陳雅凡 王剛 田藝苑 同紅偉，4 袁鵬

作者單位：710068 西安 1西安體育學院研究生部；710068 西安 2西安體育學院運動與健康科學學院；716000 延安 3延安大學醫(yī)學院；716099 延安 4延安市人民醫(yī)院；710038 西安 5空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院核醫(yī)學科

生物節(jié)律是生物體在適應地球自轉和公轉所表現出與環(huán)境相適應的一系列的周期性變化，是生物體在漫長的生物進化過程中形成的一種內源性節(jié)律。在哺乳動物中，生物節(jié)律主要是由一系列核心生物鐘基因轉錄和翻譯后形成負反饋環(huán)路調控，進而產生諸如激素分泌、體溫波動等晝夜節(jié)律。哺乳動物的晝夜節(jié)律系統(tǒng)包括位于大腦的中央振蕩器，以及除大腦外身體幾乎所有的組織器官中的外周振蕩器。中央振蕩器又叫中樞時鐘，位于下丘腦視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）的神經元，SCN接收來自視網膜的光信息，中樞時鐘通過神經和體液途徑使外周時鐘與外部光/暗周期同步［1］。目前，已有9種在哺乳動物下丘腦視交叉上核和外周組織中表達的核心晝夜節(jié)律基因被廣泛研究，包括神經元PAS結構域蛋白2（neuronal PAS domain protein 2，NPAS2）、腦和肌肉組織芳香烴受體核轉運蛋白的類似蛋白1（brain and muscle ARNT-like protein 1，BMAL1）、晝夜節(jié)律運動輸出周期故障（circadian locomotor output cycles kaput，CLOCK）、CRY1/2、PER1/2/3、CSNK1E、NR1D1/2、RORA和TIMELESS［2］，其中NPAS2是哺乳動物分子量最大的核心節(jié)律基因，參與生物鐘的調控。NPAS2還可以通過調控細胞周期、細胞增殖和凋亡相關基因，參與腫瘤發(fā)生、腫瘤細胞生長和轉移等多個細胞活動過程。本文就NPAS2在腫瘤中作用的研究進展作一綜述。

1 NPAS2概述

1.1 NPAS2的結構

NPAS2最早于1996年由ZHOU等在研究小鼠大腦早期發(fā)育時被發(fā)現，是目前檢測到的最大核心生物鐘基因（176.68 kb），定位于人染色體2p11.2-2q13上［3］，含有37個外顯子，轉錄后產生23個不同的mRNAs，16個可變剪切異構體，12個可變啟動子。NPAS2蛋白屬于bHLH-PAS轉錄因子家族。N端包括9～59位氨基酸組成的堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）結構域、82～152位氨基酸組成的PAS-A結構域、237～307位氨基酸組成的PAS-B結構域以及311～354位氨基酸組成的PAC結構域。bHLH結構域能介導蛋白質之間的相互作用，促進二聚體的形成，PAS-A和PAS-B結構域大約有260個氨基酸的長度，含有2個約含60個氨基酸的同向重復，可介導與DNA結合，PAC結構域伴隨PAS結構域出現，有助于PAS結構域的折疊。NPAS2的C端則是核受體連接區(qū)，可調節(jié)與NPAS2有關的核受體結合［4］，見圖1。

圖1 NPAS2蛋白的基本結構Fig.1 Basic structure of NPAS2 protein

1.2 NPAS2的表達與調節(jié)

NPAS2在人體分布廣泛，不僅在中樞神經系統(tǒng)表達，還在除睪丸組織外的幾乎所有外周組織中分布，其中在中樞神經系統(tǒng)中主要分布于SCN［5］。NPAS2與另一核心節(jié)律基因CLOCK為同源基因，都具有bHLH/PAS結構域和核受體相互作用域［6］。有研究報道在外周組織和視交叉神經核中NPAS2功能上可以替代CLOCK調節(jié)晝夜節(jié)律［7］，兩者都能與BMAL1結合形成異源二聚體。NPAS2因可結合亞鐵血紅素而對CO敏感，而CO主要通過與PAS-A結合域結合，阻礙bHLH-PAS結構域與DNA結合［8］。NPAS2本身對E-box序列沒有親和力，不能單獨與DNA結合，只有與BMAL1形成的異源二聚體才能與DNA的E-box結合［9］。因此，CO濃度高時會影響NPAS2/BMAL1的轉錄調控功能，當CO濃度較低時，其轉錄功能恢復。

隨著地球自轉，哺乳動物的生物節(jié)律會通過節(jié)律基因轉錄、翻譯而形成的負反饋環(huán)路不斷進行周期性調節(jié)和振蕩［10］，其中負反饋環(huán)路包括正向環(huán)路和反向環(huán)路。核心的節(jié)律基因包括BMAL1、CLOCK、CRY1/2、PER1/2/3、NPAS2、CSNK1E、NR1D1/2、RORA和TIMELESS，其中正向環(huán)路又包括NPAS2、CLOCK和BMAL1。NPAS2（或CLOCK）與BMAL1結合形成異源二聚體，并在下游節(jié)律因子如周期蛋白（period，PER）家族和隱花色素（cryptochrome，CRY）家族啟動子的E-box上激活其轉錄，從而促進CRY和PER蛋白在細胞質積累［11］。當CRY和PER積累到一定程度，PER會被酪氨酸激酶磷酸化，與CRY形成異源二聚體后入核，隨著PER與CRY入核增多，PER/CRY異源二聚體會抑制NPAS2/BMAL1或CLOCK/BMAL1復合體的轉錄激活作用，進而形成負向環(huán)路［12］。但隨著PER/CRY復合物的降解，其對NPAS2/BMAL1或CLOCK/BMAL1復合體的抑制作用逐漸減弱，復合體將恢復與靶基因E-box結合，再次激發(fā)轉錄，正反環(huán)路循環(huán)往復，從而形成晝夜節(jié)律的負反饋環(huán)路［13］，見圖2。

圖2 晝夜節(jié)律反饋環(huán)路Fig.2 Circadian rhythm feedback loops

2 NPAS2在腫瘤中的作用

NPAS2主要作為生物鐘基因參與正常晝夜節(jié)律的調節(jié)，當NPAS2出現異常，可能會出現與節(jié)律相關的疾病，如癌癥、心血管疾病和代謝綜合征等［14-15］。研究發(fā)現生物鐘基因突變后，轉基因小鼠更易發(fā)展成惡性腫瘤和導致幼稚細胞老化［16］。生物的晝夜節(jié)律失調是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的內在因素之一，尤其是在激素依賴性腫瘤如乳腺癌、子宮內膜癌和前列腺癌等腫瘤中發(fā)揮重要作用［17］，由此可見晝夜節(jié)律的改變可影響腫瘤的易感性。目前研究顯示，NPAS2主要通過調控細胞周期、增殖和代謝參與腫瘤細胞生長和轉移等多個細胞活動過程，并在各類型腫瘤中得到驗證［18-19］。

2.1 乳腺癌

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，約占癌癥患者總數的36%［20］。根據其臨床特征和病理特性，常分為雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性、人表皮生長因子受體2（human epithelial growth factor receptor，HER2）陽性和三陰性乳腺癌［21］。乳腺癌是一種激素依賴性腫瘤，褪黑素和雌激素在乳腺癌發(fā)病機制中起重要作用。在ER陽性的乳腺癌患者中，褪黑素的抑癌作用主要是通過抑制褪黑素受體1的ER mRNA表達和ER轉錄活性來實現，褪黑素不僅可以調節(jié)核受體的反式激活和雌激素代謝酶及相關基因的表達，還可以抑制腫瘤細胞的糖酵解和與細胞增殖、生存、轉移有關的關鍵細胞信號通路［22］。褪黑素通常在夜間分泌，有明顯的晝夜節(jié)律性，晝夜顛倒會導致褪黑素信號被破壞，從而促進人類乳腺癌的生長［23］。而隨著現代生活方式的改變，白晝環(huán)境中的非自然光和夜間人工照明的周期越來越長，破壞了晝夜節(jié)律的內源性穩(wěn)定，導致腫瘤發(fā)展并加速其進展［24］。乳腺癌流行病學研究顯示，倒班工作會增加患乳腺癌的風險［25］。NPAS2蛋白大部分位于細胞漿內，也有部分位于細胞核，在正常乳腺組織、乳腺癌前病變和浸潤癌中均有表達。與正常組織相比，NPAS2蛋白在原位癌和浸潤癌中表達下調。在不同分期浸潤癌中，與Ⅰ期比較，Ⅱ期、Ⅲ期乳腺癌中NPAS2表達明顯減弱，提示NPAS2的功能減弱是乳腺癌發(fā)生的重要因素，且與乳腺癌分期有關［23］。同時也有研究發(fā)現，過表達NPAS2會使大量的乳腺癌細胞停滯在G0/G1期而不能向S期轉化，這可能是NPAS2抑制了ERα的轉錄活性，隨之下調了細胞周期和增殖相關蛋白表達，最終抑制了乳腺癌細胞的增殖［26］。綜上所述，乳腺癌發(fā)生與生物鐘基因表達異常、突變和多態(tài)性有關，且在乳腺癌中NPAS2可能作為抑癌基因發(fā)揮作用，未來進一步探索節(jié)律基因和乳腺癌的關系，可能對乳腺癌的治療策略和路徑具有借鑒意義。

2.2 前列腺癌

前列腺癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在男性惡性腫瘤中居第二位，死亡率居第五位［27］。前列腺癌具有高度異質性，不僅表現在不同患者之間腫瘤組織學的特征差異，還表現在同一患者不同腫瘤細胞在生長、侵襲、轉移速度上的差異［28］。目前已有研究表明，節(jié)律基因與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。一項病例對照試驗探索了9種晝夜節(jié)律基因與前列腺癌風險之間的聯系，結果顯示前列腺癌與NPAS2和PER1表達有關［29］。另有文獻報道PER1在前列腺癌細胞中過表達可抑制細胞生長和促進細胞凋亡［30］、PER3在腫瘤微環(huán)境中可通過WNT/β-catenin信號通路負向調節(jié)前列腺癌干細胞［31］。此外，與在完全黑暗的環(huán)境中睡覺相比，在強度較高的光照環(huán)境中睡覺會增加罹患前列腺癌的風險［32］，但褪黑素能使前列腺癌細胞中失調的晝夜節(jié)律重新同步化［33］。一項納入1 511名男性工人的基因分型數據研究，評估了前列腺癌和晝夜節(jié)律基因變異和夜間工作指標之間的相互作用，結果顯示晝夜節(jié)律通路與夜間工作者中侵襲性前列腺癌的發(fā)生顯著相關，尤其是長時間夜班的男性，且其侵襲性前列腺癌與NPAS2和BMAL1均有關聯［34］。YU等［35］發(fā)現NPAS2 rs6542993與局部和晚期前列腺癌病例的疾病進展風險明顯升高有關。綜上所述，目前有關NPAS2與前列腺癌關系的研究主要聚焦于患病風險，關于NPAS2與前列腺癌細胞之間內在聯系與具體作用機制的研究仍需進一步探索。

2.3 肝癌

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌的主要類型，占原發(fā)性肝癌病例的75%～85%［36］。目前常用的肝癌診斷標志物的敏感度和特異性仍不理想，尤其是用于早期肝癌診斷的分子標志物［19］。既往研究顯示，晝夜節(jié)律調節(jié)異常與HCC發(fā)生和發(fā)展有關［37］。YUAN等在證實了NPAS2基因的功能多態(tài)性與經導管動脈化療栓塞治療的HCC患者的總生存期相關后［38］，還在217例肝癌組織中發(fā)現NPAS2表達明顯高于癌旁組織，且表達與患者預后相關［39］；NPAS2還可以促進細胞增殖和抑制線粒體依賴性內在凋亡促進肝癌細胞存活。該研究還進一步探究了NPAS2在HCC葡萄糖代謝過程的作用，結果顯示NPAS2在低氧誘導因子-1α介導下上調了糖酵解基因，下調了過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α的表達，從而在HCC生長和轉移中起關鍵作用［40］。此外，肝臟疾病發(fā)展到肝癌會經歷肝纖維化的過程，有研究證明，肝纖維化損傷后，NPAS2在肝星狀細胞中上調，隨后直接轉錄激活發(fā)狀分裂相關增強子1，從而促進纖維化［41］。上述研究不僅表明了NPAS2在HCC中扮演著“促癌”的角色，同時也展現了NPAS2成為HCC標志物和治療靶點的潛力。然而，HCC的發(fā)生、發(fā)展是一個復雜的過程，NPAS2是否與其他類型肝癌的發(fā)生和進展有關，例如是否參與非酒精性脂肪性肝炎以及非酒精性脂肪性肝炎相關肝癌的發(fā)生，及其可能的分子機制仍需進一步探索。

2.4 非霍奇金淋巴瘤

晝夜節(jié)律基因有可能影響多種癌癥相關的生物學途徑，晝夜節(jié)律紊亂導致的免疫失調，是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin′s lymphoma，NHL）的風險因素，同時也可能影響NHL的易感性［42］。ZHU等［43］報道NPAS2多態(tài)性與NHL發(fā)生風險降低有密切聯系，研究不僅表明了晝夜節(jié)律生物標志物可能與NHL預后相關，還檢測到晝夜節(jié)律基因NPAS2與NHL可能存在因果關系，該結果提供了首個分子流行病學上晝夜節(jié)律基因對淋巴瘤發(fā)生作用的證據支持。綜上提示NPAS2可能成為一個新穎的NHL生物標志物，但鑒于NHL的發(fā)病率不斷增加，其病因并不十分明確，NPAS2與NHL的患病風險和預后，有待進一步研究。

2.5 子宮內膜癌

子宮內膜癌根據組織學可分為子宮內膜型和非子宮內膜異型，其中子宮內膜型是雌激素依賴型，約占子宮內膜病例的80%，通常預后較好，而非子宮內膜異型（如漿液型和透明細胞型）由于對雌激素反應不強，往往預后不良［44］。ZHENG等［45］研究發(fā)現，在子宮體子宮內膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）組織中NPAS2表達上調，且NPAS2高表達會降低UCEC患者的總體生存率、無病生存率和無復發(fā)生存率；NPAS2表達還與UCEC的臨床分期、腫瘤分級、ER狀態(tài)和子宮肌層浸潤水平呈顯著正相關；NPAS2在UCEC中不僅可以抑制細胞凋亡，促進細胞增殖和集落形成，還可以通過增強腫瘤免疫細胞浸潤發(fā)揮致癌作用。因此認為，NPAS2可能是UCEC中的癌基因，有望成為子宮內膜癌的預后標志物。

2.6 急性髓系白血病

白血病是循環(huán)系統(tǒng)的惡性腫瘤，特征為造血細胞或最終分化的白細胞不受控制的過度生長，其中急性髓系白血?。╝cute myelocytic leukemia，AML）是成年人中最常見的急性白血病，其侵襲性和異質性強，患者總體生存率和無復發(fā)生存率極低［46］，因此尋找AML新的分子標志物和治療靶點尤為重要。牟佼等［47］通過對46例AML患者骨髓單個核細胞的NPAS2水平進行分析，結果發(fā)現NPAS2在AML患者中表達上調且與不良預后相關，而干擾AML細胞系中的NPAS2表達可抑制細胞生長。SONG等［48］研究顯示，NPAS2在AML細胞中高表達，敲低NPAS2可明顯抑制AML細胞增殖并促進細胞凋亡；機制研究發(fā)現NPAS2可能通過CDC25A調控Caspase-3和bcl2/bax的表達，從而誘導細胞周期改變。以上研究表明，NPAS2可能是AML細胞惡性生長的關鍵調控因子，但在其他類型白血病中是否發(fā)揮同樣作用還需進一步探究。

2.7 其他腫瘤

除了上述癌種，NPAS2還與其他癌種有關。MADDEN等［49］使用癌癥基因組圖譜數據集分析與神經膠質瘤風險和預后相關的核心生物鐘基因，發(fā)現NPAS2的表達升高與患者的不良預后有關。YANG等［50］發(fā)現NPAS2在結直腸癌中表達下調，且NPAS2高表達患者的5年生存率明顯高于NPAS2低表達患者，表明NPAS2在結直腸癌患者預后中具有預測價值。在結直腸癌細胞系DLD-1中，NPAS2具有抑制細胞增殖、侵襲和細胞劃痕愈合能力［51］。另有研究發(fā)現，NPAS2 rs895520的次要等位基因與33%肉瘤和44%平滑肌肉瘤易感性增加相關［52］。此外，在腎癌患者中，NPAS2低表達的患者預后良好［53］。而在未分化甲狀腺癌中，NPAS2明顯上調，可促進腫瘤的惡性進展［54］。綜上所述，NPAS2在各類型腫瘤中發(fā)揮作用不同，但是在單一癌種中的研究不夠全面，仍需進一步研究。

3 小結

核心節(jié)律基因NPAS2雖然早已被發(fā)現，但是其功能尤其是在癌癥發(fā)生和進展中的功能研究還有限。目前研究顯示，晝夜節(jié)律的紊亂與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切，核心節(jié)律基因NPAS2具有明顯的組織特異性，在人體不同類型腫瘤組織中表達異常，但在不同類型腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中可能發(fā)揮的作用不同，可能作為抑癌基因也可能作為促癌基因發(fā)揮作用，因此具有成為腫瘤標志物和治療靶點的潛力。但由于NPAS2參與了機體大量的生理過程，對其作用和功能的全面理解有待于進一步的研究。深入探索NPAS2與腫瘤之間的聯系和內在機制，將為揭示腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、腫瘤的預防和治療提供新思路，同時也有助于驗證其作為新的治療靶點和標志物的可能性。