鄭傳癡 何國平 陳宗平

(遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 1藥劑科，貴州 遵義 563100；2腫瘤科；3遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科)

前列腺癌是男性致死性癌癥中第二大癌，我國前列腺癌的發(fā)病率逐年升高，前列腺癌后期往往發(fā)展為去勢抵抗型前列腺癌及全身多處轉(zhuǎn)移，使得治療困難〔1〕。試驗證明，中國傳統(tǒng)醫(yī)藥在前列腺癌中已顯現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，許多中藥提取物可以發(fā)揮抗前列腺癌的效果〔2〕。紫花地丁為堇菜科堇菜屬多年生草本植物，是中醫(yī)治療過程中應(yīng)用較為廣泛的一種中藥材，其含有多種化學(xué)成分，具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抑菌、抗病毒、抗腫瘤等〔3〕。研究報道紫花地丁全草水提物能夠降低乳腺癌細胞MCF-7和肝癌細胞HepG2的細胞活力，抑制癌細胞且能誘導(dǎo)癌細胞凋亡〔4〕。紫花地丁對U14荷瘤鼠腫瘤組織生長具有明顯的抑制作用〔5〕。然而紫花地丁對前列腺癌細胞凋亡、侵襲及遷移的影響及其機制尚不清楚。長鏈非編碼(lnc)RNA已被證明在包括前列腺癌在內(nèi)的各種類型的癌癥中異常表達，因此，lncRNA可作為前列腺癌的新型生物標志物和治療靶標〔6〕。同源盒D基因簇反義生長相關(guān)的長鏈非編碼RNA(HAGLR)也稱HOXD-AS1，研究報道HAGLR在前列腺癌組織中的表達水增高，與患者預(yù)后密切相關(guān)〔7〕。HOXD-AS1可促進前列腺癌的增殖，去勢抵抗和化學(xué)抵抗；敲低HOXD-AS1可以在體內(nèi)和體外抑制去勢抵抗性前列腺癌細胞的增殖和化學(xué)耐藥性〔8〕。HOXD-AS1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系中上調(diào)表達；敲低HOXD-AS1抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲〔9〕。本實驗旨在研究紫花地丁可能通過調(diào)控HAGLR對前列腺癌細胞凋亡、侵襲及遷移的影響。

1 材料與方法

1.1主要材料 細胞DU145購自上海冠導(dǎo)生物；DMEM培養(yǎng)基購自上海善然生物；MTT試劑盒、凋亡試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；紫花地丁購自中國藥品生物制品檢定所；Transwell、Matrigel購自美國BD公司；熒光定量PCR試劑盒購自武漢科昊佳生物；RIPA蛋白裂解液購自北京康佳宏原生物；N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)、裂解半胱天冬酶(Cleaved-caspase)3抗體購自英國biorbyt公司。

1.2細胞處理與分組 DU145細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。取對數(shù)期細胞，用紫花地丁20、40、80 μg/ml處理，為低、中、高劑量組，正常培養(yǎng)的細胞作對照組。將si-NC、si-HAGLR轉(zhuǎn)染DU145細胞，分別為si-NC組、si-HAGLR組。

1.3MTT檢測細胞活性 培養(yǎng)48 h各組細胞，按試劑盒操作，酶標儀490 nm處檢測吸光度(OD)值。

1.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 培養(yǎng)48 h各組細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗按試劑盒操作，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5Transwell檢測細胞遷移和侵襲 各組細胞制成細胞1×104個/ml細胞懸液，取100 μl接種上室，培養(yǎng)24 h，經(jīng)甲醛固定、結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照并計數(shù)。細胞侵襲實驗上室加入Matrigel，凝固后接種細胞，之后同細胞遷移操作。

1.6實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測HAGLR表達水平 各組細胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA行PCR擴增，相對表達量用2-ΔΔCt法計算。GAPDH為內(nèi)參，HAGLR上游引物：5′-GGGAACCTCCAGAGATGACA-3′，下游：5′-CGGCTGACATTAGCTTCCTC-3′。

1.7Western印跡法檢測N-cadherin、E-cadherin、Cleaved-caspase3蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，定量；進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉；加一抗4℃孵育過夜，加二抗室溫孵育2 h，暗室曝光、定影；Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行t檢驗，單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1紫花地丁對DU145細胞活性和凋亡的影響

中、高劑量組細胞OD值較對照組顯著低，凋亡率較對照組顯著高(P<0.05)；而低劑量組細胞OD值和凋亡率與對照組差異不顯著(P>0.05)，見圖1，表1。

圖1 紫花地丁促進DU145細胞凋亡

表1 紫花地丁抑制DU145細胞活性，誘導(dǎo)細胞凋亡及對DU145遷移侵襲的影響

2.2紫花地丁對DU145遷移侵襲的影響 中、高劑量組遷移、侵襲細胞數(shù)較對照組顯著低(P<0.05)；而低劑量組遷移、侵襲細胞數(shù)與對照組差異不顯著(P>0.05)，見表1。

2.3紫花地丁對DU145中HAGLR表達的影響 與對照組相比，中、高劑量組HAGLR表達水平顯著降低(P<0.05)；而低劑量組無明顯變化。見表1。

2.4干擾HAGLR對DU145細胞活性及凋亡的影響 與si-NC組相比，si-HAGLR組細胞OD值顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，見圖2，表2。

2.5干擾HAGLR對DU145遷移侵襲的影響 與si-NC組相比，si-HAGLR組遷移、侵襲細胞數(shù)顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.6紫花地丁處理及干擾HAGLR對DU145中蛋白表達的影響 與對照組相比，中、高劑量組N-cadherin表達水平顯著降低，E-cadherin、Cleaved-caspase3表達水平升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)；而低劑量組各蛋白表達水平無明顯變化(P>0.05)；與si-NC組相比，si-HAGLR組N-cadherin表達水平顯著降低，E-cadherin、Cleaved-caspase3表達水平升高(P<0.05)，圖3，表3。

圖2 干擾HAGLR可促進DU145細胞凋亡

表2 干擾HAGLR對DU145細胞活性、凋亡、遷移、侵襲的影響

1～6：對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、si-NC組、si-HAGLR組圖3 N-cadherin，E-cadherin和cleaved-caspase 3蛋白表達水平

表3 紫花地丁處理及干擾HAGLR對DU145蛋白表達的影響

3 討 論

研究顯示，中藥提取成分對前列腺癌細胞具有抗腫瘤作用，其治療前列腺癌具有巨大的潛力和發(fā)展空間〔10，11〕。研究報道紫花地丁提取物可以抑制高度轉(zhuǎn)移性人類肺癌細胞系A(chǔ)549細胞的侵襲〔12〕。紫花地丁改善了脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷〔13〕。本實驗表明中、高劑量紫花地丁可抑制前列腺癌細胞DU145增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡；而低劑量的紫花地丁對前列腺癌細胞無影響。

已有研究表明HAGLR與前列腺癌的增殖及預(yù)后相關(guān)〔7，8〕。且研究報道HOXD-AS1在甲狀腺乳頭狀癌組織和細胞系中過表達，其高表達與臨床晚期，腫瘤大小，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)；降低HOXD-AS1抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖，遷移和侵襲，并促進細胞周期停滯〔14〕。HOXD-AS1高表達促進卵巢癌細胞增殖，遷移和侵襲〔15〕。食管癌組織和細胞中HAGLR表達增加，下調(diào)HAGLR通過使miR-143-5p海綿化而抑制溶酶體相關(guān)膜糖蛋白(LAMP)3表達，從而抑制細胞增殖、侵襲、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和腫瘤生長〔16〕。沉默HOXD-AS1可抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細胞周期阻滯〔17〕。本實驗提示，干擾HAGLR表達可抑制前列腺癌細胞DU145增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。本實驗提示紫花地丁可能通過下調(diào)HAGLR抑制前列腺癌細胞增殖、侵襲及遷移，促進細胞凋亡。