王欣慧，王穎，姚明東，肖文海

（1 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072； 2 天津大學(xué)合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心和系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300072； 3 天津大學(xué)前沿技術(shù)研究院，天津 301700）

引 言

維生素A（vitamin A，VA）是首個被發(fā)現(xiàn)，并且在人體正常代謝網(wǎng)絡(luò)中不可缺少，同時也是容易缺乏的脂溶性維生素。早在1000多年前，中國唐代醫(yī)學(xué)家孫思邈在其著作《千金方》中就記載了動物肝臟可用于治療夜盲，而巴西人發(fā)現(xiàn)魚肝油可以治療干眼病。當(dāng)時人們對維生素并不了解，由于它是一種黃色黏稠的液體，因此其被命名成“脂溶性A”（A是德文干眼病“Augendarre”的首字母）。隨著科學(xué)家們逐漸發(fā)現(xiàn)一些新的脂溶性物質(zhì)，到1920 年，維生素A才被正式提出。

維生素A，其化學(xué)式為C20H30O。根據(jù)側(cè)鏈連接官能團(tuán)的不同（圖1），可以分為類異戊二烯家族的視黃醇，視黃醛和視黃酸等疏水化合物[1]。這類化合物在體內(nèi)既不是構(gòu)成身體組織的基礎(chǔ)材料，也不是能量的來源，而是一類具有調(diào)節(jié)作用的營養(yǎng)素，在代謝中起重要作用。維生素A在視覺、生殖、免疫系統(tǒng)和上皮細(xì)胞分化、骨骼正常生長發(fā)育等多種生理功能過程中至關(guān)重要[2]。當(dāng)體內(nèi)缺少維生素A 時會出現(xiàn)夜盲癥、免疫力下降、生長受限等問題[3]，維生素A缺乏癥是一個值得全球關(guān)注的健康問題[4]，據(jù)統(tǒng)計現(xiàn)有接近3億學(xué)齡前兒童缺乏維生素A[5]。

圖1 維生素A結(jié)構(gòu)及功能Fig.1 Structure and function of vitamin A

20 世紀(jì)末，全世界食品藥品、營養(yǎng)保健品、化妝品、飼料等行業(yè)每年消耗的各種維生素原料的市值已達(dá)25 億美元。維生素A 主要應(yīng)用于保健品、醫(yī)藥品、動物飼養(yǎng)等，是國際市場上用途廣泛、產(chǎn)銷量巨大的維生素品種，與維生素C、維生素E 并列為維生素系列三大支柱產(chǎn)品[6]。維生素A 目前市場上供貨緊缺，行業(yè)集中度較高，全球僅巴斯夫、帝斯曼、安迪蘇、新和成、金達(dá)威、浙江醫(yī)藥6 家維生素A 生產(chǎn)企業(yè)（表1）。

維生素A 生產(chǎn)方式主要包括天然提取、化學(xué)合成和微生物合成。天然提取維生素A主要從魚肝油中獲得，主要成分為視黃醇，但存在資源相對分散、步驟復(fù)雜且成本較高等問題，因此商品維生素A 大多數(shù)都是化學(xué)合成產(chǎn)品。維生素A的化學(xué)合成主要有瑞士Roche 和德國BASF 兩條合成工藝路線。兩者主要以β-紫羅蘭酮為起始原料，格氏反應(yīng)為特征，選擇加氫等一系列步驟生成維生素A 醋酸酯[7]?；瘜W(xué)生產(chǎn)雖然可以大規(guī)模提供維生素A，緩解生產(chǎn)壓力，但為了減少產(chǎn)物的分解，多在最后進(jìn)行酯化反應(yīng)，很難滿足對維生素A組分的把控，同時由于國家對綠色發(fā)展的要求，化學(xué)合成也受到了限制。

隨著全世界對環(huán)保以及可持續(xù)發(fā)展的重視，我國提出了“雙碳”目標(biāo)下的綠色轉(zhuǎn)型升級之路的要求，人們開始將代謝工程應(yīng)用到化學(xué)物質(zhì)的生產(chǎn)，利用重組DNA、基因編輯等技術(shù)，對生物體的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行定向修飾和改造，目前已實現(xiàn)氨基酸[8]、有機(jī)酸[9]和維生素[10-11]等產(chǎn)品的生物合成。近些年，維生素A 的生物合成已經(jīng)有了很大進(jìn)展?；诖耍疚闹饕C述近年來維生素A 生物合成的相關(guān)情況，包括基本路徑優(yōu)化策略和發(fā)酵儲存條件優(yōu)化策略，并分析維生素A 的市場需求和生物合成前景，最后對生物合成維生素A 的現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)與展望。

1 維生素A生物合成途徑研究進(jìn)展

1.1 維生素A的天然合成研究

天然維生素A 主要存在于動物和魚類肝臟等，視黃醇大多存在于咸水魚和動物肝臟中，視黃醛常常存在于淡水魚肝臟中。維生素A的直接前體是天然類胡蘿卜素[12]，也稱其為維生素A 原[13]。β-胡蘿卜素作為主要的維生素A 原，其轉(zhuǎn)化為維生素A 主要有兩種途徑：偏心裂解和中心裂解[14-15]。偏心裂解是β-胡蘿卜素先轉(zhuǎn)變?yōu)棣?脫輔基-胡蘿卜醛，經(jīng)氧化變?yōu)橐朁S酸。而中心裂解是β-胡蘿卜素在β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶的作用下產(chǎn)生兩分子視黃醛，視黃醛經(jīng)氧化或者還原生成視黃酸或視黃醇。一般認(rèn)為，β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為維生素A 主要依靠中心裂解途徑[16]。β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶是一種溶解于細(xì)胞溶質(zhì)的酶，最早是從大鼠肝臟與腸道發(fā)現(xiàn)[17]。隨后的研究表明在一些動物的肝臟、肺、腎臟和皮膚組織中也存在該基因[18-19]，但在人類的肝臟中未發(fā)現(xiàn)[20]。很多生物體內(nèi)含有β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶且含量可觀，例如斑馬魚[21]、老鼠[22]、果蠅[23]和人類[24]。

維生素A 的合成過程主要有以下步驟（圖2）：第一步是通過β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶切割β-胡蘿卜素，合成視黃醛；第二步是在視黃醛脫氫酶或視黃醛還原酶催化下氧化或還原視黃醛，分別生成視黃酸或視黃醇[25]。在一些生物體內(nèi)還會發(fā)生第三步，即卵磷脂視黃醇?；D(zhuǎn)移酶LRAT 在視黃醇結(jié)合蛋白CRBP 的轉(zhuǎn)運下[26]，將視黃醇的羥基末端脂肪?；セ铣梢朁S醇酯，從而達(dá)到視黃醇在體內(nèi)穩(wěn)定儲存的目的[27]。

圖2 維生素A生物合成路徑Erg10—乙酰輔酶a C-乙酰轉(zhuǎn)移酶;Erg13—羥甲基戊二酰輔酶a合酶;MVA—真核微生物和古細(xì)菌甲羥戊酸途徑;MEP—原核微生物2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑;Bts1—法尼基轉(zhuǎn)移酶;CrtE—GGPP合成酶;CrtB—八氫番茄紅素合成酶;CrtI—八氫番茄紅素脫氫酶;CrtY—番茄紅素β-環(huán)化酶;實線箭頭表示直接催化生成;虛線箭頭表示部分路徑信息省略;灰色標(biāo)注表示維生素A合成基因Fig.2 Vitamin A biosynthetic pathway

β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶是主要的限速酶，關(guān)于該酶的性質(zhì)和作用方式已有前人報道。Devery等[28]從倉鼠得到的β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶，能夠?qū)? mol β-胡蘿卜素裂解成1.5～2 mol 的視黃醛。Nagao 等[29]研究發(fā)現(xiàn)豬腸中1 mol β-胡蘿卜素可以轉(zhuǎn)化1.88 mol 視黃醛，與摩爾比2.0 的理論值接近。此外，Kim 等[30]將經(jīng)過重組獲得的雞肝來源β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶通過His-Trap HP 和Resource Q層析純化，轉(zhuǎn)化得到了120%（mol∕mol）的產(chǎn)率。

β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶對于維生素A 的合成有著重要意義。Peck 等[31]通過分析鹽桿菌NRC-1 基因組功能，發(fā)現(xiàn)與野生菌株對比，敲除brp和blh基因后，細(xì)胞內(nèi)β-胡蘿卜素水平升高，視紫紅質(zhì)積累量下降，對于此現(xiàn)象，認(rèn)為鹽生鹽桿菌中視紫紅質(zhì)和視黃醛的合成需要brp和blh，它們通過編碼類似的蛋白催化調(diào)節(jié)β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為視黃醛。

1.2 維生素A的異源合成研究進(jìn)展

隨著合成生物學(xué)技術(shù)的不斷成熟，細(xì)胞工廠逐漸應(yīng)用于合成精細(xì)化學(xué)品和天然產(chǎn)物。以酵母和大腸桿菌為代表的模式生物具有遺傳操作簡單、代謝路徑清晰、生長速率快等特點，在進(jìn)行異源合成路徑搭建時，此類底盤細(xì)胞會被優(yōu)先考慮，并針對不同的天然產(chǎn)物開發(fā)特有的代謝改造途徑。

在鑒定完維生素A 的生物合成關(guān)鍵基因后，目前已采取多種策略在異源底盤細(xì)胞實現(xiàn)維生素A的生產(chǎn)（表2）。Kim 等[32]成功地通過使用大腸桿菌系統(tǒng)優(yōu)化反應(yīng)條件表達(dá)活性酶進(jìn)而實現(xiàn)工業(yè)酶法生產(chǎn)視黃醛，此外純化的酶顯示出最高比活性0.51 U∕mg。Jang 等[33]在大腸桿菌中構(gòu)建維生素A 合成路徑，并且對β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶來源進(jìn)行篩選，基于海洋細(xì)菌66A03的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白類似物Blh合成視黃醇合成蛋白SR，結(jié)果表明SR顯示出最高的β-胡蘿卜素裂解活性，細(xì)胞內(nèi)沒有殘留的β-胡蘿卜素。在大腸桿菌原有2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑（methylerythritol-4-phosphate pathway，MEP）的前提下，為了提高代謝通量，引入外源甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway，MVA），產(chǎn)生了8.7 mg∕L 的視黃醛，產(chǎn)量提高4 倍。同時還發(fā)現(xiàn)視黃醇和乙酸維甲酸酯視黃醛衍生物的存在。為了防止細(xì)胞內(nèi)維生素A 通過原位提取發(fā)生降解，發(fā)酵時采用了含有十二烷有機(jī)相的兩相培養(yǎng)系統(tǒng)，經(jīng)過72 h 搖瓶發(fā)酵，維生素A 產(chǎn)量達(dá)到136 mg∕L。Sun等[38]首次實現(xiàn)在釀酒酵母中維生素A的生產(chǎn)，通過將β-胡蘿卜素生物合成途徑和β-胡蘿卜素15，15'-氧化酶（BCMO）編碼基因blh引入釀酒酵母，最終獲得的維生素A 產(chǎn)量為3350 mg∕L，其中包括2094 mg∕L 視黃醛和1256 mg∕L 視黃醇。Han 等[34]構(gòu)建維甲酸生物合成途徑，引入兩個異源基因blhSR和RALDH2，實現(xiàn)模塊化表達(dá)，刪除內(nèi)源編碼醛還原酶的ybbO基因，采用mRNA 穩(wěn)定區(qū)工程方法，利用mRNA 穩(wěn)定序列對基因blhSR和raldhHS的50 個非翻譯區(qū)進(jìn)行了工程化，提高mRNA 表達(dá)水平，最后在生物反應(yīng)器中優(yōu)化維甲酸生產(chǎn)菌的培養(yǎng)條件（溫度、pH、氧濃度），視黃酸產(chǎn)量達(dá)到（8.20±0.05）mg∕L。

表2 維生素A相關(guān)的代謝工程改造進(jìn)展Table 2 Progress in metabolic engineering transformation related to vitamin A

2 維生素A的生物合成優(yōu)化

2.1 前體β-胡蘿卜素合成路徑的優(yōu)化

目前已經(jīng)從自然界中分離出來600多種天然類胡蘿卜素，其中約有50 種具有維生素A 原活性[41]。β-胡蘿卜素具有對稱分子結(jié)構(gòu)，由兩個尾部相連的視黃醇分子構(gòu)成，因此β-胡蘿卜素是最具有維生素A原活性的前體物質(zhì)。

β-胡蘿卜素的產(chǎn)量對于維生素A 的生產(chǎn)起著直接作用。生產(chǎn)β-胡蘿卜素不僅需要加強(qiáng)底物到目標(biāo)產(chǎn)物的代謝，還需要減少不必要的副產(chǎn)品或中間代謝產(chǎn)物的積累。CrtE、CrtI、CrtZ 和CrtW 是經(jīng)常被改造的限速酶[42]。Yamada等[43]通過使用來自酵母Xanthophyllomyces dendrorhous的CrtE，CrtYB和CrtI重復(fù)三輪δ 整合構(gòu)建了工程菌株YPH499∕Mo3Crt79，在96 h 內(nèi)產(chǎn)生52.3 mg∕L 的β-胡蘿卜素，其值比CrtE，CrtYB和CrtI共表達(dá)的菌株更高。Larroude 等[44]通過篩選每個轉(zhuǎn)錄單位的最佳啟動子-基因?qū)Γ罱K使耶氏解脂酵母中β-胡蘿卜素的產(chǎn)量達(dá)到了6.5 g∕L（89.6 mg∕g DCW）。Wang 等[45]利用易錯PCR構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子Yl-SPT15的突變文庫，調(diào)控胞內(nèi)脂質(zhì)積累，使β-胡蘿卜素產(chǎn)量較原始菌株提高了4.7 倍。Zhao 等[46]考慮到釀酒酵母對于β-胡蘿卜素和親脂性化合物的生產(chǎn)能力有限，在底盤細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)了脂質(zhì)代謝路徑[圖3(a)]，結(jié)果顯示，磷脂酸磷酸酶（PAP）基因PAH1、DPP1、LPP1的缺失以及甾醇酯合成基因ARE1和ARE2的過度表達(dá)都可以增加β-胡蘿卜素的積累，通過結(jié)合這兩種策略，YZ30 菌株產(chǎn)生了8.98 mg∕g 干細(xì)胞重量的β-胡蘿卜素，比起始菌株YZ03 高2.4 倍，這意味著脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)可以影響親脂性β-胡蘿卜素的生物合成。Ma 等[47]發(fā)現(xiàn)番茄紅素環(huán)化酶的底物抑制可能是工程微生物生產(chǎn)化學(xué)品的主要障礙，為此采取了兩種手段，通過完全失去底物抑制而不降低酶活性為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向?qū)arRB 酶進(jìn)行突變，獲得最佳突變體Y27R[圖3(b)]；通過建立轉(zhuǎn)移代謝流量使其遠(yuǎn)離抑制性代謝物香葉基焦磷酸合酶介導(dǎo)的流量限制器[圖3(c)]，既高效形成產(chǎn)物，又可以免于底物抑制的困擾，得到了一株β-胡蘿卜素生產(chǎn)率0.165 g∕(L·h)的菌株（比初始菌株提高1441 倍），產(chǎn)量為39.5 g∕L。

圖3 維生素A前體β-胡蘿卜素生物合成策略Are1,Are2—甾醇?；D(zhuǎn)移酶;pah1,lpp1,dpp1—磷脂酸磷酸酶;PA—磷脂酸;DAG—二?；视?TAG—三?；视?SE—甾醇酯;FPP—法呢基焦磷酸;GGPP—牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸;R—酶結(jié)構(gòu)域Fig.3 Biosynthesis strategy of vitamin A precursor β-carotene

2.2 輔因子優(yōu)化改造策略

維生素A 組分之間的轉(zhuǎn)化多為氧化還原反應(yīng)，氧化還原輔酶在路徑代謝中發(fā)揮著重要的作用，細(xì)胞內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化包含大量的反應(yīng)并且需要特定的輔因子，而輔因子不足常常是限制因素，因此維持細(xì)胞內(nèi)輔酶的平衡對于細(xì)胞的生長和產(chǎn)物的積累有著重要的意義。在輔因子家族中[48]，氧化還原輔因子煙酰胺腺嘌呤二核苷酸[NAD（H）]和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[NADP（H）]能夠維持氧化還原的平衡并以電子載體的形式提升酶的催化性能，參與多個化學(xué)反應(yīng)，酵母中僅與NADPH 相關(guān)的反應(yīng)就超過100 個，大腸桿菌中存在80 個NADPH 相關(guān)的酶[49]，因此調(diào)控氧化還原輔因子代謝成為優(yōu)化生物反應(yīng)的重要手段[50]。

釀酒酵母中NADPH 的產(chǎn)生來源主要是磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）的氧化部分以及異檸檬酸脫氫酶、乙醛脫氫酶和蘋果酸酶的催化反應(yīng)。但是操作PPP氧化部分實現(xiàn)NADPH上升，會消耗碳源導(dǎo)致產(chǎn)量下降。此外，中心代謝還可能會對細(xì)胞整體的代謝造成較大影響，而通過引入單獨靶向輔因子的酶可以精準(zhǔn)調(diào)控輔因子水平[51]。Lee等[39]在構(gòu)建一株高效生產(chǎn)視黃醇的酵母菌株時，通過對發(fā)酵產(chǎn)物甘油產(chǎn)量的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)存在氧化還原失衡的問題[圖4(a)]，引入乳球菌來源的NADH氧化酶的noxE，改造后的菌株甘油下降52%，視黃醇產(chǎn)量上升30%。Hu等[40]在選擇生產(chǎn)維生素A親本菌株時就考慮到了過表達(dá)截短的Hmg1（tHmg1），提升了異戊烯基焦磷酸鹽（IPP）∕二甲基烯丙基焦磷酸鹽（DMAPP）的比率，增大了MVA 路徑的通量，該過程N(yùn)ADPH 作為輔助因子。除此之外，在親本菌株中分別過表達(dá)NADP（H）氧化還原酶Zwf1 和YMR315W 及其轉(zhuǎn)錄因子Stb5，線粒體NADH 激酶Pos5，以及切除17 位氨基酸線粒體信號肽后的tPos5，結(jié)果顯示，過表達(dá)tPos5效果最明顯，視黃醇產(chǎn)量達(dá)到47.01 mg∕L，這意味著NADPH參與了內(nèi)源性脫氫酶將視黃醛轉(zhuǎn)化為視黃醇的過程。

E.coli作為研究最常用的模式生物之一，磷酸戊糖途徑（PPP）[52]、三羧酸循環(huán)（TCA）和轉(zhuǎn)氫酶系統(tǒng)是NADPH再生的三個主要來源，這三種途徑已成為提高NADPH 利用率的常用方法[53-54]。Satowa 等[55]通過敲除編碼磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的pgi基因，增加了細(xì)胞中的NADPH∕NADP+比率，促進(jìn)了NADPH 再生。Xiong 等[56]將在生產(chǎn)ε-己內(nèi)酯的大腸桿菌表達(dá)了乙醇脫氫酶（ADH）與環(huán)己酮氧化酶（CHMO），獲得了一個自給自足的NADPH 輔因子再生系統(tǒng)[圖4(b)]，實現(xiàn)126 mmol∕Lε-己內(nèi)酯的生產(chǎn)，摩爾產(chǎn)率高達(dá)0.78 mol∕mol。Du等[57]通過將來自枯草芽孢桿菌168的NADP+依賴性gapB和來自大腸桿菌MG1655的NAD 激酶yfjB，進(jìn)一步加強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)NADPH 供應(yīng)，該策略使細(xì)胞內(nèi)NADPH 量增加了134.4%。維生素A產(chǎn)物的生物合成涉及多個氧化還原反應(yīng)，NADPH作為參與此類反應(yīng)的通用輔因子，其調(diào)控策略可以運用到維生素A 的生物合成中，提升維生素A 的生物合成效果。

圖4 維生素A輔因子改造優(yōu)化策略ADH—乙醇脫氫酶;CHMO—環(huán)己酮氧化酶;ACS1—乙酰輔酶連接酶1;ZWF1—葡萄糖-6-磷酸脫氫酶;noxE—NADH氧化酶;NADH—煙酰胺腺嘌呤二核苷酸;NADPH—煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸Fig.4 Optimization strategy of vitamin A cofactor transformation

2.3 維生素A的組分調(diào)控

維生素A是由四個具有環(huán)狀端基的類異戊二烯單元組成的化合物，端基的變化產(chǎn)生了不同類別的化合物[58]。由于不同組分的存在，維生素在機(jī)體發(fā)揮著多樣的功能，視黃醇用于制造食品、藥品、營養(yǎng)品和動物飼料添加劑等；視黃醛參與視覺循環(huán)[59]；視黃酸可以保護(hù)成纖維細(xì)胞和其他皮膚細(xì)胞免受紫外線輻射（會引起皮膚損傷）[60]；視黃酯是一種更穩(wěn)定的視黃醇酯化形式，作為一種高效的抗衰老劑，是醫(yī)藥和化妝品中的活性成分[61]，因此對于維生素A組分調(diào)控的研究意義重大[圖5(a)]。

早在2015 年，Jang 等[37]在大腸桿菌中整合了β-胡蘿卜素生物合成途徑和BCMO 基因，構(gòu)建了維生素A 的合成路徑。由于大腸桿菌內(nèi)源氧化還原酶ybbO 和編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的氯霉素抗性基因cat的非特異性活性，同時也產(chǎn)生視黃醇和視黃醇醋酸酯。作者通過在重組大腸桿菌中增加ybbO基因的拷貝數(shù)和敲除cat基因，最終實現(xiàn)視黃醛、視黃醇、視黃醇醋酸酯的比例為6%、88%、6%，這表明未來選擇性生產(chǎn)維甲酸的可行性。Choi等[35]篩選了三個編碼β-胡蘿卜素裂解酶的基因：blh、brp和bcox，采用mRNA 穩(wěn)定區(qū)工程提高blh 催化效率，測試UTR12，UTR37 和UTR46 合成調(diào)控序列，以促進(jìn)視黃醇的合成，共同表達(dá)合成視黃基棕櫚酸酯路徑基因LRAT和CRBP，最終視黃基棕櫚酸酯產(chǎn)量為（69.96±2.64）mg∕L。Lee 等[39]在一株生產(chǎn)維生素A 的釀酒酵母中表達(dá)了人來源的RDH10和RDH12以及大腸桿菌來源的ybbO視黃醇脫氫酶，結(jié)果顯示攜帶人來源RDH12的釀酒酵母視黃醛全部轉(zhuǎn)化為視黃醇，產(chǎn)量為97.09 mg∕L。2022 年，Hu 等[40]在NCBI 基于與ybbO 的同源性選擇了酵母內(nèi)源的fSps19、YMR226C、Ifa38和Env9（同源性分別為：25.62%、41.34%、31.49%和29.49%）和來自M.tratuosa物種的AKR、AKR1B10 氧化還原酶以及大腸桿菌來源的ybbO基因進(jìn)行測試，結(jié)果顯示大腸桿菌來源的ybbO可以使95.79%的視黃醛轉(zhuǎn)化為視黃醇。當(dāng)Env9過表達(dá)時，視黃醇的產(chǎn)量明顯提高，達(dá)到83.63 mg∕L，這表明釀酒酵母中Env9 具有視黃醛還原酶活性[圖5(b)]。除此之外，當(dāng)酵母內(nèi)源Env9與大腸桿菌ybbO同時過表達(dá)時，視黃醇的產(chǎn)量高達(dá)115.28 mg∕L。

圖5 維生素A組分調(diào)控優(yōu)化策略RDH—視黃醇脫氫酶;ADH—乙醇脫氫酶;BCMO—β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶;LRAT—卵磷脂視黃醇酰基轉(zhuǎn)移酶;SR8A—維生素A酵母生產(chǎn)出發(fā)菌株1;RDH10—人來源視黃醇脫氫酶10;ybbO—NADP+依賴型醛還原酶;RDH12—人來源視黃醇脫氫酶12;Y03—維生素A酵母生產(chǎn)出發(fā)菌株2;sps19—2,4-二烯酰輔酶a還原酶;Ifa38—極長鏈3-氧代?；o酶a還原酶;Env9—短鏈乙醇脫氫酶Fig.5 Optimization strategy of vitamin A component regulation

當(dāng)?shù)妆P細(xì)胞引入β-胡蘿卜素生物合成途徑和β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶時，β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶可以將一分子的β-胡蘿卜素切割成兩個視黃醛分子，由于胞內(nèi)氧化還原酶非特異性催化，視黃醛可以少量轉(zhuǎn)化為視黃醇和視黃酯[38]。為了增強(qiáng)此過程的轉(zhuǎn)化，可以通過挖掘和改造的方式獲取更優(yōu)異的候選酶，增加基因的拷貝數(shù)和采用不同強(qiáng)度的啟動子等策略。

2.4 維生素A的生物發(fā)酵優(yōu)化

發(fā)酵產(chǎn)量受多種因素影響，包括生產(chǎn)菌株、培養(yǎng)基組成（碳源、氮源和離子種類等）、發(fā)酵條件（pH、溫度、攪拌速度和溶氧）以及發(fā)酵模式（分批、補(bǔ)料分批和連續(xù)發(fā)酵）[62]。為實現(xiàn)高效生產(chǎn)以滿足商業(yè)需求，維生素A 生產(chǎn)菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化具有重要意義。

由于葡萄糖具有被吸收速度快的特性，它是所有微生物的主要碳源。除葡萄糖外，近些年來以其他糖或者碳水化合物作為碳源的微生物細(xì)胞工廠也取得了進(jìn)展。其中木糖作為新興碳源，是木質(zhì)纖維素的組成成分，與葡萄糖作為碳源相比，釀酒酵母在利用木糖時，提高了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)乙酰輔酶A 的通量。Sun 等[38]在酵母菌株SR8A 引入木糖代謝途徑和維生素A生產(chǎn)路徑，當(dāng)以木糖為碳源時，其生長比使用葡萄糖時高57%，乙醇積累量微乎其微，產(chǎn)生60.90 mg∕L β-胡蘿卜素和20.74 mg∕L 維生素A，是葡萄糖條件下生產(chǎn)水平的3 倍和5 倍。同時SR8A菌株木糖中麥角甾醇的含量高于葡萄糖（21.48vs17.32 mg麥角甾醇∕g DCW），再次證實了木糖條件下乙酰輔酶A 的供應(yīng)以及MVA 途徑的代謝通量高于葡萄糖條件（表3）。

表3 維生素A生產(chǎn)下游改造策略Table 3 The downstream transformation strategy of vitamin A production

維生素A 屬于親脂性化合物，通過細(xì)胞膜的低滲透性和低溶解度阻礙產(chǎn)物分泌到胞外。油和表面活性劑常常被添加到親脂性化合物發(fā)酵過程，調(diào)節(jié)菌株生長和生產(chǎn)產(chǎn)物過程[63]。Sun 等[38]發(fā)現(xiàn)維生素A 生產(chǎn)菌株加入十二烷時，促進(jìn)β-胡蘿卜素向維生素A 的轉(zhuǎn)化，維生素A 產(chǎn)量比對照組高出2～4 倍?？紤]到十二烷用于維生素A工業(yè)生產(chǎn)的可行性和安全問題，Sun等通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中以1∶1的體積比添加橄欖油，發(fā)現(xiàn)工程菌的發(fā)酵曲線和產(chǎn)品產(chǎn)量情況與使用十二烷時相似，證明了橄欖油替代十二烷提取維生素A 的可行性，橄欖油可能比十二烷更適合用于營養(yǎng)、醫(yī)藥和化妝品產(chǎn)品。Lee等[36]發(fā)現(xiàn)表面活性劑Span80 濃度保持10 g∕L 時，對細(xì)胞生長最有效，細(xì)胞積累量為15.2 g∕L，比不含Span80 的培養(yǎng)基高2.7倍。

催化β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為視黃醛的β-胡蘿卜素15,15'-氧化酶，在酶催化時，F(xiàn)e2+協(xié)調(diào)His-21、His-78、His-188 和His-192 活性位點[64]。Hu 等[40]考慮到亞鐵離子在空氣中容易被氧化為三價鐵離子，在發(fā)酵36 h 后向培養(yǎng)物中添加1.44 mmol∕L Fe2+以保持blh 的催化活性。結(jié)果顯示，β-胡蘿卜素的積累減少，視黃醇產(chǎn)量進(jìn)一步提高9.03%，達(dá)到443.43 mg∕L，占總維生素A的98.76%。

確定最佳生產(chǎn)工藝對于商業(yè)化生產(chǎn)至關(guān)重要，傳統(tǒng)的發(fā)酵優(yōu)化方法需要對每個因素進(jìn)行單獨處理，存在費力、不完整和耗時等弊端?，F(xiàn)在新興的實驗析因設(shè)計可用于研究相互作用的因素，已成功應(yīng)用于生物制造工藝的優(yōu)化[65-66]，未來可以與維生素A細(xì)胞工廠優(yōu)化結(jié)合，有望提高其生產(chǎn)效率。

2.5 維生素A儲存條件優(yōu)化

視黃醇作為一種抗氧化劑，由于其結(jié)構(gòu)中存在連續(xù)的共軛雙鍵，當(dāng)暴露在光、熱和空氣中，容易被氧化或異構(gòu)化[67]。在一項關(guān)于維生素A抵抗UVA和UVB 射線的實驗中，與固體脂質(zhì)納米粒、環(huán)糊精包合物和聚合物包封相比，抗氧化劑丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）表現(xiàn)出優(yōu)異的保護(hù)功能[68]，添加BHT是防止視黃醇降解的簡單、經(jīng)濟(jì)和安全的方法[69]。

Hu 等[40]在多株工程改造的維生素A 酵母生產(chǎn)菌中添加抗氧化劑BHT，可以有效阻止視黃醇的氧化，顯著提高維生素A 中視黃醇占比，并且維生素A總體產(chǎn)量也有所提升。在生產(chǎn)菌Y03-43 中加入BHT 后視黃醇產(chǎn)量達(dá)到401.65 mg∕L，這表明抗氧化劑對視黃醇易氧化產(chǎn)品生產(chǎn)及存儲的必要性[圖6(a)]。為了測試其他抗氧化劑是否對維生素A 生成具有促進(jìn)作用，Hu 等[40]研究了其他疏水性抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚（butyl hydroxyanisole，BHA）、綠茶多酚（green tea polyphenol，GTP）和沒食子酸丙酯（propyl gallate，PG）對菌株生產(chǎn)維生素A 的影響，發(fā)現(xiàn)BHA 嚴(yán)重?fù)p害了細(xì)胞的生長，而GTP 和PG 也降低了兩株試驗菌株的單位OD，但GTP 和PG 的加入提高了維生素A 的產(chǎn)量，該研究意味著在實際生產(chǎn)中有必要選擇對細(xì)胞生長影響較小的抗氧化劑。

Chmykh 等[70]發(fā)現(xiàn)用脂質(zhì)體包封可提高視黃醇的穩(wěn)定性[圖6(b)]，在這項研究中，比較了在紫外線或標(biāo)準(zhǔn)室內(nèi)空氣條件下，視黃醇在添加和不添加抗氧化劑的磷脂酰膽堿脂質(zhì)體中的穩(wěn)定性。BHT 和專有混合物（StoppOx）都將穩(wěn)定性從小于10 d 提高到30 d 以上。在紫外線照射下，StoppOx 保護(hù)視黃醇的時間明顯長于BHT。

圖6 維生素A儲存條件優(yōu)化策略Fig.6 Optimal strategy of vitamin A storage conditions

由于視黃醇對光和氧高度敏感，紫外線會導(dǎo)致其降解成各種潛在的有害產(chǎn)品，輻照后的視黃醇也能激活光敏劑，如葉綠素、孟加拉玫瑰紅或核黃素[71]，這些產(chǎn)品可能直接或間接損害DNA 和細(xì)胞膜，因此視黃醇儲存條件的優(yōu)化十分必要。

3 維生素A 的市場需求和生物合成前景

隨著對維生素A 的研究越來越深入，其在市場上的需求量也越來越大[圖7(a)]。據(jù)中國產(chǎn)業(yè)信息網(wǎng)統(tǒng)計，2018 年全球維生素A 需求量約2.7 萬噸，較2017 年增長約5%，需求與產(chǎn)能比約為73%。假設(shè)2019～2022 年維生素A 需求量仍以5%的增速增長，則2022 年全球需求量約能達(dá)到3.3 萬噸，2022 年全球市場規(guī)模將達(dá)到約10億美元[圖7(b)]。

圖7 維生素A市場供應(yīng)情況Fig.7 Market supply of vitamin A

維生素A 雖然可以從動物組織中提取，但資源分散、步驟繁雜、成本高，目前維生素A 主要依靠化學(xué)合成。Roche 工藝技術(shù)成熟、收率穩(wěn)定，但其缺陷是原輔材料多達(dá)40 種，反應(yīng)步驟多，導(dǎo)致整體收率較低。BASF 工藝反應(yīng)步驟少，工藝路線短，收率較高，但其核心技術(shù)難點Witting 乙炔化反應(yīng)條件嚴(yán)苛，且該工藝中原料三苯基膦價格較高。

以可再生的糖為原料，微生物發(fā)酵生產(chǎn)維生素A可能比基于石化的生產(chǎn)工藝更具有成本效益和環(huán)境友好等優(yōu)點。釀酒酵母工業(yè)生產(chǎn)維生素A具有優(yōu)越性，包括易于遺傳操作、方便規(guī)模發(fā)酵，目前維生素A 最高生產(chǎn)水平為在酵母細(xì)胞發(fā)酵120 h，維生素A 總 量 為2542.68 mg∕L，由97.51% 的 視 黃 醇（2479.34 mg∕L）和2.49%的維甲酸（63.34 mg∕L）組成，為工業(yè)化生產(chǎn)維生素A 提供了新的工程策略[40]。除此之外，Lee等[39]在使用橄欖油為萃取劑進(jìn)行兩相木糖培養(yǎng)時，發(fā)酵后獲得含有166 IU∕ml維生素A 的橄欖油，可以被用作富含維生素A的營養(yǎng)品，提供了維生素A副產(chǎn)品的發(fā)展思路和策略。

4 總結(jié)與展望

維生素A 是人體必需的維生素，在維持視覺功能、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和凋亡、穩(wěn)定上皮細(xì)胞形態(tài)和功能方面發(fā)揮著重要作用，可用作保健品、護(hù)膚品以及飼料營養(yǎng)素等，具有廣闊的市場前景以及巨大的經(jīng)濟(jì)價值。

近年來，隨著合成生物學(xué)、代謝工程、DNA 測序和組學(xué)分析等技術(shù)的快速發(fā)展，利用微生物構(gòu)建細(xì)胞工廠合成維生素A 已經(jīng)取得很大進(jìn)展，但仍有很多挑戰(zhàn)，如對天然合成途徑及其中關(guān)鍵酶的認(rèn)識較為淺薄，異源途徑與底盤細(xì)胞環(huán)境的不適配，細(xì)胞工廠的生產(chǎn)能力與工業(yè)需求還存在差距等。

為了進(jìn)一步提高微生物生產(chǎn)維生素A 的能力，可以采取以下方法：（1）通過對維生素A天然生產(chǎn)者的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組等深入研究，全面了解代謝網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機(jī)制；（2）解析異源路徑與底盤細(xì)胞之間的適配機(jī)制，通過代謝調(diào)控提高元件、模塊、途徑與底盤之間的適配性；（3）分析維生素A此類親脂性化合物在底盤細(xì)胞中合成后的儲存和轉(zhuǎn)運機(jī)制，最大化利用胞內(nèi)資源，從而在細(xì)胞自身代謝和異源產(chǎn)物合成中達(dá)到平衡，減少細(xì)胞的代謝壓力，提高生產(chǎn)的可持續(xù)性；（4）搭建高通量、自動化以及智能化的合成生物學(xué)平臺，多學(xué)科多領(lǐng)域交叉分析，如統(tǒng)計和數(shù)學(xué)方法結(jié)合產(chǎn)生的集合響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）和 人 工 神 經(jīng) 網(wǎng) 絡(luò)（artificial neural network，ANN）[72]，實現(xiàn)對代謝產(chǎn)物的實時監(jiān)測，挖掘更多的代謝改造靶點，進(jìn)而提升異源合成的效率，構(gòu)建高效、穩(wěn)定、可控的生產(chǎn)維生素A的微生物細(xì)胞工廠。