劉麗，方三華，楊丹

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺(tái)，杭州 310058)

核酸是生命活動(dòng)最基本的遺傳物質(zhì)，蛋白質(zhì)是生命體的重要組成部分，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者和執(zhí)行者。人類基因組由20 000～30 000 個(gè)基因組成，這些基因可編碼超過(guò)50 萬(wàn)種不同的蛋白質(zhì)[1-2]，核酸和蛋白的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致多種遺傳疾病的發(fā)生。對(duì)特定核酸或蛋白進(jìn)行快速準(zhǔn)確的定量分析對(duì)促進(jìn)人類健康的發(fā)展具有重要意義。人類基因組計(jì)劃以及在此基礎(chǔ)上研究所有蛋白質(zhì)的表達(dá)、結(jié)構(gòu)以及功能的蛋白質(zhì)組學(xué)極大促進(jìn)了高通量核酸、蛋白定量及分離技術(shù)的發(fā)展[3]。目前，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室仍然在使用傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法進(jìn)行核酸或蛋白片段的定性或半定量分析。然而傳統(tǒng)的電泳分析方法耗時(shí)、耗力，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化及對(duì)圖像進(jìn)行分析處理，要求實(shí)驗(yàn)者具備較高的實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)和良好的實(shí)驗(yàn)技能，同時(shí)傳統(tǒng)的電泳分析需要一定的樣本量進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)稀有樣本不太友好。毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)由于其快速、穩(wěn)定、自動(dòng)化、高靈敏性、高分辨率、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)被越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室接受并用于核酸片段分離及蛋白和多糖的分析[4-5]。Qsep100 核酸蛋白分析系統(tǒng)是一款利用一次性筆形凝膠卡夾的新型毛細(xì)管凝膠電泳儀[6-7]。該系統(tǒng)基于毛細(xì)管凝膠電泳的原理，將激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)技術(shù)引入到毛細(xì)管電泳中，具備熒光檢測(cè)的靈敏性和上樣及數(shù)據(jù)分析的自動(dòng)性，特別適用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)的定性、定量檢測(cè)及質(zhì)控分析，目前已廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究、藥物開(kāi)發(fā)、臨床診斷、轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物檢測(cè)、農(nóng)產(chǎn)品改良和環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域[2，8-12]。

筆者對(duì)該儀器的原理、功能作詳細(xì)介紹，對(duì)不同凝膠卡夾類型的實(shí)驗(yàn)條件、樣本要求及參數(shù)設(shè)置進(jìn)行討論，同時(shí)針對(duì)儀器共享服務(wù)平臺(tái)如何進(jìn)行更高效的儀器維護(hù)和管理進(jìn)行探討，以期為廣大科研工作者提供更加科學(xué)、有效的核酸蛋白檢測(cè)方案。

1 儀器組成及特點(diǎn)

Qsep100 核酸蛋白分析系統(tǒng)配備了(505±15)nm 波長(zhǎng)的LED 光源、光電倍增管(PMT)接收器、590～650 nm 長(zhǎng)通濾光片，實(shí)現(xiàn)了高靈敏的信號(hào)采集；同時(shí)自動(dòng)樣品臺(tái)具備X、Y、Z三個(gè)方向的精準(zhǔn)步進(jìn)電動(dòng)機(jī)，保障了樣本和試劑臺(tái)的移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)了8聯(lián)管、12 聯(lián)管或者96 孔板的自動(dòng)進(jìn)樣檢測(cè)。儀器采用多種不同用途的可拋棄式預(yù)制膠卡夾，無(wú)需配膠、灌膠、點(diǎn)樣等操作，大幅度提高工作效率的同時(shí)，顯著降低了實(shí)驗(yàn)成本。

Qsep100 儀器特點(diǎn)見(jiàn)表1。基于該儀器的高靈敏性及高分辨率等一系列優(yōu)勢(shì)，除最常用的核酸質(zhì)控等方面的應(yīng)用外，還可用于蛋白分析、核酸蛋白互作、常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物檢測(cè)、短串聯(lián)重復(fù)序列/簡(jiǎn)單重復(fù)序列(STR/SSR)微衛(wèi)星分型、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性/限制性內(nèi)切酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(AFLP/RFLP)、高分辨率基因分型、高分辨率多重PCR 分析、質(zhì)粒DNA 酶切構(gòu)造及純度分析、合成引物分析等[13-14]，是近年來(lái)新興的毛細(xì)管凝膠電泳儀，可完全替代昂貴的進(jìn)口設(shè)備，如Agilent 2100 Bioanalyzer 等。

表1 Qsep100 儀器特點(diǎn)匯總

2 樣本制備及注意事項(xiàng)

Qsep100 適用范圍廣，具有多種不同應(yīng)用，不同樣本的上機(jī)檢測(cè)濃度范圍、樣本是否需要預(yù)處理等樣本制備環(huán)節(jié)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性至關(guān)重要，因此實(shí)驗(yàn)前需了解樣本的來(lái)源、性質(zhì)以及上機(jī)要求等條件。

2.1 DNA 樣本

上機(jī)質(zhì)量濃度建議為1～2 ng/μL，S2 標(biāo)準(zhǔn)卡夾檢測(cè)下限為0.05 ng/μL。

2.2 細(xì)胞游離DNA/循環(huán)腫瘤DNA 樣本

質(zhì)量濃度0.02 ng/μL 以上的都可以用S2 標(biāo)準(zhǔn)卡夾(可以提高進(jìn)樣電壓或者進(jìn)樣時(shí)間以增加進(jìn)樣量)；當(dāng)S2 卡夾無(wú)法檢出時(shí)則用高敏卡夾(N1)。

2.3 PCR 產(chǎn)物

上機(jī)質(zhì)量濃度建議為1～2 ng/μL 左右，質(zhì)量濃度較高時(shí)也可以通過(guò)減少進(jìn)樣時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)下限為5 pg/μL。

2.4 基因組DNA/石蠟包埋樣本DNA 樣本

上機(jī)質(zhì)量濃度建議3～5 ng/μL，S2 標(biāo)準(zhǔn)卡夾檢測(cè)下限為0.5 ng/μL。

2.5 總RNA 樣本

上機(jī)前需將樣本進(jìn)行預(yù)處理；在95 ℃下加熱5 min，再于冰上放置5 min 后檢測(cè)。上機(jī)質(zhì)量濃度建議為10～20 ng/μL，RNA 卡夾檢測(cè)下限為0.2 ng/μL。

2.6 蛋白樣本

與核酸樣本不同，蛋白樣本需提前根據(jù)說(shuō)明書(shū)用染料標(biāo)記，蛋白樣本與染料的濃度需在說(shuō)明書(shū)的基礎(chǔ)上根據(jù)蛋白樣本的生化性質(zhì)調(diào)整。總的來(lái)說(shuō)，堿性蛋白較酸性蛋白易于被標(biāo)記，氨基酸組成中賴氨酸的含量越高，被標(biāo)記越多。溶解蛋白樣品的緩沖液中不能含有任何一級(jí)胺，如三羥甲基氨基甲烷(Tris)；不能含有清潔劑，如十二烷基硫酸鈉(SDS)。適用的緩沖液濃度及種類如：50～100 mmol/L 碳酸鈉溶液、磷酸鈉溶液、硼酸鈉溶液或pH 7.0～9.0 的羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)緩沖溶液。

對(duì)于DNA 樣本建議用卡夾配套的稀釋液(稀釋至10 倍體積后使用)稀釋至推薦濃度范圍進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，避免使用TE 緩沖液等常用溶液直接稀釋樣本，以避免溶液中的離子影響毛細(xì)管凝膠電泳的運(yùn)行和數(shù)據(jù)分析。另外樣本濃度的初步測(cè)定建議用較為靈敏的Qubit 熒光定量?jī)x檢測(cè)，如果用紫外分光光度計(jì)NanoDrop 檢測(cè)，濃度下限需至少提高2～3 倍。

3 應(yīng)用實(shí)例

3.1 cDNA 文庫(kù)檢測(cè)

檢測(cè)參數(shù)：S2 卡夾，進(jìn)樣電壓為4 kV，進(jìn)樣時(shí)間為10 s，分離電壓為8 kV，分離時(shí)間為171 s。

在以上檢測(cè)參數(shù)下，小鼠神經(jīng)組織cDNA 文庫(kù)檢測(cè)結(jié)果如圖1 所示。結(jié)果顯示該cDNA 文庫(kù)58.5%的片段長(zhǎng)度分布在400～600 堿基對(duì)(bp)。

圖1 小鼠神經(jīng)組織cDNA 文庫(kù)檢測(cè)結(jié)果

Qsep100 系統(tǒng)可根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行彌散條帶(smear)分析：設(shè)定不同片段長(zhǎng)度區(qū)間及不同片段間隔對(duì)樣本的片段長(zhǎng)度和豐度進(jìn)行分析(圖1c)。檢測(cè)所得的cDNA 樣本建庫(kù)后片段的長(zhǎng)度和豐度信息，是判斷樣本是否可以進(jìn)行下一代測(cè)序(NGS)的重要依據(jù)。

3.2 cDNA 樣本檢測(cè)及PCR 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

檢測(cè)參數(shù)：S2 卡夾，進(jìn)樣電壓為8 kV，進(jìn)樣時(shí)間為10 s，分離電壓為8 kV，分離時(shí)間為170 s。

在以上檢測(cè)參數(shù)下，小鼠神經(jīng)細(xì)胞cDNA 檢測(cè)結(jié)果及PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2 所示。用標(biāo)準(zhǔn)S2 卡夾檢測(cè)小鼠某特定腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的cDNA，峰形圖結(jié)果顯示無(wú)明顯信號(hào)峰(圖2a)，但該cDNA 樣本經(jīng)特定引物擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果有明顯條帶(圖2c)。結(jié)果提示如樣本濃度較低則S2 標(biāo)準(zhǔn)卡夾可能無(wú)法檢測(cè)到明顯的信號(hào)峰，但此時(shí)并不表示樣本無(wú)法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，僅表示更高靈敏性的卡夾(如N1 卡夾)更適合該樣本的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)證明根據(jù)樣本的濃度信息選擇適合的卡夾至關(guān)重要。

圖2 小鼠神經(jīng)細(xì)胞cDNA Qsep100 檢測(cè)結(jié)果及PCR 擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

3.3 RNA 質(zhì)控實(shí)驗(yàn)

檢測(cè)參數(shù)：R1 卡夾，進(jìn)樣電壓為4 kV，進(jìn)樣時(shí)間為10 s，分離電壓為4 kV，分離時(shí)間為579 s。

根據(jù)沉降系數(shù)(s)不同，真核生物核糖體RNA(rRNA)的主要亞基可分為18s和28s兩個(gè)亞基。在RNA 提取過(guò)程中由于RNA 極易降解，因此28s和18s含量和比值常用作衡量RNA 完整性的指標(biāo)。從大米樣品中提取的一種真菌RNA 質(zhì)控結(jié)果如圖3 所示。結(jié)果顯示該RNA 樣本的28s和18s比值（28s/18s）為2.18，兩個(gè)信號(hào)峰完整。同時(shí)該RNA樣本的質(zhì)量指數(shù)RQN 值為9.84，DV200 值為97.3(片段長(zhǎng)度大于200 bp 的比例)，RNA 質(zhì)量較高。

圖3 一種真菌RNA 質(zhì)控結(jié)果

該樣本用Nanodrop 檢測(cè)結(jié)果顯示：260 nm 的吸光度與280 nm 的吸光度比值(OD260/OD280)為2.16，260 nm 的 吸 光 度 與230 nm 的 吸 光 度 比 值（OD260/OD230）為2.51。用Nanodrop 檢測(cè)RNA 樣本時(shí)OD260/OD280值在1.8～2.2 之間，OD260/OD280的比值在1.6～2.5 之間，表示樣本質(zhì)量較好。但是降解的核酸片段仍然在260 nm 處有很強(qiáng)的吸收峰，因此Nanodrop 檢測(cè)的濃度并不代表樣本中完整核酸的濃度。如圖3 所示，Qsep100 可以給出該樣本的RQN 值為9.84(0～10，不小于7 有效[15])以及DV200 值為97.3%，據(jù)此可判斷該RNA 樣本質(zhì)量較高并可用于NGS 測(cè)序或后續(xù)PCR 實(shí)驗(yàn)[15-18]。有文獻(xiàn)證明DV200 參數(shù)更能表征樣本的完整性[16]，而這一參數(shù)是Nanodrop 及Qubit 所不能夠提供的。

4 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

在儀器檢測(cè)過(guò)程中，為達(dá)到高質(zhì)量、重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在試劑準(zhǔn)備、儀器質(zhì)控、參數(shù)設(shè)置、數(shù)據(jù)分析等方面有許多需要使用者注意的事項(xiàng)。

(1)檢測(cè)前需提前30 min 將卡夾放置室溫平衡，以保障預(yù)制膠的均一性和穩(wěn)定性。

(2)對(duì)于核酸卡夾，樣品臺(tái)S 槽內(nèi)加分離液，P、W、C 位置為清洗槽，加超純水。而蛋白卡夾則不同，為平衡毛細(xì)管中電解質(zhì)，P、W、C、S 四個(gè)卡槽均加入1×蛋白分離液。P、W、C 和S 槽中的液面高度以緩沖液槽的刻度線處為宜，不能低于槽體積的2/3。

(3) RNA 和DNA 樣本的分離液濃度不同，最好在緩沖液槽邊緣標(biāo)注DNA 或RNA 字樣以示區(qū)別。同時(shí)，在儀器使用記錄本中記錄當(dāng)前檢測(cè)的樣本具體信息。

(4)樣本體積不少于10 μL (15 μL 以上最好)，但實(shí)際進(jìn)樣體積不足1 μL。放置樣本和緩沖液后，請(qǐng)確保點(diǎn)擊“P”，將樣本盤(pán)回歸原位，再點(diǎn)擊“Run”或進(jìn)行下一步操作，否則容易造成儀器樣本托盤(pán)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中撞彎或撞斷毛細(xì)管尖端。

(5)樣本管使用帶蓋的離心管時(shí)，最好剪去蓋子，或是將蓋子下壓并低于管面高度，以防蓋子打彎毛細(xì)管。加熱過(guò)的8 聯(lián)管或者96 孔板，請(qǐng)檢查兩側(cè)是否因受熱而翹起。實(shí)驗(yàn)前需檢查實(shí)驗(yàn)室自備的0.2 mL PCR 管是否匹配，有些品牌的0.2 mL PCR 管放置樣本盤(pán)后不能按壓到底部導(dǎo)致樣本管過(guò)高，導(dǎo)致卡夾移動(dòng)過(guò)程中容易打彎卡夾或者把管子打飛，造成不可挽回的后果。

(6)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需時(shí)刻關(guān)注實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)，儀器檢測(cè)過(guò)程中黑色電流線應(yīng)保持穩(wěn)定，如波動(dòng)較大，很可能是膠閑置過(guò)久造成的，建議先進(jìn)行通膠(T-purge 或HV-T-purge)，然后再進(jìn)行質(zhì)控和樣本檢測(cè)。

(7)數(shù)據(jù)分析時(shí)不同參數(shù)設(shè)置可能會(huì)影響最終的定量值，同一批檢測(cè)需設(shè)置相同的參數(shù)。以下我們將對(duì)同一樣本進(jìn)行不同參數(shù)的數(shù)據(jù)分析，比較所得的結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

對(duì)同一分子質(zhì)量標(biāo)記(20～5 000 堿基對(duì))數(shù)據(jù)進(jìn)行不同參數(shù)的分析結(jié)果如圖4 所示。以分子質(zhì)量標(biāo)記為20～5 000 堿基對(duì)中遷移時(shí)間為154.88 s 的條帶為例(圖中箭頭所示)，用不同的基線和峰閾值線參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果見(jiàn)表2。由圖4 和表2可以看出，當(dāng)設(shè)置不同參數(shù)時(shí)，對(duì)同一條帶檢測(cè)的濃度也不同，因此同一批實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置相同的分析參數(shù)，以防止數(shù)據(jù)分析中人為造成的差異。

表2 不同參數(shù)設(shè)置對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量標(biāo)記為20～5 000 bp 中遷移時(shí)間為154.88 s 的條帶濃度

圖4 不同參數(shù)設(shè)置對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記數(shù)據(jù)

5 儀器維護(hù)

Qsep100 核酸蛋白分析系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單，僅需四步即可完成多達(dá)96 個(gè)樣本的自動(dòng)檢測(cè)，同時(shí)無(wú)需太多的維護(hù)工作，特別適合在儀器共享平臺(tái)中開(kāi)放共享。但是為了保證儀器及卡夾狀態(tài)的穩(wěn)定性，除了實(shí)驗(yàn)檢測(cè)前必需的卡夾校準(zhǔn)外，在儀器開(kāi)放過(guò)程中，還需要做到如下幾點(diǎn)：

(1)儲(chǔ)存卡夾時(shí)需豎直放置，每天檢測(cè)前執(zhí)行通膠步驟。通膠方式有3 種：第1 種，軟件Direct Control-purge 設(shè)置180 s，該過(guò)程僅通氣，不加電。第2 種，軟件參數(shù)設(shè)置界面method-T-purge，設(shè)置“run”為“5”(運(yùn)行5 個(gè)周期，每個(gè)周期120 s)。第3 種，軟件參數(shù)設(shè)置界面method-T-HV purge 為“8 kV，120 s”，加電通膠，速度快。

(2)如果在2～3 h 內(nèi)繼續(xù)使用，可不取出卡夾，卡夾無(wú)需再次質(zhì)控，可直接檢測(cè)。但建議每次試驗(yàn)重新檢測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記“size marker”，以方便對(duì)樣本進(jìn)行準(zhǔn)確的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定。

6 結(jié)語(yǔ)

核酸蛋白檢測(cè)是分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)，同時(shí)也是其它分子實(shí)驗(yàn)如PCR、RNA-seq、下一代測(cè)序等實(shí)驗(yàn)的上游實(shí)驗(yàn)。核酸蛋白檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏性直接決定了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，是大多數(shù)分子實(shí)驗(yàn)的基石。Qsep100 核酸蛋白分析系統(tǒng)提供了一種快速、簡(jiǎn)單且高靈敏性的檢測(cè)方法，但在檢測(cè)范圍、靈敏性、絕對(duì)定量等方面仍有很大的提升空間，比如目前僅能對(duì)蛋白進(jìn)行定性檢測(cè)，無(wú)法進(jìn)行定量測(cè)定，也就是說(shuō)該儀器還無(wú)法替代傳統(tǒng)的Western Blot實(shí)驗(yàn)。將來(lái)核酸蛋白檢測(cè)必定向多參數(shù)、高特異性、高準(zhǔn)確度、更便捷的方向發(fā)展，將極大助力其它分子生物學(xué)的研究。