量 為2542.68 mg∕L，由97.51% 的 視 黃 醇（2479.34 mg∕L）和2.49%的維甲酸（63.34 mg∕L）組成，為工業(yè)化生產(chǎn)維生素A 提供了新的工程策略[40]。除此之外，Lee等[39]在使用橄欖油為萃取劑進行兩相木糖培養(yǎng)時，發(fā)酵后獲得含有166 IU∕ml維生素A 的橄欖油，可以被用作富含維生素A的營養(yǎng)品，提供了維生素A副產(chǎn)品的發(fā)展思路和策略。

4 總結與展望

維生素A 是人體必需的維生素，在維持視覺功能、調(diào)節(jié)細胞分化和凋亡、穩(wěn)定上皮細胞形態(tài)和功能方面發(fā)揮著重要作用，可用作保健品、護膚品以及飼料營養(yǎng)素等，具有廣闊的市場前景以及巨大的經(jīng)濟價值。

近年來，隨著合成生物學、代謝工程、DNA 測序和組學分析等技術的快速發(fā)展，利用微生物構建細胞工廠合成維生素A 已經(jīng)取得很大進展，但仍有很多挑戰(zhàn)，如對天然合成途徑及其中關鍵酶的認識較為淺薄，異源途徑與底盤細胞環(huán)境的不適配，細胞工廠的生產(chǎn)能力與工業(yè)需求還存在差距等。

為了進一步提高微生物生產(chǎn)維生素A 的能力，可以采取以下方法：（1）通過對維生素A天然生產(chǎn)者的轉錄組、蛋白質(zhì)組等深入研究，全面了解代謝網(wǎng)絡和調(diào)控機制；（2）解析異源路徑與底盤細胞之間的適配機制，通過代謝調(diào)控提高元件、模塊、途徑與底盤之間的適配性；（3）分析維生素A此類親脂性化合物在底盤細胞中合成后的儲存和轉運機制，最大化利用胞內(nèi)資源，從而在細胞自身代謝和異源產(chǎn)物合成中達到平衡，減少細胞的代謝壓力，提高生產(chǎn)的可持續(xù)性；（4）搭建高通量、自動化以及智能化的合成生物學平臺，多學科多領域交叉分析，如統(tǒng)計和數(shù)學方法結合產(chǎn)生的集合響應面法（response surface methodology，RSM）和 人 工 神 經(jīng) 網(wǎng) 絡（artificial neural network，ANN）[72]，實現(xiàn)對代謝產(chǎn)物的實時監(jiān)測，挖掘更多的代謝改造靶點，進而提升異源合成的效率，構建高效、穩(wěn)定、可控的生產(chǎn)維生素A的微生物細胞工廠。