張英 劉宇 晁利娜

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院產(chǎn)科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

子宮內(nèi)膜癌是婦科疾病中常見惡性腫瘤之一，其主要是一種發(fā)生于子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤，關(guān)于其發(fā)病機(jī)制尚未闡明，絕大部分子宮內(nèi)膜癌患者有較差且死亡率較高〔1〕。越來越多的實(shí)驗(yàn)表明，異常表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼(Lnc)RNA可以作為癌癥診斷的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)， 此外，部分LncRNA已被證實(shí)可參與調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、分化、遷移等生物學(xué)過程〔2，3〕。研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOXC13-AS(LncRNA HOXC13-AS)在肝癌組織中上調(diào)表達(dá)，并可參與肝癌發(fā)生發(fā)展過程〔4〕。HOXC13-AS在乳腺癌組織中高表達(dá)，上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中的HOXC13-AS含量可加速癌細(xì)胞的增殖〔5〕。然而，關(guān)于子宮內(nèi)膜癌中HOXC13-AS的表達(dá)功能和機(jī)制尚未可知。通過starBase預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)微小RNA-634(miR-634)含有HOXC13-AS的互補(bǔ)序列。miR-634在胰腺癌中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-634抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，及誘導(dǎo)凋亡〔6〕。此外，miR-634在宮頸癌細(xì)胞中過表達(dá)可破壞癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移〔7〕。但是，HOXC13-AS是否通過調(diào)節(jié)miR-634在子宮內(nèi)膜癌發(fā)揮作用尚未完全闡明。因此，本實(shí)驗(yàn)探討HOXC13-AS與miR-634在子宮內(nèi)膜癌中的具體作用及其機(jī)制，進(jìn)一步探究HOXC13-AS與miR-634之間的調(diào)控關(guān)系及其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)提供子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa；美國(guó)Gibco公司提供杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胰蛋白酶、胎牛血清；美國(guó)Thermo Fisher公司提供Lipofectamine2000；廣州銳博生物科技提供亂序無(wú)意義陰性對(duì)照序列(si-NC)、HOXC13-AS小干擾RNA(si-HOXC13-AS)、陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-634 模擬物；上海吉瑪制提供miR-634特異性寡核苷酸抑制劑 (anti-miR-634)及其陰性對(duì)照；pcDNA3.1購(gòu)自上海索寶生物；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自上海澤葉生物；美國(guó)BD公司提供膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)試劑、Matrigel基質(zhì)膠；美國(guó)Corning公司提供Transwell小室；雙熒光素酶報(bào)告載體及檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；山羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，一抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。組織標(biāo)本：收集20對(duì)于2017年3月至2018年5月新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜癌患者的癌組織及癌旁組織，年齡46～60歲，并置于-80 ℃保存?；颊呔?jīng)病理確診。本研究已經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Ishikawa細(xì)胞參照Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為si-NC組(si-NC轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞)、si-HOXC13-AS組(si-HOXC13-AS轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞)、miR-NC組(miR-NC轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞)、miR-634組(miR-634 mimics轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞)、si-HOXC13-AS+anti-miR-NC組(si-HOXC13-AS與anti-miR-NC共轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞)、si-HOXC13-AS+anti-miR-634組(si-HOXC13-AS與anti-miR-634共轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞)。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 采用Trizol法提取組織及細(xì)胞總RNAs，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNAs， 隨后最后采用qRT-PCR檢測(cè) HOXC13-AS(內(nèi)參GAPDH)和miR-634(內(nèi)參U6)的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3MTT 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Ishikawa細(xì)胞接種到96孔板中。 將細(xì)胞在 37℃培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入20 μl MTT溶液孵育4 h。棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)室溫孵育1 h ，然后在490 nm下測(cè)量每個(gè)孔中的吸光度值。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù) 將各組Ishikawa細(xì)胞重懸于500 μl 1×結(jié)合緩沖液中，隨后與5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI室溫避光孵育10 min， 最后通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)樣品凋亡進(jìn)行分析。

1.2.5Transwell 將各組對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Ishikawa細(xì)胞重懸于不含血清的DMEM培養(yǎng)液中制備成單細(xì)胞懸液。取200 μl細(xì)胞懸液置于Transwell 室上室中〔Matrigel基質(zhì)膠涂層(40 μl/孔)用于侵襲檢測(cè)和未涂層用于遷移檢測(cè)〕， 隨后將600 μl含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基添加到下室中。 培養(yǎng)24 h后，PBS洗滌，通過膜的細(xì)胞用0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，然后顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) starBase預(yù)測(cè)顯示HOXC13-AS的序列中含有與miR-634互補(bǔ)的核苷酸序列。將含有miR-634結(jié)合位點(diǎn)或位點(diǎn)突變序列的HOXC13-AS片段克隆到熒光素酶載體中構(gòu)建野生型(WT)或突變型(MUT)熒光素酶報(bào)告載體(WT/MUT-HOXC13-AS)。隨后分別將上述重組質(zhì)粒與miR-NC、miR-634 mimics共轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞，24 h后檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.7Western印跡檢測(cè) 采用蛋白裂解液(1 ml RIPA、1% PMSF、0.1% 抑肽酶)提取細(xì)胞總蛋白。BCA法檢測(cè)蛋白濃度后，30 μg蛋白通過10%十二烷基硫酸鈉聚乙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h后，該膜在4℃條件下與一抗(1∶1 000)孵育12 h，隨后在室溫條件下與二抗(1∶5 000)孵育1 h。采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒檢測(cè)蛋白信號(hào)，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA HOXC13-AS和miR-634在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá) HOXC13-AS在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05)，而miR-634的表達(dá)顯著低于癌旁組織(P<0.05)，見表1。

表1 LncRNA HOXC13-AS和miR-634在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)

2.2抑制HOXC13-AS表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖、凋亡的影響 相對(duì)于si-NC組，si-HOXC13-AS組HOXC13-AS表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。敲低HOXC13-AS降低Ishikawa細(xì)胞活力和促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P<0.05)，此外，下調(diào)Ishikawa細(xì)胞中HOXC13-AS表達(dá)抑制細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1和B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2的蛋白表達(dá)并促進(jìn)p21和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的蛋白含量 (P<0.05)，見表2、圖1。

表2 抑制HOXC13-AS表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖、凋亡的影響

2.3抑制HOXC13-AS表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與si-NC組比較，si-HOXC13-AS組Ishikawa細(xì)胞遷移與侵襲能力降低并伴隨著基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9表達(dá)含量的下降(P<0.05)，見圖2、表3。

2.4miR-634過表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 相較于miR-NC轉(zhuǎn)染，miR-634 mimic轉(zhuǎn)染顯著升高Ishikawa細(xì)胞中miR-634的含量(P<0.05)；功能實(shí)驗(yàn)表達(dá)，miR-634過表達(dá)抑制細(xì)胞活力，遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡 (P<0.05)；此外，miR-634 mimic轉(zhuǎn)染升高p21和Bax蛋白表達(dá)，降低CyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)(P<0.05)，見表4、圖3、表5、圖4。

圖1 抑制HOXC13-AS表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖、凋亡的影響

圖2 遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)及抑制HOXC13-AS表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

表3 抑制HOXC13-AS表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞遷移、侵襲的影響

2.5LncRNA HOXC13-AS靶向調(diào)控miR-634的表達(dá) HOXC13-AS與 miR-634互補(bǔ)序列見圖5。與miR-NC、WT-HOXC13-AS共轉(zhuǎn)染組比較，miR-634 mimics、WT-HOXC13-AS共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；miR-NC、MUT-HOXC13-AS共轉(zhuǎn)染組與miR-634 mimics、MUT-HOXC13-AS共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，HOXC13-AS過表達(dá)抑制細(xì)胞中miR-634的表達(dá)含量，而HOXC13-AS下調(diào)促進(jìn)細(xì)胞中miR-634的表達(dá)(P<0.05)，見表6。

表4 miR-634過表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

圖3 細(xì)胞凋亡流式圖及miR-634過表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡、遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

表5 miR-634過表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖4 兩組蛋白電泳

2.6干擾miR-634表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制HOXC13-AS對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的作用 HOXC13-AS沉默上調(diào)了miR-634表達(dá)，但是miR-634低表達(dá)減弱了此影響。同樣地，miR-634低表達(dá)抑制了si-HOXC13-AS對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用和對(duì)凋亡的促進(jìn)作用。HOXC13-AS沉默在Ishikawa細(xì)胞中抑制了CyclinD1,Bcl-2,MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)但促進(jìn)了p21和Bax的蛋白表達(dá)；然而，si-HOXC13-AS和anti-miR-634的共轉(zhuǎn)染減弱了HOXC13-AS沉默引起的這些效應(yīng)。見表6、表7、圖6和圖7。

圖5 HOXC13-AS與miR-634的互補(bǔ)序列互補(bǔ)的核苷酸序列

表6 干擾miR-634表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制HOXC13-AS對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的作用

表7 干擾miR-634表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制HOXC13-AS對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

圖6 細(xì)胞凋亡流式圖、干擾miR-634表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制HOXC13-AS對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡、遷移、侵襲的作用(結(jié)晶紫染色，×200)

1～4：si-NC、si-HOXC13-AS、si-HOXC13-AS+anti-miR-NC、si-HOXC13-AS+anti-miR-634圖7 4組蛋白電泳

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌早期癥狀隱匿導(dǎo)致早期診斷效率降低，患者術(shù)后易復(fù)發(fā)且化療敏感性降低導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌患者死亡率逐年升高〔8〕。因而基于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生物學(xué)特性尋找新的治療靶點(diǎn)有助于提高子宮內(nèi)膜癌診斷及治療水平。有研究表明LncRNA在子宮內(nèi)膜膜中發(fā)揮重要調(diào)控作用， LncRNA可通過充當(dāng)miRNA競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA在子宮內(nèi)膜癌的病理進(jìn)展中發(fā)揮作用〔9，10〕。因而深入探究LncRNA-miRNA調(diào)控機(jī)制可為子宮內(nèi)膜癌早期診斷及預(yù)后判斷提供新的生物標(biāo)志物，并可為子宮內(nèi)膜癌治療提供新的潛在靶點(diǎn)。

HOXC13-AS可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的遷移及侵襲〔11〕。研究表明，HOXC13-AS通過調(diào)節(jié)miR-383-3p/HMGA2分子軸促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖及侵襲〔12〕。相關(guān)報(bào)道指出HOXC13-AS高表達(dá)與膽管癌患者預(yù)后不良有關(guān)〔13〕。但HOXC13-AS在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)尚未可知。本研究結(jié)果提示，HOXC13-AS的表達(dá)量升高可能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。抑制HOXC13-AS降低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞活力顯著降低，提示HOXC13-AS可能通過促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖而參與其發(fā)生過程。研究表明，CyclinD1在多種腫瘤中均呈高表達(dá)，并可通過正向調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，p21可抑制CyclinD1與細(xì)胞周期依賴蛋白激酶的結(jié)合從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)〔14〕。本研究發(fā)現(xiàn)，敲除HOXC13-AS可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中CyclinD1的表達(dá)但是升高p21的表達(dá)。Bcl-2蛋白家族可參與細(xì)胞凋亡過程，其中Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，Bax屬于促凋亡蛋白〔15〕。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，HOXC13-AS敲除后，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡率顯著升高，同時(shí)細(xì)胞中Bax的表達(dá)水平顯著升高而Bcl-2的表達(dá)水平明顯減低。MMP-2和MMP-9是一種含鋅的金屬蛋白酶，具有廣泛的底物特異性，可參與細(xì)胞外基質(zhì)降解從而促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移，已有研究發(fā)現(xiàn) MMP-2和MMP-9可參與子宮內(nèi)膜癌浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過程〔16〕。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)HOXC13-AS伴隨著細(xì)胞遷移侵襲的抑制及MMP-2和MMP-9表達(dá)水平的顯著下降。綜上，抑制HOXC13-AS可能通過下調(diào)相關(guān)蛋白的表達(dá)從而破壞子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

在舌鱗狀細(xì)胞癌中miR-634呈低表達(dá)，上調(diào)miR-634的表達(dá)可抑制circ_0001742的促癌作用〔17〕。研究表明，miR-634可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲〔18〕。LncRNA DANCR通過充當(dāng)miR-634的海綿分子從而促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生〔19〕。相關(guān)報(bào)道指出miR-634通過靶向抑制Rab1A和DHX33的表達(dá)抑制肝細(xì)胞癌的發(fā)展〔20〕。本研究提示，miR-634可能參與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展過程。隨后，本研究證明miR-634是HOXC13-AS的直接靶標(biāo)，HOXC13-AS負(fù)向調(diào)節(jié)miR-634在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)。 重要的是，通過一系列回復(fù)實(shí)驗(yàn)，證明抑制miR-634可以逆轉(zhuǎn)HOXC13-AS在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中促凋亡，抗遷移和抗侵襲的能力。

綜上，HOXC13-AS在子宮內(nèi)膜癌中呈高表達(dá)，miR-634在子宮內(nèi)膜癌中呈低表達(dá)，HOXC13-AS通過靶向抑制miR-634表達(dá)從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，抑制細(xì)胞凋亡，可為子宮內(nèi)膜癌診斷提供新的分子標(biāo)志物，并可為子宮內(nèi)膜癌的治療提供潛在靶點(diǎn)。