李 黎 孫 川 劉 莉 鄧 潔 晏 菲 魏武杰

(湖北省第三人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，武漢，430000)

胃癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤，在我國(guó)各種惡性腫瘤中發(fā)病率居第2位，是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一[1-2]。一般情況下胃癌發(fā)生早期無明顯癥狀，易被忽略，因此胃癌早期診斷較為困難，給臨床治療帶來了極大困難[3]。臨床上胃癌治療多以化療或手術(shù)切除為主，化療不良反應(yīng)大，同時(shí)對(duì)患者的身心影響大，因此尋求更加安全有效的藥物，減少藥品不良反應(yīng)，是目前胃癌治療的一個(gè)難題。近年來研究結(jié)果表明，中藥活性成分毒性低，作用靶點(diǎn)多，對(duì)于惡性腫瘤的防治作用備受關(guān)注，顯示出了巨大的潛力。

魚藤素(Deguelin，De)是植物中常見的魚藤酮類化合物，藥理學(xué)研究顯示具有顯著的殺蟲、抑制生長(zhǎng)發(fā)育的作用[4-5]。研究表明，魚藤素對(duì)癌癥的抵抗作用顯著，尤其是抑制肺癌、舍鱗癌和肝癌等惡性腫瘤有明顯作用[6-8]。相關(guān)研究顯示，魚藤素可對(duì)蛋白激酶(AKT)進(jìn)行選擇性抑制，從而對(duì)癌細(xì)胞起到一定抑制作用。AKT信號(hào)通路的活化在胃癌、肝癌等多種惡性腫瘤發(fā)生過程中具有重要作用。Ho等[10]研究表明，在胃癌腫瘤中AKT基因過表達(dá)。但是，目前尚未有研究表明魚藤素可以抑制胃癌細(xì)胞基因從而導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。因此，本研究采用人體胃癌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探索魚藤素作用于胃癌細(xì)胞的機(jī)制，為防治胃癌提供嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 SGC-7901人類胃癌細(xì)胞，來自于中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，許可證：SYXK(京)2016-0001，干冰運(yùn)輸?shù)膬龃婕?xì)胞，液氮保存，長(zhǎng)期有效。

1.1.2 藥品 魚藤素，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：522-17-8，純度>95%。

1.1.3 試劑與儀器 AKT過表達(dá)質(zhì)粒載體(漢恒生物科技有限公司，批號(hào)：12390912)DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó)，批號(hào)：12491-015)、胎牛血清(Gibco公司，美國(guó)，批號(hào)：10099-14-FBS)、青-鏈霉素(Gibco公司，美國(guó)，批號(hào)：15070063)等，CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所，日本，批號(hào)：CK04)，叉頭框蛋白O1(Forkhead Box O1，F(xiàn)oxO1)、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)蛋白(Bcl-2-associated X Protein,Bax)mRNA、β-肌動(dòng)蛋白(actin)上下游引物和探針(InvitrogenTM公司，美國(guó)，批號(hào)：12010121)，熒光定量PCR試劑(DBI公司，批號(hào)：16051012)，F(xiàn)oxO1兔單克隆抗體(美國(guó)CST公司，美國(guó)，批號(hào)：2880)、β-actin(美國(guó)CST公司，美國(guó)，批號(hào)：4970)兔單克隆抗體(美國(guó)CST公司，美國(guó)，批號(hào)：14021202)、p-AKTThr308兔單克隆抗體(美國(guó)CST公司，美國(guó)，批號(hào)：13038)、辣根過氧化物酶-羊抗兔IgG二抗(美國(guó)CST公司，批號(hào)：7074)、Bcl-2兔單克隆抗體(美國(guó)CST公司，美國(guó)，批號(hào)：4223)等，BCA的蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó)，批號(hào)：23227)、RNA提取試劑(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó)，批號(hào)：23209)、超敏化學(xué)發(fā)光液(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó)，批號(hào)：34580ECL)、細(xì)胞蛋白提取試劑(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó)，批號(hào)：78501)，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠快速制備試劑盒(EpiZyme Scientific公司，美國(guó)，批號(hào)：18D250)，研究用水為超純凈水，其余實(shí)驗(yàn)試劑均符合實(shí)驗(yàn)室要求。

CO2培養(yǎng)箱(三洋公司，日本，型號(hào)：MCO-18AC)；酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司，美國(guó)，型號(hào)：Bio-rad xMark)、細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Bio-Rad公司，美國(guó)，型號(hào)：TC20)、實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)伯樂公司，美國(guó)，型號(hào)：CFX96)、蛋白轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)伯樂公司，美國(guó)，型號(hào)：全能型)，離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)：CTK120R)、分析天平(梅特勒-托利多公司，瑞士，型號(hào)：MS-TS)，化學(xué)成像分析系統(tǒng)(Syngene公司，英國(guó)，型號(hào)：GBOX)、倒置顯微鏡(Olympus Corporation，日本，型號(hào)：CKX31)、恒溫水浴鍋(武漢格萊莫檢測(cè)設(shè)備有限公司，型號(hào)：HH-S4)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SGC-7901人類胃癌細(xì)胞植入杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle Medium，DMEM)高糖培養(yǎng)基中，將溫度調(diào)至37 ℃，CO2濃度調(diào)至5%進(jìn)行培養(yǎng)，觀察胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)。本研究已獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核準(zhǔn)許(倫理審批號(hào)：HBSDSRMYY201208063326)。

DMEM高糖培養(yǎng)基的配置：10%胎牛血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL。

1.2.2 魚藤素溶液配置 將1 mL DMSO與39.4 mg魚藤素相溶取得濃度100 mmol/L的母液作為對(duì)照，儲(chǔ)存于-20 ℃的環(huán)境中。取一定量母液在培養(yǎng)基中稀釋至10 mmol/L的濃度作為工作液，再用微孔為0.22 μm的濾膜過濾。

1.2.3 分組與魚藤素給藥濃度篩選 選取處于生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入胰酶消化液可制得細(xì)胞懸液，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)其計(jì)數(shù)。在96孔板中將細(xì)胞懸液鋪勻，使其每孔體積為100 μL，數(shù)量達(dá)到5 000個(gè)，將孔板分為3組，分別為對(duì)照組、空白組、濃度不同藥物組，并在每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。3個(gè)對(duì)照組中分別加入含魚藤素(10、20、40、60、80、100 mol/L)的培養(yǎng)基，給藥后分別在24 h和48 h時(shí)向孔中添加10 μL CCK-8試劑，并繼續(xù)培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度測(cè)定后可算出細(xì)胞的成活度，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟。細(xì)胞成活率(%)=(A給藥-A空白)/(A對(duì)照-A空白)×100%。

He didn’t ask for a meal, but a drink of water. She could see he was hungry.Soon she brought him a large glass of milk, “How much do I 2)owe you?” he asked.

1.2.4 分組與給藥 1)選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞種植于100 mm培養(yǎng)皿中，并分成對(duì)照組、20 μmol/L魚藤素組和40 μmol/L魚藤素組，24 h后取細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，并反復(fù)多次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于100 mm培養(yǎng)皿中，設(shè)對(duì)照組、模型組(AKT過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染)及魚藤素給藥組(AKT過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后給予相應(yīng)濃度魚藤素干預(yù))，不同劑量的魚藤素給藥作用24 h后，收集細(xì)胞用于檢測(cè)分析，進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 魚藤素對(duì)SGC-7901細(xì)胞中AKT/FoxO1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 SGC-7901胃癌細(xì)胞按1.2.4的1)中的方法進(jìn)行分組給藥，采用蛋白提取試劑的方法在給藥結(jié)束后進(jìn)行蛋白提取，用BCA試劑盒對(duì)蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。先將蛋白樣品進(jìn)行電泳分離，再將其轉(zhuǎn)至厚度為0.45 μm的聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride，PVDF)膜上，將5%脫脂牛奶進(jìn)行1 h的密封，Bcl-2等一抗(1∶1 000)、FoxO1、p-AKTThr308在搖床溫度為4 ℃的情況下過夜，使用洗滌緩沖液(Tris Buffered Saline Tween,TBST)進(jìn)行3次清洗工作，每次工作10 min，使用G:BOX成像分析系統(tǒng)在顯色之后獲得條帶，將β-actin作為內(nèi)參。進(jìn)行灰度值分析時(shí)采用Image J圖像軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 魚藤素對(duì)AKT基因轉(zhuǎn)染SGC-7901胃癌細(xì)胞中AKT/FoxO1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 SGC-7901細(xì)胞按1.2.4的2)中方法進(jìn)行分組給藥，采用蛋白提取試劑的方法在給藥結(jié)束后進(jìn)行蛋白提取，并用BCA試劑盒對(duì)蛋白含量進(jìn)行測(cè)定按1.2.5中的方法檢測(cè)p-AKTThr308、FoxO1、Bcl-2等蛋白的表達(dá)。

1.2.7 魚藤素對(duì)FoxO1、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響 SGC-7901胃癌細(xì)胞按1.2.4的2)中方法進(jìn)行分組給藥，給藥結(jié)束后運(yùn)用RNA提取試劑盒提取GC-7901胃癌細(xì)胞中的RNA，取RNA2 μg和50 mmol/LOligo-dt1 μL混勻，于65 ℃水浴5 min后馬上放于冰上進(jìn)行降溫，并向其加入4 μL的5×RT緩沖液、1 μL的莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus，M-MLV)，將2 μL的10 mmol/L脫氧核苷三磷酸(Deoxyribonucleoside Triphosphate，dNTP)和焦碳酸二乙酯(Diethyl Pyrocarbonate,DEPC)水補(bǔ)足反應(yīng)體系后進(jìn)行混合、離心，離心半徑20 cm，轉(zhuǎn)速30 000 r/min，離心10 min。PCR儀上操作：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min；PCR條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，73 ℃延伸45 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，以β-actin為內(nèi)參，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，于1%瓊脂糖凝膠中電泳，并在此過程中使用凝膠成像分析儀進(jìn)行全程拍攝，提取所有GAPDH吸收度和待測(cè)基金的比值，得到引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 魚藤素濃度和作用時(shí)間對(duì)SGC-7901細(xì)胞成活率的影響 SGC-7901胃癌細(xì)胞成活率與魚藤素給藥濃度、作用時(shí)間成反比，即魚藤素用藥濃度越大、作用時(shí)間越長(zhǎng)，SGC-7901胃癌細(xì)胞成活率越低，其中40 μmol/L的魚藤素作用24 h和48 h后的SGC-7901胃癌細(xì)胞成活率分別為78.2%和64.6%，魚藤素具有誘導(dǎo)癌性細(xì)胞SGC-7901凋亡，抑制其增殖的作用。其中魚藤素用藥濃度為20 μmol/L和40 μmol/L，作用24 h為最佳給藥方案。見圖1。

圖1 魚藤素濃度和作用時(shí)間對(duì)SGC-7901細(xì)胞成活率的影響

圖2 魚藤素對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞中AKT/FoxO1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3 魚藤素對(duì)AKT基因轉(zhuǎn)染SGC-7901胃癌細(xì)胞中AKT/FoxO1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，在AKT基因轉(zhuǎn)染的模型組中SGC-7901胃癌細(xì)胞的Bcl-2和p-AKTThr308等蛋白表達(dá)水平有上升趨勢(shì)，而FoxO1的蛋白表達(dá)水平呈下降趨勢(shì),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。經(jīng)過20、40 μmol/L魚藤素給藥作用24 h后均能夠降低p-AKTThr308、Bcl-2等蛋白的表達(dá)水平，升高FoxO1蛋白的表達(dá)水平，與AKT基因轉(zhuǎn)染的模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見圖3。

圖3 魚藤素對(duì)AKT基因轉(zhuǎn)染SGC-7901胃癌細(xì)胞中AKT/FoxO1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4 魚藤素對(duì)FoxO1、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組比較，AKT基因轉(zhuǎn)染的模型組SGC-7901胃癌細(xì)胞中Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，F(xiàn)oxO1 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.01)；與模型組比較，經(jīng)過20、40 μmol/L魚藤素給藥作用24 h后均能夠降低Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平，升高FoxO1、Bax mRNA的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 魚藤素對(duì)FoxO1(左)、Bcl-2(中)、Bax(右)mRNA表達(dá)水平的影響

3 討論

胃癌作為臨床中常見的消化道惡性腫瘤，具有較高的致死率與并發(fā)癥，對(duì)患者的生命健康有極大的威脅[11]。隨著近幾年醫(yī)療科技手段的不斷進(jìn)步與普遍使用，越來越多的方法可以用于防治惡性腫瘤的發(fā)展，現(xiàn)階段主要研究方向?yàn)榘邢蛘{(diào)節(jié)。研究表明，原癌基因AKT經(jīng)常在胃癌中過表達(dá)或激活[12-13]。同時(shí)通路下游的分子AKT可通過磷酸肌醇-3激酶進(jìn)行調(diào)節(jié)，可以有效抑制糖脂代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)、惡性腫瘤和胰島素信號(hào)的形成，對(duì)于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用[14-15]。Yu等[16]研究表明，SGC-7901胃癌細(xì)胞中AKT信號(hào)通路被激活，提示AKT信號(hào)通路在胃癌發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用。FoxO1作為AKT信號(hào)通路下游的一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，不僅對(duì)惡性腫瘤的形成與細(xì)胞增殖具有明顯的作用，還對(duì)細(xì)胞的新陳代謝、發(fā)育、分裂分化均有一定的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，影響胃癌細(xì)胞的因素分為多種，而FoxO1的表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的發(fā)育、凋亡有著直接關(guān)系[17-18]。其中抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的重要基因之一是Bcl-2，而可引起人體細(xì)胞加快死亡的重要基因?yàn)锽ax，當(dāng)Bax基因過表達(dá)，則會(huì)降低Bcl-2基因的保護(hù)作用，從而使細(xì)胞凋亡速度加快。

陳立加等[19]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞SGC7901/VCR在不同濃度魚藤素下的活力受到不同程度的抑制作用，并濃度、時(shí)間具有梯度依賴性。魚藤素可能是對(duì)抗胃癌多藥耐藥以及細(xì)胞活力有影響，可作為一種潛在藥物深入研究。

魚藤素是AKT信號(hào)通路的抑制劑，具有顯著的抗癌活性。AKT/FoxO1信號(hào)通路在腫瘤抗凋亡及增殖過程中發(fā)揮著重要作用[20]。本實(shí)驗(yàn)在體外以SGC-7901胃癌細(xì)胞作為研究對(duì)象，考察魚藤素對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞中p-AKTThr308、FoxO1、Bcl-2等蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)運(yùn)用AKT過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染使SGC-7901胃癌細(xì)胞中AKT表達(dá)水平升高，然后再給予魚藤素作用，考察魚藤素對(duì)AKT/FoxO1信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響。研究結(jié)果表明魚藤素能夠抑制p-AKTThr308蛋白的表達(dá)，升高FoxO1的表達(dá)從而抑制Bcl-2的表達(dá)，升高Bax的表達(dá)水平從而誘導(dǎo)SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡[21-22]。

綜上所述，魚藤素能夠通過AKT/FoxO1信號(hào)通路調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子的釋放從而誘導(dǎo)SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡，對(duì)于胃癌的防治具有一定的作用。