蘭雅文，唐 明，王佳寧，修小惠，趙素君，翟容乾，安朋朋

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；2.青島市中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島 266033；3.萊陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院，山東 萊陽(yáng) 265200；4.青島市第六人民醫(yī)院，山東 青島 266700)

腦梗死是缺血性腦血管疾病，在中醫(yī)學(xué)屬于“中風(fēng)”范疇，火毒內(nèi)盛是其重要的病理基礎(chǔ)，火熱之毒損傷腦絡(luò)，腦脈瘀阻，發(fā)為中風(fēng)。腦梗死約占腦卒中的70%，病死率約10%，致殘率可達(dá)50%以上，給患者的工作和生活帶來(lái)極大的痛苦和負(fù)擔(dān)[1]。腦梗死急性期易并發(fā)嚴(yán)重腦水腫、顱內(nèi)壓增高、腦疝、肺栓塞、梗死再發(fā)或繼發(fā)出血等，均可明顯增加不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死急性期還可并發(fā)胃損傷，臨床多表現(xiàn)為胃脘脹滿(mǎn)、疼痛、噯氣、惡心、嘔吐等，甚則出現(xiàn)嘔血、便血，可明顯延長(zhǎng)病程，降低預(yù)后[2-3]。

Cajal間質(zhì)細(xì)胞作為胃部神經(jīng)系統(tǒng)和平滑肌細(xì)胞之間的一類(lèi)間質(zhì)細(xì)胞，在維持胃部正常收縮功能的中發(fā)揮重要作用，酪氨酸激酶受體(C-kit)作為Cajal間質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，與其天然配體干細(xì)胞因子(SCF)特異性結(jié)合，可以激活SCF/C-kit信號(hào)通路，該信號(hào)通路與Cajal間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育密切相關(guān)，可影響胃部正常收縮功能。本課題組前期研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，腦梗死急性期大鼠可并發(fā)胃黏膜損傷，黃連解毒湯可通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠胃動(dòng)素及血管活性腸肽的表達(dá)，發(fā)揮胃黏膜保護(hù)作用。基于本病火毒內(nèi)盛的病理基礎(chǔ)，以清熱解毒為基本治療原則，使熱毒解，腦絡(luò)通，諸證可愈，方選清熱解毒之代表方黃連解毒湯。本實(shí)驗(yàn)從SCF/C-kit信號(hào)通路入手，探討黃連解毒湯對(duì)腦梗死急性期胃損傷的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康SPF級(jí)10周齡雄性Wistar大鼠80只由山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：0009265，體重(200±20)g。大鼠飼養(yǎng)于青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，恒溫22 ℃，濕度(50±5)%，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，交替給予12 h光照與12 h黑暗，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：黃連解毒湯由黃連、梔子各9 g，黃芩、黃柏各6 g組成。采用華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司廠家同批次中藥免煎顆粒劑，0.5 g顆粒劑相當(dāng)于6 g生藥。艾司奧美拉唑鎂腸溶片(國(guó)藥準(zhǔn)字H20046380，規(guī)格：40 mg/片)。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：二甲苯、無(wú)水乙醇(中國(guó)國(guó)藥公司，批號(hào)X112051、10009218)；蘇木精(中國(guó)Solarbio公司，批號(hào)H8070)；曙紅Y、醇溶(中國(guó)Sangon公司，批號(hào)A600190)；BX53顯微鏡、DP73顯微鏡拍照系統(tǒng)(日本Olumpus公司)；RM2235石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；NW10LVF超純水系統(tǒng)(香港Heal Force公司)；DH36001B電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津斯泰特公司)；H-2050R超速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀公司)；RLX-800酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotex公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制備：將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、黃連解毒湯組、奧美拉唑組、正常組、假手術(shù)組，以上各組根據(jù)給藥時(shí)間再分設(shè)4 d組、7 d組，共10組，每組8只。除正常組和假手術(shù)組外，其余各組均采用線栓法建立大腦中動(dòng)脈梗死模型(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)，假手術(shù)組僅分離大鼠頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)、外動(dòng)脈。正常組不作任何處理。

1.2.2 藥物制備及給藥方法：按人與動(dòng)物等效劑量換算公式[6]，計(jì)算大鼠每日給藥劑量，黃連解毒湯免煎顆粒劑54 mg/d，艾司奧美拉唑27 mg/d。以上藥物加蒸餾水配制藥物濃度分別為黃連解毒湯27 mg/ml、奧美拉唑15 mg/ml的懸濁液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩４笫笤炷３晒蠹撮_(kāi)始給藥，黃連解毒湯組給予大鼠1 ml黃連解毒湯懸濁液(27 mg/ml)灌胃，2次/d；奧美拉唑組給予大鼠1 ml奧美拉唑懸濁液(15 mg/ml)灌胃，3次/d；其余組給予每只大鼠1 ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃，2次/d；連續(xù)給藥7 d。

1.2.3 標(biāo)本制備與采集：4 d組連續(xù)給藥4 d，7 d組連續(xù)給藥7 d，采取脫頸法處死大鼠，清除胃內(nèi)容物，取2～3 cm大鼠胃組織，縱行剖開(kāi)清洗后，4%多聚甲醛溶液固定，以備用于后續(xù)鏡下觀察胃黏膜病理變化、測(cè)定胃組織中SCF、C-kit mRNA及蛋白的表達(dá)。

1.2.4 HE染色觀察大鼠胃組織：將大鼠胃組織從4%多聚甲醛液內(nèi)取出，石蠟包埋切片，脫蠟至水，HE染色，觀察大鼠胃組織的結(jié)構(gòu)和形態(tài)特征，光鏡下觀察胃黏膜損傷病理變化，同時(shí)予病理評(píng)分。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)大鼠胃組織SCF、C-kit mRNA表達(dá)水平：取出大鼠胃組織，加入1 ml TRIpure 裂解液并室溫靜置5 min，加入200 μl氯仿，室溫靜置3 min，離心后將水相置于新的離心管，加入異丙醇于-20 ℃過(guò)夜，離心后棄上清液，加入75%乙醇1 ml，離心后棄上清液，加入30 μl RNase-free ddH2O室溫靜置2 min，提取總RNA。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各樣本中RNA的濃度。將所得RNA樣本于PCR儀反轉(zhuǎn)錄得到對(duì)應(yīng)的cDNA。熒光定量分析使用熒光定量?jī)x進(jìn)行，采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。引物序列見(jiàn)表1。

表1 SCF、C-kit引物序列

1.2.6 Western blot檢測(cè)大鼠胃組織SCF、C-kit蛋白表達(dá)水平：取大鼠胃組織，加入相應(yīng)體積裂解液以提取總蛋白，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，制備蛋白上樣液，行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉2 h，加入TRPV1一抗(1∶500)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日洗膜，再加入山羊抗兔的二抗(1∶2000)，于室溫孵育2 h。再次洗膜，光化學(xué)發(fā)光，顯影。使用Quantity One分析軟件進(jìn)行灰度分析，蛋白相對(duì)含量以目的蛋白與內(nèi)參灰度比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，正態(tài)分布且方差齊時(shí)，采用單因素方差分析比較多組間差異，采用LSD-t檢驗(yàn)比較兩組間差異，非正態(tài)分布或方差不齊時(shí)，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠胃黏膜組織病理形態(tài)觀察及評(píng)分比較 見(jiàn)圖1、2。正常組和假手術(shù)組胃組織無(wú)明顯充血、水腫等病變，黏膜各層結(jié)構(gòu)完整，腺管排列整體，形狀規(guī)則，正常組各層未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，假手術(shù)組黏膜層偶可見(jiàn)少量單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠胃黏膜損傷較嚴(yán)重，黏膜充血，上皮細(xì)胞明顯水腫，黏膜層可見(jiàn)大量單核細(xì)胞、中性多核粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞大面積壞死脫落，黏膜層不連續(xù)，呈火山口樣表現(xiàn)，組織間隙增大，腺管疏密不均；與模型組比較，奧美拉唑組及黃連解毒湯組胃黏膜上述情況較輕，黏膜層炎性細(xì)胞數(shù)目較少，充血、水腫不明顯，黏膜層及黏膜上皮見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺管排列較整齊，部分上皮脫落，未見(jiàn)黏膜糜爛。

圖1 各組大鼠給藥4 d胃黏膜組織病理改變(HE染色，×400)

圖2 各組大鼠給藥7 d胃黏膜組織病理改變(HE染色，×400)

與正常組、假手術(shù)組比較，模型組、黃連解毒湯組、奧美拉唑組胃黏膜病理評(píng)分均明顯升高(4、7 d組均P<0.01)；正常組、假手術(shù)組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4、7 d組均P>0.05)。與模型組比較，黃連解毒湯組、奧美拉唑組胃黏膜病理評(píng)分均顯著降低(4、7 d組均P<0.01)；與奧美拉唑組比較，黃連解毒湯組胃黏膜病理評(píng)分均明顯降低(4、7 d組均P<0.05)，黃連解毒湯7 d組與4 d組比較，胃黏膜病理評(píng)分明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠給藥4、7 d胃黏膜損傷病理評(píng)分比較(分)

2.2 各組大鼠胃組織SCF、C-kit mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)表3。與正常組、假手術(shù)組比較，模型組、黃連解毒湯組、奧美拉唑組大鼠胃組織SCF、C-kit mRNA表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01)；正常組、假手術(shù)組SCF、C-kit mRNA表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，黃連解毒湯組、奧美拉唑組大鼠胃組織SCF、C-kit mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)。與奧美拉唑組比較，黃連解毒湯組胃組織SCF、C-kit mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)。

表3 各組大鼠胃組織SCF、C-kit mRNA表達(dá)比較

2.3 各組大鼠胃組織SCF、C-kit蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)表4(圖3)。與正常組、假手術(shù)組比較，模型組、黃連解毒湯組、奧美拉唑組大鼠胃組織SCF、C-kit蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01)；正常組、假手術(shù)組SCF、C-kit蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，黃連解毒湯組、奧美拉唑組大鼠胃組織SCF、C-kit蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)。與奧美拉唑組比較，黃連解毒湯組胃組織SCF、C-kit蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)。

表4 各組大鼠胃組織SCF、C-kit蛋白表達(dá)比較

A：正常組；B：模型組；C：假手術(shù)組；

3 討 論

腦梗死在中醫(yī)學(xué)屬于“中風(fēng)”范疇，火熱之毒內(nèi)盛乃中風(fēng)重要的病理基礎(chǔ)[7]，基本病機(jī)為君相火旺，風(fēng)火相煽，內(nèi)風(fēng)旋動(dòng)，氣血逆亂于上，直沖犯腦，火熱之毒損傷腦絡(luò)，導(dǎo)致腦脈瘀阻，發(fā)為中風(fēng)[8-9]。中風(fēng)發(fā)病之氣血逆亂，可進(jìn)一步損傷臟腑氣機(jī)，其中又以胃腑氣機(jī)失常最為多見(jiàn)。胃腑通降失常，熱邪、糟粕不得瀉下，腑氣不通，不利于平復(fù)氣血之逆亂，進(jìn)而清陽(yáng)不升，濁陰不降，加重腦竅之損傷[10]。故臨床以清熱解毒為基本治療原則，熱毒解，腦絡(luò)通，疾病向愈。黃連解毒湯乃清熱解毒之代表方，主治三焦火毒熱盛證[11]。方中君以黃連，臣以黃芩，佐以黃柏，三黃合用，功專(zhuān)清熱燥濕，瀉火解毒，分泄上、中、下三焦火熱之毒，另佐以梔子，清泄三焦之火毒，兼引熱邪從小便而出。此四藥合用，苦寒直折，清泄三焦上下，使火邪去，熱毒解，諸癥可愈?，F(xiàn)代藥理及實(shí)驗(yàn)研究表明，黃連解毒湯對(duì)腦梗死以及胃損傷均有較好的療效。姜海偉[12]研究發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯可改善缺血性卒中后認(rèn)知障礙患者的認(rèn)知功能，并且可以通過(guò)抑制激活Notch信號(hào)通路、調(diào)節(jié)炎癥因子以及改善腦梗死局部微循環(huán)來(lái)改善腦梗死模型大鼠的認(rèn)知功能行為學(xué)損害。馬重陽(yáng)等[13]研究發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)以晚期糖基化終產(chǎn)物受體為中心的信號(hào)通路，發(fā)揮抗缺血性腦卒中療效。劉天峰[14]研究發(fā)現(xiàn)，加味黃連解毒湯可明顯改善熱毒蘊(yùn)結(jié)型胃潰瘍患者臨床癥狀，同時(shí)可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡平衡，改善熱毒蘊(yùn)結(jié)型胃潰瘍模型大鼠胃黏膜損傷程度。黃婉霞[15]研究發(fā)現(xiàn)，加味黃連解毒湯可改善幽門(mén)螺桿菌陽(yáng)性患者的胃潰瘍癥狀，改善患者心理狀態(tài)，提高治療有效率。

正常情況下，胃部肌層組織受中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胃部神經(jīng)系統(tǒng)及胃腸激素的共同調(diào)控。腦梗死發(fā)病后機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)失調(diào)，胃黏膜缺血缺氧，胃黏膜屏障受損，造成胃損傷。目前，腦梗死急性期并發(fā)胃損傷的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。近年來(lái)，作為維持胃部正常收縮功能的Cajal間質(zhì)細(xì)胞在胃損傷機(jī)制研究中越來(lái)越受關(guān)注[16-17]。Cajal間質(zhì)細(xì)胞是介于胃部神經(jīng)系統(tǒng)和平滑肌細(xì)胞的一類(lèi)間質(zhì)細(xì)胞，能夠產(chǎn)生起搏電位，控制基本電節(jié)律的傳播，同時(shí)Cajal間質(zhì)細(xì)胞還可加強(qiáng)胃部神經(jīng)元與平滑肌細(xì)胞的聯(lián)系，通過(guò)接受神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)胃部慢波頻率，從而控制平滑肌的收縮[18]。C-kit作為Cajal間質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，與其天然配體SCF特異性結(jié)合可以激活SCF/C-kit信號(hào)通路，該通路與Cajal間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育密切相關(guān)，當(dāng)SCF、C-kit發(fā)生突變或信號(hào)通路受損，可影響Cajal間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育、分化，影響胃部正常收縮功能[19-20]。因此，SCF/C-kit信號(hào)通路的表達(dá)有可能成為探索腦梗死急性期胃損傷發(fā)病機(jī)制的突破點(diǎn)。

本研究顯示，模型組大鼠胃黏膜病理評(píng)分較正常組、假手術(shù)組均明顯升高，提示腦梗死急性期易并發(fā)胃黏膜損傷。黃連解毒湯組大鼠胃黏膜病理評(píng)分較模型組及奧美拉唑組均明顯降低，提示黃連解毒湯對(duì)腦梗死急性期胃黏膜有良好的保護(hù)作用，且7 d組效果最佳，可能與黃連解毒湯應(yīng)用療程有關(guān)。與正常組、假手術(shù)組比較，模型組SCF和C-kit mRNA、蛋白表達(dá)水平明顯降低，與胃黏膜損傷病理評(píng)分結(jié)果一致，說(shuō)明腦梗死急性期并發(fā)胃損傷機(jī)制可能與大鼠胃組織SCF、C-kit mRNA及蛋白表達(dá)水平降低有關(guān)。與模型組、奧美拉唑組比較，黃連解毒湯組SCF、C-kit mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高，提示黃連解毒湯可能通過(guò)升高大鼠胃組織SCF、C-kit mRNA及蛋白表達(dá)水平對(duì)胃黏膜產(chǎn)生保護(hù)性作用，緩解腦梗死急性期的胃黏膜損傷，且黃連解毒湯組療效顯著優(yōu)于奧美拉唑組。

綜上所述，腦梗死急性期并發(fā)胃損傷機(jī)制可能與SCF/C-kit信號(hào)通路有關(guān)，黃連解毒湯可能通過(guò)上調(diào)SCF、C-kit mRNA及蛋白表達(dá)水平，起到胃黏膜保護(hù)作用。本研究側(cè)重于胃組織的病理學(xué)改變，尚缺乏對(duì)胃動(dòng)力的動(dòng)態(tài)觀察，同時(shí)缺少胃酸pH值的測(cè)定，難以確定SCF/C-kit信號(hào)通路是否與胃內(nèi)pH值變化有關(guān)，下一步將完善SCF/C-kit信號(hào)通路與胃動(dòng)力以及胃液pH值的相關(guān)性探討，進(jìn)一步明確SCF/C-kit信號(hào)通路的影響因素。