郭忠聰，龔 純

(湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，湖南 長沙 410007)

大腸癌(Colorectal cancer，CRC)是消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病部位為結(jié)腸、直腸。大腸癌的發(fā)病率和病死率均較高，五年生存率低，是全球第三大惡性腫瘤[1]，嚴重威脅人類生命健康。飲食結(jié)構(gòu)不合理、飲食不規(guī)律、作息時間紊亂、過度肥胖、大量飲酒、吸煙等均是大腸癌的危險因素[2-3]。近年來，隨著人們生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國流行病學調(diào)查顯示大腸癌發(fā)病率急劇上升[4]。目前，大腸癌常按照腫瘤分期選擇治療方式，包括外科手術(shù)切除治療、化學藥物治療、物理放射治療、靶向藥物治療、免疫藥物治療、中醫(yī)中藥治療等。雖然，近年來多學科會診模式逐漸興起，藥物臨床研究日益豐富，但是大腸癌術(shù)后五年生存率僅約50%[5-6]。肝轉(zhuǎn)移是大腸癌患者死亡的主要原因，約50%的大腸癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移[7-8]，發(fā)生肝轉(zhuǎn)移者中位生存期僅為6～12個月[9]。綜上所述，探究大腸癌肝轉(zhuǎn)移發(fā)病機制及有效防治策略意義深遠。

大腸癌屬中醫(yī)“腸覃”“臟毒”“鎖肛痔”等病癥范疇?！夺t(yī)宗金鑒》中論述：“此病有內(nèi)外陰陽之別”，說明大腸癌病因復(fù)雜，與飲食不節(jié)、邪毒內(nèi)侵、情志不遂、臟腑虛損等因素相關(guān)，正虛為本、濕熱瘀毒為標是大腸癌的病機特點，其局部以濕熱瘀毒為主，屬實，整體以脾腎虧虛為主，屬虛?？拱┓酪破等婷t(yī)經(jīng)驗方，以健脾補腎、化瘀解毒為法組方而成。近年來，本課題組臨床運用抗癌防移片防治常見惡性腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，收獲滿意的臨床療效。前期臨床研究顯示，抗癌防移片聯(lián)合化療不僅可提高大腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的疾病緩解率，還可降低Ⅲ期結(jié)腸癌術(shù)后患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率[10-11]。本研究預(yù)實驗顯示抗癌防移片可降低結(jié)腸癌模型小鼠肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率，但其具體機制尚不明確。本研究以結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型為研究對象，以血清肝細胞生長因子(HGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)為切入點，研究抗癌防移片抗大腸癌肝轉(zhuǎn)移的分子機制，報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞 SPF級雄性ICR小鼠50只購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，體重20～25 g。動物許可證號[SCXK(湘)2016-0002]，實驗單位使用許可證號[SYXK(湘)2015-0003]，動物實驗倫理批號(ZYFY20190920)。飼養(yǎng)環(huán)境：溫濕度適宜，晝夜各12 h的SPF級動物房。小鼠結(jié)腸腺癌細胞株(CT26)購自Procell公司。

1.2 實驗藥物 抗癌防移片由湖南中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院藥劑科生產(chǎn)，組方包括紅參、半枝蓮、黃芪、薏苡仁、姜黃、女貞子、墨旱蓮、莪術(shù)、九香蟲、枸杞子、白術(shù)、湘曲。

1.3 實驗試劑 HGF、血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGF-A)ELISA檢測試劑盒購自上海晶天生物科技有限公司；胎牛血清(批號NVW0526)購買自浙江天杭生物科技有限公司；PBS粉(批號ZLI-9062)購買自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；進口石蠟購買自德國徠卡儀器有限公司；蘇木素溶液和伊紅溶液購買自美國Sigma公司。

1.4 實驗儀器 潔凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)；TP-2000E型電子天平(湖南湘儀儀器有限公司)；DW-HL-3985型美菱超低溫冰箱(中科美菱低溫科技股份有限公司)；倒置顯微鏡和照相裝置(日本OLYMPUS)；Z32HK臺式高速冷凍離心機(杭州英斯特科技有限公司)；KS400型圖像分析儀(德國ZISSE)；BM-VⅡ型生物組織包埋機(冷臺)(孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)；3050S型冷凍切片機(德國徠卡有限公司)；液氮罐(成都金鳳液氮容器有限公司)。

1.5 實驗方法

1.5.1 細胞株的制備：常規(guī)培養(yǎng)CT26細胞于含10%胎牛血清的RPMI1640營養(yǎng)液。取對數(shù)生長期的細胞，消化吹打成單細胞懸液，1000 r/min離心5 min，棄上清液，加適量不含血清的RPMI1640營養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至2×106個/ml。

1.5.2 模型制備：造模前小鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射5%水合氯醛5 mg/kg麻醉，于背側(cè)中部、左側(cè)腋中線與腋后線間，取1.5 cm左右切口進腹，顯露脾臟。模型組用1 ml注射器于脾臟上極沿脾臟縱軸進針，邊退邊注入50 μl的CT26細胞懸液(2×106個/ml)。在注射部位可見脾被膜發(fā)白、腫脹，慢慢旋出針頭，立即用蘸有碘伏的消毒棉簽止血按壓3 min，觀察無活動性出血后，將脾臟送回腹腔，關(guān)腹，先縫合肌肉層，再縫合皮層。

1.5.3 分組與給藥：50只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選取10只為假手術(shù)組，剩下40只小鼠制備大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。造模后1周，選取30只造模成功的小鼠，隨機分為模型組、抗癌防移片高劑量組、抗癌防移片低劑量組，每組10只?？拱┓酪破?、低劑量組分別給予2、1 g/ml抗癌防移片混懸液灌胃，假手術(shù)組、模型組給予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d，連續(xù)給藥4周。

1.5.4 樣本采集：末次給藥后，禁食不禁水12 h，眼球取血于1.5 ml的EP管中，室溫靜置4 h，4500 r/min離心10 min，取上清液于新的EP管中，超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。取血后開腹，各組小鼠取同位置大腸2～3 cm和肝臟組織，0.9%氯化鈉溶液清洗后，4%多聚甲醛固定，待測。

1.5.5 一般情況和體重變化：觀察比較各組小鼠造模前及給藥期間精神狀態(tài)、毛發(fā)、行為活動、二便等，觀察各組小鼠給藥期間體重變化和肝臟瘤體重量。

1.5.6 ELISA法檢測血清CA199、CEA、HGF、VEGF-A水平：取超低溫冰箱保存的血清樣本，按照試劑盒說明書操作，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，通過標準曲線計算樣品中CA199、CEA、HGF、VEGF-A濃度。

1.5.7 大腸及肝臟的病理學改變：多聚甲醛固定包埋大腸及肝臟組織，流水沖洗組織中殘存的多聚甲醛，梯度乙醇脫水，徹底脫水后浸入無水乙醇，浸蠟包埋，切成厚度為4 μm的切片，展片、撈片、烤片、脫蠟、乙醇浸入，采用中性樹膠封片，在光鏡下觀察、拍照。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 27.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間和組內(nèi)不同時間點均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間同一時間點均數(shù)比較采用t檢驗；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般情況觀察 造模前，各組小鼠精神狀態(tài)佳，行為活動、飲食飲水及二便均正常，毛發(fā)有光澤。造模1周后模型組和抗癌防移片高、低劑量組小鼠逐漸出現(xiàn)腹脹、毛發(fā)枯糙、體形消瘦、行動遲緩、大便稀溏、小便發(fā)黃等。給藥后24～28 d，模型組、抗癌防移片低劑量組小鼠食欲減退、體重明顯下降、毛發(fā)脫落、大便溏薄、靜臥不動，抗癌防移片高劑量組小鼠精神狀態(tài)較低劑量組明顯改善。假手術(shù)組小鼠在實驗期間一般情況無明顯變化。

2.2 各組小鼠體重比較 見表1。給藥前及給藥1周，各組小鼠體重比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；給藥2、3、4周，與假手術(shù)組比較，其余各組小鼠體重均明顯下降(P<0.05)，其中模型組下降最顯著，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 各組小鼠體重比較(g)

2.3 各組小鼠肝臟瘤體重量比較 見表2。與模型組小鼠比較，抗癌防移片高劑量組肝臟瘤體重量降低(P<0.05)。

表2 各組小鼠肝臟瘤體重量比較(g)

2.4 各組小鼠血清CA199、CEA水平比較 見表3。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清CA199、CEA水平均明顯升高(P<0.05)。與抗癌防移片高劑量組比較，抗癌防移片低劑量組及模型組小鼠血清CA199、CEA水平均明顯升高(P<0.05)。

表3 各組小鼠血清CA199、CEA水平比較

2.5 各組小鼠血清HGF、VEGF-A水平比較 見表4。與假手術(shù)組比較，抗癌防移片低劑量組及模型組小鼠血清HGF、VEGF-A水平均明顯升高(P<0.05)，抗癌防移片高劑量組小鼠血清VEGF-A水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，抗癌防移片高劑量組小鼠血清HGF、VEGF-A水平均明顯降低(P<0.05)。

表4 各組小鼠血清HGF、VEGF-A水平比較(pg/ml)

2.6 各組小鼠大腸及肝臟組織病理改變 見圖1。假手術(shù)組大腸及肝臟組織未見腫瘤細胞，細胞形態(tài)規(guī)整。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腸上皮可見明顯的腺癌細胞分布，腫瘤細胞異型性明顯，數(shù)量、大小結(jié)構(gòu)不一，部分呈實性團塊或小條索狀排列，可見腺腔形成，部分排列成管狀或腺樣結(jié)構(gòu)。肝臟組織可見單個或多個結(jié)節(jié)，HE染色后，大小形態(tài)不一，異型性明顯，細胞核增多，可見病理性核分裂，與腸上皮病灶形態(tài)類似。與模型組比較，抗癌防移片高劑量組小鼠腸上皮可見腺癌細胞分布，肝臟組織可見散在小結(jié)節(jié)，HE染色后，與腸上皮病灶形態(tài)類似。與模型組比較，抗癌防移片高劑量組小鼠大腸及肝臟組織未見明顯的腫瘤細胞，細胞形態(tài)較為規(guī)整。提示抗癌防移片具有一定的抑制大腸癌肝轉(zhuǎn)移的作用。

3 討 論

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移需要充足的養(yǎng)分，與周圍新生血管的形成密切相關(guān)[12-14]。腫瘤新生血管的形成取決于局部微循環(huán)中血管生成促進因子和血管生成抑制因子[15]。VEGF被認為是最重要的血管生成促進因子[16]。有研究顯示，血清HGF與VEGF-A的表達呈正相關(guān)，HGF可能通過促進結(jié)直腸癌細胞VEGF-A的表達，進而共同促進血管新生，導致腫瘤血管聚集，從而發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移。研究證實血清HGF水平隨著大腸癌的病情進展而逐漸增高[17]。李美琴等[18]研究表明HGF的表達與大腸癌瘤體大小、浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移有關(guān)，大腸癌組織HGF的表達水平可以作為肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測指標。

“正氣存內(nèi)，邪不可干，邪之所湊，其氣必虛”，歷代醫(yī)家認為疾病的發(fā)生與正邪兩氣密切相關(guān)，大腸癌亦如此，正氣虧虛是其發(fā)病的內(nèi)因。脾腎乃先后天之本，二者相互滋養(yǎng)，諸虛之中以脾腎虧虛尤甚[19]。在脾腎虧虛的基礎(chǔ)上，加之飲食失節(jié)、感受六淫之邪或情志失調(diào)等，全身氣機失暢，血流瘀滯，瘀毒內(nèi)生，結(jié)滯成塊，聚于腸腑而為病[20-21]。華佗所著《中藏經(jīng)》有言：“夫癰疽瘡腫之所作也，皆五臟六腑蓄毒不流則生矣，非獨因榮衛(wèi)壅塞而發(fā)者也?！闭f明腫瘤的發(fā)生除與機體正氣不足有關(guān)外，亦與臟腑蓄毒密切相關(guān)。故治療可以健脾補腎、化瘀解毒為法[22]。抗癌防移片系三湘名醫(yī)經(jīng)驗方，由紅參、半枝蓮、黃芪、薏苡仁、姜黃、女貞子、墨旱蓮、莪術(shù)、九香蟲、枸杞子、白術(shù)、湘曲組成，以健脾補腎、化瘀解毒為法。臨床研究顯示，抗癌防移片可降低大腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率。

本研究結(jié)果顯示，抗癌防移片高劑量對小鼠精神狀態(tài)、大便稀溏等一般情況明顯改善，可在一定程度改善大腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠體重下降，抑制小鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤的生長，抑制大腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠血清腫瘤標記物CA199、CEA表達水平。大腸癌肝轉(zhuǎn)移與血管新生關(guān)系密切，HGF、VEGF-A可正向調(diào)節(jié)細胞有絲分裂、血管內(nèi)皮細胞增殖、血管生成等[23]。與模型組比較，抗癌防移片高劑量組小鼠血清HGF、VEGF-A表達下調(diào)，且呈劑量依賴性，提示抗癌防移片可能通過抑制HGF、VEGF-A表達發(fā)揮抗大腸癌肝轉(zhuǎn)移的作用。在光鏡下觀察大腸及肝臟病理組織變化提示，與模型組比較，抗癌防移片高劑量組小鼠大腸及肝臟未見明顯的腫瘤細胞，細胞形態(tài)較為規(guī)整。

綜上所述，抗癌防移片對預(yù)防大腸癌肝轉(zhuǎn)移有一定作用，其機制可能與抑制HGF、VEGF-A蛋白表達有關(guān)。