周麗娜，辛 歡，楊 敏，方 芳，張 藝

(武漢市第一醫(yī)院 武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，湖北 武漢 430030)

再灌注損傷為導(dǎo)致缺血性腦卒中病情加重甚至死亡的重要原因，其發(fā)生與炎性反應(yīng)、興奮性氨基酸、鈣超載以及氧自由基生成關(guān)系密切[1]。故而臨床通常使用抗炎、抑制血小板聚集以及降血脂等藥物對腦缺血再灌注損傷進(jìn)行治療[2]。中醫(yī)學(xué)將缺血性腦卒中再灌注損傷歸為“中風(fēng)病”的診療范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病的病機(jī)主要為風(fēng)、火、痰、瘀、氣、虛六端，致瘀血阻于腦絡(luò)，發(fā)為本病，故治療中常以“活血通絡(luò)”為治療原則，治療效果常較為理想[3]。丹參酚酸A提取自具有“活血通絡(luò)”作用的中藥丹參，其不僅具有抗血小板聚集的作用，同時(shí)具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，在缺血性腦卒中再灌注損傷的治療中具有良好的應(yīng)用效果[4]。熱休克蛋白(HSP)是因缺血、缺氧、損傷等應(yīng)激刺激而誘導(dǎo)產(chǎn)生的應(yīng)激性蛋白，HSP70為HSP中最主要的一種[5]。腦缺血以后機(jī)體會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)HSP70在腦中的分布和表達(dá)，另外，HSP70還具有腦細(xì)胞保護(hù)功效，可以增強(qiáng)腦細(xì)胞對缺氧、缺血的耐受性，降低致死性的損傷[6]。目前臨床上對于丹參酚酸A干預(yù)缺血再灌注損傷的作用機(jī)制尚未清楚。有研究顯示，丹參酚酸A具有抑制炎癥反應(yīng)的作用，進(jìn)而對相關(guān)癥狀進(jìn)行緩解[7]。有研究認(rèn)為，丹參酚酸A可降低腦卒中患者炎癥反應(yīng)以及血液黏度，改善患者相關(guān)癥狀[8]。也有研究顯示[9]，丹參酚酸A可對HSP的表達(dá)產(chǎn)生影響。故本文探討丹參酚酸A對腦缺血大鼠神經(jīng)功能及熱休克蛋白基因表達(dá)的影響，試探討其腦保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取80只健康清潔級成年雄性SD大鼠，體重200～220 g，自由攝食飲水，購于南京君科生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 低溫高速離心機(jī)(Eppendorf 5427 R)購于Eppendorf 中國有限公司；紫外分光光度計(jì)(DR6000)購于HACH；酶聯(lián)免疫吸附儀(M266494)購于北京若水合科技有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(ZHS-100 M)購于上海喆圖科學(xué)儀器有限公司；輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(ERM3000)購于常州市郝思琳醫(yī)用儀器有限公司；高壓蒸汽消毒鍋(LS-50 HD)購于濱江醫(yī)療。膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購于南京建成生物技術(shù)公司；氯化三苯四氮唑(TTC)購于美國Sigma公司；HSP-70抗體試劑盒、HSP-70 mRNA原位雜交檢測試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及造模方法[10]：選用80只健康成年雄性SD大鼠作為研究對象，通過線栓法制備動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型，按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為假手術(shù)組、模型組、低劑量組(10 mg/kg丹參酚酸A)和高劑量組(30 mg/kg丹參酚酸A)四組，每組20只。采用45 mg/kg的戊巴比妥鈉(2%)對大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，在其頸部正中位置進(jìn)行切口處理，將頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、左側(cè)頸總動(dòng)脈進(jìn)行分離。將ECA起始端、CCA近心端結(jié)扎后，通過夾子將翼腭動(dòng)脈進(jìn)行短暫夾閉，以此來防止誤插，再將線栓插入到CCA中，插入的深度從分叉部位計(jì)算為(18±0.5)mm。拉線栓使線頭退至頸外動(dòng)脈為再灌注的處理方法。維持術(shù)中的肛腸溫度為(37±0.5)℃，再灌注72 h，缺血時(shí)間為2 h。在再灌注后2 h及缺血期間保持大鼠體溫在(37±0.5)℃。丹參酚酸A高劑量和低劑量組在術(shù)后60 min、1 d、2 d，分別將30 mg/kg和10 mg/kg的丹參酚酸A通過腹腔注射的方式給藥。模型組和假手術(shù)組給予等量的0.9%氯化鈉溶液處理。建模成功的標(biāo)志為大鼠手術(shù)麻醉清醒后出現(xiàn)提尾時(shí)向一側(cè)轉(zhuǎn)圈、站立不穩(wěn)、左側(cè)肢體癱瘓。

1.3.2 術(shù)后24 h 腦梗死體積測定[11]：每組隨機(jī)選擇5只大鼠，斷頭處死進(jìn)行取腦，將低位腦干、小腦、嗅球棄去，將其置于-20 ℃冰箱進(jìn)行20 min的冷凍處理，在距離額極3 mm的位置進(jìn)行切片處理，每片的厚度為2 mm，之后將其置于含有1%氯化三苯基四氮唑(TTC)的水溶液中，在37 ℃條件下進(jìn)行30 min的孵育處理。此時(shí)缺血區(qū)域逐漸轉(zhuǎn)變成白色，有正常血供的腦組織逐漸轉(zhuǎn)換成紅色。染色后采用10%的甲醛溶液進(jìn)行24 h的避光保存處理，拍照后，梗死面積采用病理圖像分析儀進(jìn)行測定。根據(jù)公式V=(A1+A2+A3+A4+A5)t/2對梗死的體積進(jìn)行計(jì)算，其中A為梗死面積，t為切片的厚度。

1.3.3 神經(jīng)行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)[12]：采用 Longa評分法對蘇醒6 h以后的大鼠隨機(jī)抽取5只進(jìn)行神經(jīng)功能評分，其中昏迷或者不能自己行走的為4分；向右側(cè)傾倒者為3分；向右側(cè)旋轉(zhuǎn)為2分；右側(cè)前肢不能完全伸直為1分；無神經(jīng)缺損癥狀為0分。當(dāng)大鼠出現(xiàn)提前死亡、呼吸困難或處死后有蛛網(wǎng)膜下腔出血者均棄用。

1.3.4 腦組織相關(guān)因子水平測定：再灌注72 h后，于各組分別隨機(jī)抽取5只大鼠，麻醉后，斷頭處死取腦，將低位腦干、小腦、嗅球棄去，將其置于-20 ℃冰箱進(jìn)行20 min的冷凍處理，將腦組織進(jìn)行離心處理，制備成10%的腦勻漿。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法對GDNF及BDNF水平進(jìn)行測定；應(yīng)用硫代巴比妥法對MDA水平進(jìn)行測定；應(yīng)用DTNB法對GSH-Px水平進(jìn)行測定；應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法對SOD水平進(jìn)行測定。

1.3.5 腦組織石蠟切片的制備：分別在灌注24、48、72 h后給予大鼠再次麻醉，經(jīng)過PBS(含4%多聚甲醛)灌注固定后，將腦組織取出，以視交叉和其位置向后4 mm位置，按照這兩點(diǎn)進(jìn)行冠狀切片處理，之后常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，再進(jìn)行連續(xù)的冠狀石蠟切片，片厚為5 μm。

1.3.6 原位雜交法檢測HSP70 mRNA[13]：將上述切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化處理，通過原位雜交試劑盒對大鼠腦組織中的HSP70 mRNA進(jìn)行測定，當(dāng)胞核或者胞漿為棕色顆粒時(shí)，即為陽性染色。以PBS代替核探針，作為陰性對照，其他步驟同上。最后將陽性細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并通過高倍顯微鏡(×400)對其進(jìn)行觀察，隨機(jī)選擇5個(gè)不重疊的視野，進(jìn)行陽性細(xì)胞平均值的計(jì)算。

1.3.7 免疫組化法檢測HSP70蛋白[14]：DAB、SP試劑盒、一抗HSP70多克隆抗體均由北京百奧萊博科技有限公司提供。上述切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化處理，將第一抗體加入其中，之后通過常規(guī)SP法進(jìn)行切片的染色處理，顯色通過DAB進(jìn)行，蒸餾水沖洗、脫水、透明、封片處理，當(dāng)胞核或者胞漿為棕色顆粒時(shí)，即為陽性染色。一抗采用山羊血清或者PBS代替，作為陰性對照，其他步驟同上。最后將陽性細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，通過高倍顯微鏡(×400)對其進(jìn)行觀察，隨機(jī)選擇5個(gè)不重疊的視野，通過Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定各個(gè)視野下的光密度值，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t檢驗(yàn)；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠造模24 h后腦梗死體積比較 見表1。低劑量組、高劑量組大鼠腦梗死體積均低于模型組，且高劑量組腦梗死體積明顯更低(P<0.05)。

表1 各組大鼠造模24 h后腦梗死體積比較(mm3)

2.2 各組大鼠造模72 h后腦組織細(xì)胞因子水平比較 見表2。模型組、低劑量組、高劑量組大鼠腦組織BDNF、GDNF水平均明顯高于假手術(shù)組，且模型組、低劑量組、高劑量組腦組織BDNF、GDNF水平呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，經(jīng)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組、低劑量組、高劑量組大鼠腦組織SOD、GSH-Px水平低于假手術(shù)組，MDA水平高于假手術(shù)組，且模型組、低劑量組、高劑量組腦組織SOD、GSH-Px水平呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，MDA水平呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，經(jīng)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠造模72 h后腦組織細(xì)胞因子水平比較

2.3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評分比較 見表3。實(shí)驗(yàn)24、48、72 h后，低劑量組、高劑量組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分均低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且高劑量組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分明顯低于低劑量組(P<0.05)。

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評分比較(分)

2.4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)缺血皮層內(nèi)HSP70 mRNA表達(dá)比較 見表4(圖1)。實(shí)驗(yàn)24、48、72 h后， 模型組、低劑量組、高劑量組大鼠缺血皮層內(nèi)HSP70 mRNA陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);且模型組、低劑量組、高劑量組三組大鼠缺血皮層內(nèi)HSP70 mRNA陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，經(jīng)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)缺血皮層內(nèi)HSP70 mRNA陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(個(gè))

A：模型組；B：低劑量組；C：高劑量組；D：假手術(shù)組

2.5 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)缺血皮層內(nèi)HSP70蛋白表達(dá)比較 見表5(圖2)。實(shí)驗(yàn)24、48、72 h后， 模型組、低劑量組、高劑量組大鼠腦組織缺血皮層內(nèi)HSP70蛋白表達(dá)OD值均明顯高于假手術(shù)組，經(jīng)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且模型組、低劑量組、高劑量組大鼠缺血皮層內(nèi)HSP70蛋白表達(dá)OD值呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表5 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)缺血皮層內(nèi)HSP70蛋白表達(dá)OD值比較

A：模型組；B：低劑量組；C：高劑量組；D：假手術(shù)組

3 討 論

根據(jù)缺血性腦梗死再灌注損傷患者的臨床癥狀，本病應(yīng)歸為中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)病”的診療范疇，中醫(yī)學(xué)對本病最早的闡述可追溯至《黃帝內(nèi)經(jīng)》，而《諸病源候論》則將本病的病因病機(jī)總結(jié)為“中風(fēng)者，風(fēng)氣中于人也”，認(rèn)為本病的發(fā)生與外邪侵襲相關(guān)，而隨著對本病認(rèn)識的深入，后世醫(yī)家提出了“五志過極、蒙蔽心神”“痰濕內(nèi)生，痰瘀阻絡(luò)”“元?dú)馓澨?、腦竅失養(yǎng)”等多種學(xué)說，并進(jìn)行辨證應(yīng)用中醫(yī)藥療法進(jìn)行治療，均取得了良好的治療效果[15]。自由基學(xué)說是腦缺血再灌注損傷的機(jī)制之一，其認(rèn)為在腦部缺血以后，大腦通過一氧化氮合成酶途徑、超氧化酶和白細(xì)胞及血小板表面NADPH氧化酶途徑、花生四烯酸途徑、黃嘌呤氧化酶途徑合成大量自由基，從而損傷腦細(xì)胞，造成再灌注損傷[16]。

研究顯示[17]，人體內(nèi)細(xì)胞可以通過非酶系統(tǒng)以及酶系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)自我抗氧化的效果。GSH-Px和SOD是人體抗氧化酶系統(tǒng)中的重要物質(zhì)，其中GSH-Px是特異性過氧化氫分解催化酶，可促進(jìn)還原型谷胱甘肽轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽，致使自由基向無毒的羥基轉(zhuǎn)化，從而達(dá)到抑制氧化物損傷的效果，保護(hù)細(xì)胞。SOD是抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，可清除體內(nèi)的超氧陰離子自由基，促使其發(fā)生歧化作用，進(jìn)而對自由基損傷產(chǎn)生抑制效果，為監(jiān)測自由基清除能力的重要指標(biāo)[18]。MDA則為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物，其不僅可與脂質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，同時(shí)也可促使脂質(zhì)向高分子聚合物轉(zhuǎn)化，并在細(xì)胞內(nèi)沉積和溶酶消解，當(dāng)上述高分子聚合物濃度較高時(shí)，就會(huì)對細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[19]。本研究各組腦組織SOD、GSH-Px及MDA水平結(jié)果提示，經(jīng)丹參酚酸A干預(yù)后，不僅大鼠體內(nèi)的氧自由基可得到有效地清除，同時(shí)缺血再灌注性細(xì)胞損傷也可得到明顯控制。有研究顯示[20]，給予大鼠1個(gè)月的丹參酚酸鹽喂養(yǎng)以后，其腎臟組織的SOD活性顯著升高，自由基含量降低，腎功能得到顯著改善。Wang等[21]研究顯示，丹參酚酸鹽可以對羥自由基進(jìn)行有效清除。Sun 等[22]研究顯示，丹參酚酸鹽可以對黃嘌呤氧化酶/黃嘌呤系統(tǒng)產(chǎn)生的鐵離子依賴羥自由基和氧自由基進(jìn)行有效清除。機(jī)體內(nèi)自由基被有效清除后，GSH-Px和SOD的消耗量大大降低，其活性相應(yīng)增加，腦組織抗自由基損傷能力增加。

本研究所用的丹參酸酚A提取自中藥丹參，丹參具有“活血通絡(luò)，通經(jīng)止痛”的功效，常與桃仁、紅花、三七、川芎等藥配伍，可用于冠心病、腦梗死、關(guān)節(jié)腫痛、月經(jīng)不調(diào)等疾病的治療，具有良好的應(yīng)用效果[23]。丹參多酚酸為丹參主要有效成分，屬水溶性的有機(jī)酸類化合物，具有降低腦梗死水腫面積的作用，可有效對腦組織神經(jīng)功能進(jìn)行保護(hù)[24]。本研究結(jié)果顯示，高劑量組大鼠腦組織BDNF、GDNF水平明顯較高。這是由于BDNF、GDNF是重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在神經(jīng)元的生長和分化中具有重要的作用。而神經(jīng)元抗缺血損傷的能力與腦組織中的BDNF、GDNF變化關(guān)系較為密切，而給予大鼠外源性的BDNF、GDNF同樣可以發(fā)揮保護(hù)缺血性腦組織的功效。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示[25]，BDNF、GDNF具有減少腦缺血后梗死面積的功效，有助于修復(fù)大鼠受損的神經(jīng)元。上述結(jié)果也證實(shí)了高水平表達(dá)的BDNF、GDNF可以減少神經(jīng)元的凋亡，減輕缺血性腦組織損傷，也是自身的一種保護(hù)機(jī)制。這種機(jī)制可能與下述因素關(guān)系密切：①鈣超載的降低，促進(jìn)神經(jīng)元突觸的生長和發(fā)芽；②對興奮性氨基酸毒性作用的拮抗效果；③對自由基的清除作用，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制。正常情況下，腦組織內(nèi)的HSP含量相對較低。當(dāng)出現(xiàn)腦部缺血時(shí)，HSP-70會(huì)在變性蛋白的誘導(dǎo)下增加合成量，進(jìn)而增強(qiáng)腦細(xì)胞對缺氧、缺血的耐受性。有研究顯示[26]，HSP-70不僅可在大腦缺血早期保護(hù)腦組織細(xì)胞免受損傷，在缺血后期對細(xì)胞修復(fù)的作用也較為顯著。本文免疫組化和原位雜交結(jié)果顯示，高劑量的丹參酚酸A可以促進(jìn)HSP-70蛋白的表達(dá)。這可能與丹參酚酸A消除自由基的特性有關(guān)，可以較好地減少神經(jīng)細(xì)胞損傷，減輕能量消耗，促進(jìn)HSP-70蛋白基因的表達(dá)。

綜上所述，丹參酚酸A可以有效地對腦缺血再灌注損傷大鼠的自由基進(jìn)行清除，減少梗死面積，增加HSP70蛋白基因的表達(dá)，具有缺血腦保護(hù)作用。