陳小鋼， 黃幼萍， 莊江峰， 林彩固， 張 昊， 余運(yùn)龍

（福建江夏學(xué)院a.電子信息科學(xué)學(xué)院；b.數(shù)字福建物聯(lián)網(wǎng)智能家居信息采集與處理實(shí)驗(yàn)室，福州 350108）

0 引 言

創(chuàng)新是當(dāng)代大學(xué)生應(yīng)當(dāng)具備的重要素質(zhì)，是社會(huì)發(fā)展、國家興盛的重要保障［1］。培養(yǎng)具有創(chuàng)新素質(zhì)的人才是時(shí)代的迫切需求，而高校教育作為高素質(zhì)創(chuàng)新人才培養(yǎng)的重要基地，應(yīng)當(dāng)把教學(xué)改革的重點(diǎn)著眼于創(chuàng)新型人才培養(yǎng)，這是一項(xiàng)關(guān)系全局的系統(tǒng)工程［2-3］。綜合性實(shí)驗(yàn)是學(xué)生綜合運(yùn)用多門課程內(nèi)容、技能和方法完成相關(guān)考驗(yàn)，是集分析、設(shè)計(jì)、實(shí)踐于一體的復(fù)合型實(shí)驗(yàn)［4-6］。對(duì)比于一般的演示性和驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，綜合性實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生在具備一定的知識(shí)和技能儲(chǔ)備的基礎(chǔ)上進(jìn)行更深入的思考與實(shí)踐，是培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)素養(yǎng)和創(chuàng)新能力的重要途徑。傳統(tǒng)工程光學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要以演示性和驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)為主，學(xué)生沒有自主選擇、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的機(jī)會(huì)，不利于學(xué)生科研能力和創(chuàng)新意識(shí)的培養(yǎng)［7-10］。因此，在工程光學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容中設(shè)計(jì)更多的綜合性實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)光電專業(yè)學(xué)生創(chuàng)新素質(zhì)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

顯微鏡作為一種典型的光學(xué)系統(tǒng)，被廣泛運(yùn)用于生物成像、醫(yī)學(xué)檢測(cè)、材料表征等領(lǐng)域［11-15］。不同于普通光學(xué)顯微鏡，熒光顯微鏡成像技術(shù)具有：①高對(duì)比度和分辨率，圖像信噪比高，能夠獲得更多樣品細(xì)節(jié)信息；②高度特異性與靈敏性，能夠?qū)崿F(xiàn)微量物質(zhì)的量化和進(jìn)行多標(biāo)記功能成像；③部分低毒的熒光染料能夠?qū)崿F(xiàn)活體染色和成像研究等優(yōu)點(diǎn)。目前實(shí)驗(yàn)室中的熒光顯微鏡一般購置商業(yè)顯微鏡，如奧林巴斯（Olympus）、尼康（Nikon）、徠卡（Leica）、蔡司（Zeiss）等進(jìn)口品牌。一方面，商業(yè)熒光顯微鏡價(jià)格昂貴，增加了實(shí)驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。另一方面，商業(yè)熒光顯微鏡一般將光源、激發(fā)模塊、采集模塊集合在一起，并做了光路封閉處理，不方便對(duì)儀器按實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行改造和加裝模塊。此外，在教學(xué)上，商業(yè)封閉式的顯微鏡也不利于教學(xué)使用，學(xué)生對(duì)熒光顯微鏡僅有概念上的認(rèn)識(shí)，缺乏對(duì)各部分的實(shí)物認(rèn)知。為了提高課堂教學(xué)效果，促進(jìn)學(xué)生將光學(xué)理論與光學(xué)儀器設(shè)計(jì)有機(jī)融合，進(jìn)一步將前沿學(xué)術(shù)熱點(diǎn)融入課堂教學(xué)中，本文基于工程光學(xué)基本理論設(shè)計(jì)了自制熒光顯微鏡的研究型綜合實(shí)驗(yàn)。學(xué)生通過分析、設(shè)計(jì)并完成開放式熒光顯微鏡系統(tǒng)的搭建，既能加深對(duì)工程光學(xué)理論知識(shí)的理解，同時(shí)滿足科學(xué)實(shí)驗(yàn)需求，進(jìn)一步開展科學(xué)研究?？傊ㄟ^理論與實(shí)踐相結(jié)合，不僅可以有效培養(yǎng)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，提升學(xué)生理論分析能力和實(shí)踐動(dòng)手能力，而且能進(jìn)一步激發(fā)學(xué)生對(duì)科研的熱情與探索欲，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新精神，引領(lǐng)學(xué)生積極參與學(xué)科競賽和創(chuàng)新項(xiàng)目申報(bào)。

1 熒光顯微鏡系統(tǒng)設(shè)計(jì)思路

一般光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)如圖1（a）所示，其主體部分包括前端的物鏡和后端的目鏡組成。物體經(jīng)顯微鏡物鏡和目鏡進(jìn)行二次放大成像，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)微小物體的高倍放大，使人眼能觀察到物體的細(xì)節(jié)［16］。熒光顯微鏡主要是在傳統(tǒng)顯微鏡的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，其結(jié)構(gòu)可按圖1（b）所示進(jìn)行設(shè)計(jì)。圖中，該結(jié)構(gòu)一方面引入激發(fā)光源用于熒光激發(fā)，一般熒光光源有：特定波長的激光光源或者汞燈等寬波長光源；另一方面需要配置熒光發(fā)射、收集濾色片，用于對(duì)激發(fā)波長的選擇、熒光信號(hào)的過濾和收集。

2 開放式熒光顯微鏡系統(tǒng)光路搭建

實(shí)驗(yàn)從大恒光電、基座光學(xué)購置所需光學(xué)元件用于自主搭建熒光顯微鏡系統(tǒng)。主要光學(xué)元件包括平凸透鏡、可調(diào)光闌、衰減片、濾色片、LED白光燈源、物鏡、套筒、支架等，其光路結(jié)構(gòu)示意圖如圖2（a）所示。整個(gè)系統(tǒng)可以分為激光擴(kuò)束系統(tǒng)、光路抬升系統(tǒng)、白光照明系統(tǒng)、筒鏡匹配、雙光路分光系統(tǒng)等部分，并可進(jìn)行調(diào)節(jié)。

（1）激光擴(kuò)束系統(tǒng)。為了能實(shí)現(xiàn)更好的熒光激發(fā)成像效果，系統(tǒng)采用固體激光器作為激發(fā)光源。激光出來首先經(jīng)過一個(gè)可調(diào)衰減片，實(shí)現(xiàn)對(duì)光功率的可調(diào)控制。由于激光輸出光束直徑較小且?guī)в幸欢òl(fā)散角，因此激發(fā)前需要對(duì)激光光束進(jìn)行擴(kuò)束與準(zhǔn)直。根據(jù)幾何光學(xué)望遠(yuǎn)鏡系統(tǒng)相關(guān)知識(shí)，采用兩塊平凸透鏡來搭建一個(gè)望遠(yuǎn)鏡系統(tǒng)，用于激光束的擴(kuò)束。透鏡焦距比為1∶3（f1∶f2＝50∶150），可實(shí)現(xiàn)對(duì)激光束3倍擴(kuò)束。另外需要注意的是，為了更好地防止激光光束經(jīng)其他鏡面反射回諧振腔，影響激光穩(wěn)定性，平凸透鏡可按圖2（a）中激光擴(kuò)束系統(tǒng)所示方向擺放（平面朝外）。此外，在兩透鏡中間焦點(diǎn)附近加入一個(gè)光闌（等效針孔），可以進(jìn)一步消除激光的強(qiáng)度噪聲，得到更高質(zhì)量激光束。

（2）光路抬升系統(tǒng)。本次搭建顯微鏡屬于正置型顯微鏡，由于激光器置于光學(xué)平臺(tái)上，其輸出光束高度較低，為了將其耦合入物鏡，需對(duì)激光光束進(jìn)行抬升。實(shí)驗(yàn)利用一對(duì)成45°放置的反射鏡構(gòu)成一個(gè)潛望抬升系統(tǒng)，用于實(shí)現(xiàn)光路的水平抬升，如圖2（a）中光路抬升系統(tǒng)所示。另外，兩個(gè)反射鏡均置于二維調(diào)節(jié)鏡架上，通過調(diào)節(jié)其左右和俯仰角度，配合兩個(gè)光闌（也可以用一個(gè)光闌進(jìn)行前后移動(dòng)），可以調(diào)節(jié)激光光束的水平輸出，滿足與其他元件之間的等高共軸調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)過程中應(yīng)注意沿光路方向第一個(gè)透鏡調(diào)節(jié)光斑在第一個(gè)光闌的位置（靠近透鏡的位置），第二個(gè)透鏡調(diào)節(jié)光斑在遠(yuǎn)端第二個(gè)光闌上的位置，當(dāng)光斑同時(shí)落在前后兩個(gè)光闌中心位置時(shí)，此時(shí)光路實(shí)現(xiàn)對(duì)準(zhǔn)。

（3）白光照明系統(tǒng)。在光學(xué)顯微鏡中，由于觀察物體一般不發(fā)光，因此需要借助外部光源進(jìn)行照明。為了方便對(duì)樣品的觀察，所搭建的顯微系統(tǒng)除了激光激發(fā)光源外，還加入了一路白光照明。在設(shè)計(jì)顯微鏡照明系統(tǒng)光路時(shí)，最直接方法就是將光源直接聚焦于樣品上，即臨界照明方式。其優(yōu)點(diǎn)在于光能利用率高，有助于提高分辨率。不足之處在于，此時(shí)相當(dāng)于將光源置于樣品面上，因此光源像會(huì)出現(xiàn)在最終的成像面上，影響顯微鏡的觀察效果。此外，這種照明方式?jīng)]辦法控制樣品照明區(qū)域。改進(jìn)的方法就是采用科勒照明方式，將光源遠(yuǎn)離樣品平面，這樣能夠避免光源出現(xiàn)在成像面，同時(shí)實(shí)現(xiàn)較高的光能利用率和較大且可調(diào)的照明角度，非常適合顯微系統(tǒng)照明使用。因此，在搭建過程中，以白光燈源、透鏡、物鏡和兩個(gè)光闌構(gòu)成科勒照明系統(tǒng)，其光路如圖2（a）所示。

（4）筒鏡匹配原則。當(dāng)觀察者使用目鏡觀察時(shí)，顯微鏡系統(tǒng)的放大倍率由物鏡與目鏡兩者的放大倍率共同決定，即：

式中：Γ為顯微鏡系統(tǒng)整體的放大率；Γobj為物鏡的放大率；Γeye為目鏡放大率。

對(duì)于利用外接CCD進(jìn)行成像時(shí)，顯微物鏡的實(shí)際放大率還與相機(jī)的套筒透鏡的焦距有關(guān)。當(dāng)采用不同顯微鏡制造商的物鏡進(jìn)行成像時(shí)，其物鏡有效放大率為：

式中：Γeff為顯微物鏡的有效放大率；Γobj為印在物鏡上的放大率；fsystem為所用顯微鏡系統(tǒng)中套筒透鏡的焦距；fdesign為物鏡制造商用來計(jì)算設(shè)計(jì)放大倍率所用套筒透鏡的焦距，如徠卡、尼康、三豐等物鏡制造商所設(shè)計(jì)的套筒透鏡焦距為200 mm，而奧林巴斯物鏡套筒焦距為180 mm，蔡司物鏡為165 mm。通過計(jì)算物鏡的有效放大倍率之后，便可得出系統(tǒng)的整體放大倍率。因此，為了方便計(jì)算系統(tǒng)放大率，筒鏡焦距采用與物鏡設(shè)計(jì)的套筒焦距一致，即奧林巴斯物鏡需要匹配焦距為180 mm的筒鏡，此時(shí)系統(tǒng)放大倍率即物鏡上的放大倍數(shù)。

（5）雙光路分光系統(tǒng)。熒光顯微鏡系統(tǒng)需要對(duì)收集光波段進(jìn)行選擇，因此需要搭配濾色片組使用。一套濾色片組由入射光濾色片、二向色鏡和出射濾色片組成。首先激發(fā)濾色片選取需要的激發(fā)波長，通過二向色鏡發(fā)射到樣品上，樣品發(fā)射的熒光先通過二向色鏡和發(fā)射濾色片最后進(jìn)入顯微鏡的采集模塊。在搭建的顯微系統(tǒng)中，激發(fā)光波長由激光器發(fā)出的波長決定，因此不需要采用激發(fā)濾色片。在物鏡前設(shè)置一個(gè)45°放置的長波通二向色鏡，這樣就可以將波長較短的激發(fā)激光反射進(jìn)物鏡。激發(fā)的熒光通過二向色鏡透射進(jìn)入到采集光路中。此外，由于搭建的熒光顯微鏡系統(tǒng)能同時(shí)進(jìn)行CCD成像與光譜雙路采集，因此在終端需要加入一個(gè)半透半反鏡進(jìn)行分光，分光比1∶1。

3 熒光顯微鏡系統(tǒng)性能測(cè)試

實(shí)驗(yàn)所搭建的開放式熒光顯微鏡系統(tǒng)實(shí)物如圖2（b）所示，接下來對(duì)熒光顯微鏡系統(tǒng)進(jìn)行性能測(cè)試。

3.1 系統(tǒng)分辨率測(cè)試

在光學(xué)顯微鏡成像中，當(dāng)兩個(gè)物點(diǎn)靠得很近時(shí)，經(jīng)過光學(xué)系統(tǒng)成像后形成的衍射光斑存在重疊的情況，出現(xiàn)不能被分辨的情況。因此，定義當(dāng)兩個(gè)相鄰像點(diǎn)之間剛好能被分辨的距離為光學(xué)系統(tǒng)的分辨率。熒光顯微鏡中，根據(jù)道威判據(jù)，當(dāng)兩個(gè)相鄰像點(diǎn)之間的距離等于艾里斑半徑（a＝0.61）的0.85倍時(shí)能被光學(xué)系統(tǒng)分辨，此時(shí)對(duì)應(yīng)的物方兩點(diǎn)的最短距離，即顯微鏡系統(tǒng)分辨率極限為［17］：

式中：λ為入射光的波長；NA＝nsin θ為顯微物鏡的數(shù)值孔徑。從式（3）可知，入射光波長和物鏡的數(shù)值孔徑?jīng)Q定了顯微鏡的分辨率。

本次搭建的顯微系統(tǒng)采用的20×平場(chǎng)消色差長工作距物鏡，其數(shù)值孔徑NA＝0.4，當(dāng)采用白光LED光源照明（大恒光電GCI-060411，440～670 nm），理論分辨率極限為572～871 nm。為測(cè)試系統(tǒng)的分辨率，本次采用1 μm大小的聚苯乙烯（PS）微球（上海譯元生物科技有限公司，1 μm）溶液進(jìn)行測(cè)試。實(shí)驗(yàn)上將PS微球溶液滴于載破片上并放置于物鏡下觀察，其測(cè)試結(jié)果如圖3所示。從圖3（a）可見，搭建的顯微系統(tǒng)可以輕松地分辨出1 μm的PS小球的輪廓。圖3（b）所示是相鄰微球的圖像灰度值分布曲線，通過測(cè)量能夠清晰測(cè)得微球直徑和距離。因此，本顯微系統(tǒng)分辨率接近此處系統(tǒng)的衍射極限。

3.2 熒光成像測(cè)試

搭建的熒光顯微鏡集白光和激光照明于一體，同時(shí)數(shù)據(jù)采集部分采用雙光路設(shè)計(jì)，通過一個(gè)分光鏡能夠?qū)崿F(xiàn)圖像與光譜共采集，在獲得熒光成像圖像的同時(shí)對(duì)其熒光光譜進(jìn)行實(shí)時(shí)記錄。實(shí)驗(yàn)選用CCD（大恒光電，MER-U3-L）進(jìn)行圖像采集，采用USB光纖光譜儀（復(fù)亨，F(xiàn)X4000，345～1 148 nm，50 μm slit）進(jìn)行光譜采集。本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞壁經(jīng)過固綠染色的固定鈴蘭草根莖切片進(jìn)行測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。圖4（a）為白光照明下鈴蘭草根莖切片的明場(chǎng)圖像，圖4（b）為熒光圖像。可見，在激光（半導(dǎo)體激光器，532 nm，3 mW）激發(fā)下鈴蘭草切片能夠發(fā)出明亮紅色熒光，其圖像對(duì)比度明顯優(yōu)于白光照明［見圖4（a）］，極大提高了圖像分辨率。如圖4（c）所示，本系統(tǒng)可以同時(shí)采用雙通道照明，即熒光與明場(chǎng)共成像，這樣能夠顯示更多觀測(cè)物的細(xì)節(jié)，便于科學(xué)研究。

該自制熒光顯微鏡系統(tǒng)還能通過光譜儀獲得熒光成像光譜。從圖4（d）所示的光譜曲線可見，熒光光譜范圍在550～800 nm（在熒光采集端，為了防止激發(fā)光光強(qiáng)太強(qiáng)對(duì)光譜儀造成損害，在光譜儀前還額外使用一個(gè)550 nm高通濾色片進(jìn)行過濾），其峰值波長在650 nm左右，與標(biāo)記的染料熒光信息一致。熒光光譜波長分布蘊(yùn)含著被測(cè)物質(zhì)的成分結(jié)構(gòu)信息，其熒光強(qiáng)度又與物質(zhì)含量或濃度等信息相關(guān)，結(jié)合熒光圖像和熒光光譜能夠更好地對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量的分析，因此該自制的熒光顯微鏡性能優(yōu)于一般單熒光成像的顯微鏡。

4 結(jié) 語

熒光顯微鏡在光學(xué)顯微鏡中占據(jù)重要地位，被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域研究。然而，商業(yè)熒光顯微鏡價(jià)格昂貴，集成度高，不適用于教學(xué)演示以及功能擴(kuò)展。本文利用工程光學(xué)相關(guān)理論，引導(dǎo)學(xué)生自主搭建一套集白光照明、激光激發(fā)、熒光成像與光譜檢測(cè)于一體的開放式熒光顯微鏡，實(shí)現(xiàn)了熒光顯微鏡系統(tǒng)的低成本和高度可擴(kuò)展性。該綜合性實(shí)驗(yàn)內(nèi)容適用于理工科類，特別是光電相關(guān)專業(yè)本科生的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，作為光學(xué)、工程光學(xué)、光學(xué)設(shè)計(jì)等課程的實(shí)驗(yàn)課程開展。在實(shí)驗(yàn)過程中，學(xué)生能夠親自動(dòng)手完成對(duì)光學(xué)系統(tǒng)元件的選擇、基本光路的搭建和系統(tǒng)性能測(cè)試，并結(jié)合相關(guān)理論知識(shí)解決搭建過程中遇到的問題，如：利用望遠(yuǎn)鏡系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)激光光束的擴(kuò)束與準(zhǔn)直；利用兩個(gè)反射鏡實(shí)現(xiàn)光路的抬升以及光路等高共軸調(diào)節(jié)；利用分光鏡實(shí)現(xiàn)圖像與光譜雙光路共采集等問題。在實(shí)驗(yàn)過程中，完成對(duì)學(xué)生理論知識(shí)能力、動(dòng)手實(shí)驗(yàn)?zāi)芰?、解決問題能力的綜合考察。

此外，本綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的熒光顯微鏡屬于開放式系統(tǒng)，可以在此基礎(chǔ)上進(jìn)行更多的升級(jí)和改造。如在激發(fā)光前端增加偏振控制組件和采集端增加檢偏裝置，就可以實(shí)現(xiàn)偏振熒光的檢測(cè)。另外，針對(duì)多重?zé)晒夤矘?biāo)記樣品，可以通過增加激發(fā)光路，實(shí)現(xiàn)多路光共激發(fā)，從而獲得多標(biāo)記熒光圖像?？傊?，該系統(tǒng)擴(kuò)展性強(qiáng)，能夠滿足不同科研需求。在完成該綜合性實(shí)驗(yàn)后，教師可指導(dǎo)學(xué)生以該系統(tǒng)為基礎(chǔ)，進(jìn)行各方面科學(xué)研究，進(jìn)一步申報(bào)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)、實(shí)驗(yàn)科研等項(xiàng)目和光電設(shè)計(jì)競賽，促進(jìn)本科生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)。

綜上，將開放式熒光顯微鏡構(gòu)建實(shí)驗(yàn)引入本科生綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，有利于理工科學(xué)生理論知識(shí)的鞏固和實(shí)驗(yàn)技能的培養(yǎng)。以此為基礎(chǔ)，能夠進(jìn)一步激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)新思維和科研探究的興趣，促進(jìn)創(chuàng)新性應(yīng)用型本科人才的培養(yǎng)。