闞延婷 吳衛(wèi)鋒 楊永峰

角蛋白(cytokeratin-18, CK18)是肝細(xì)胞內(nèi)重要的骨架纖維蛋白，具有維持肝細(xì)胞形態(tài)的功能。M30是CK18經(jīng)半胱天冬蛋白酶水解后釋放入血的可溶性片段，具有凋亡特異性抗原位點(diǎn)；M65是從凋亡或壞死細(xì)胞中直接釋放的未被裂解的完整CK18蛋白，能夠反映CK18的總體表達(dá)及釋放情況，因此M30和M65可敏感地反映細(xì)胞凋亡和壞死的情況。既往研究發(fā)現(xiàn)，M30和M65在多種急慢性肝病都存在異常表達(dá)，如慢性乙型肝炎(CHB)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和慢加急性肝衰竭(ACLF)等[1-2]，并與疾病的進(jìn)展和預(yù)后存在一定的相關(guān)性。本研究就藥物性肝損傷患者血清M30及M65水平及其與肝臟炎癥的關(guān)系進(jìn)行探討。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集2020年6月—2021年6月南京市第二醫(yī)院肝病一科收治的39例藥物性肝損傷患者，其中男性16例、女性23例，平均年齡(58.00 ± 14.12)歲。根據(jù)患者發(fā)病時(shí)肝臟炎癥程度分為輕-中度組和重度組，輕-中度組24例，平均年齡(56.37 ± 13.56)歲，重度組15例，平均年齡(62.13 ± 18.45)歲。分組標(biāo)準(zhǔn)：入院時(shí)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)≤10倍正常值上限納入輕-中度組，ALT>10倍正常值上限納入重度組，所有患者經(jīng)過治療后肝功能基本正常納入恢復(fù)組。健康體檢者18例作為對(duì)照組，男性5例、女性13例，平均年齡(30.12 ± 2.34)歲。

所有藥物性肝損傷的患者發(fā)病前有明確用藥史，否認(rèn)既往肝炎病史，并經(jīng)入院檢查后排除病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝病、膽道系統(tǒng)疾病、腫瘤和遺傳代謝性疾病，且對(duì)于與自身免疫性肝炎難以鑒別的患者，行肝穿刺活檢以排除免疫性肝病。

二、檢測(cè)方法

采用ELISA法檢測(cè)血清M30和M65水平(試劑盒均購自蘇州和銳生物有限公司)，檢測(cè)程序嚴(yán)格按說明書操作，采用DNM-9602酶標(biāo)分析儀讀取吸光度值(北京普朗新技術(shù)有限公司)。血生物化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)：ALT、AST、γ-GT、ALP和TBil 水平，采用COBAS701全自動(dòng)生化分析儀及其配套試劑檢測(cè)生物化學(xué)全套指標(biāo)(購自德國羅氏診斷公司)。入院時(shí)檢測(cè)血清M30和M65水平，當(dāng)經(jīng)過治療肝臟炎癥恢復(fù)，肝功能指標(biāo)基本正常后再次檢測(cè)血清M30和M65水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、健康對(duì)照組、輕-中度組與重度組基本臨床資料

表1 健康對(duì)照組、輕-中度組與重度組基本臨床資料比較

二、健康對(duì)照組、輕-中度組與重度組M30、M65水平比較

健康對(duì)照組的血清M30和M65分別為(47.53 ± 5.69)U/L和(64.74 ± 5.25)U/L，輕-中度組分別為(256.41 ± 50.61)U/L和(1007.98 ± 291.15)U/L，重度組分別為(1116.69 ± 136.83)U/L和(3963.68 ± 614.62)U/L。輕-中度組的血清M30、M65均高于健康對(duì)照組(t值分別為4.101, 3.239)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，重度組的血清M30、M65均高于健康對(duì)照組(t值分別為7.807, 6.343)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。重度組的血清M30、M65均高于輕-中度組(t值分別為5.897,4.346)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

三、健康對(duì)照組與恢復(fù)組M30、M65水平比較

恢復(fù)組的M30為(86.40 ± 23.92)U/L，與健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，M65為(137.70 ± 24.64)U/L，仍高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

四、M30、M65與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

在所有研究的藥物性肝損傷的病例中，M65與ALT(r=0.523,P<0.05)、AST(r=0.512,P<0.05)、γ-GT(r=0.434,P<0.05)及ALP(r=0.423,P<0.05)成正相關(guān)；M30與ALT(r=0.748,P<0.05)、AST(r=0.525,P<0.05)成正相關(guān)，而與γ-GT(r=0.325,P>0.05)及ALP(r=0.415,P>0.05)雖成正相關(guān)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在健康對(duì)照組中，血清M30、M65與臨床各指標(biāo)無顯著相關(guān)性。

討 論

藥物主要的代謝器官是肝臟，可通過直接毒性及作為半抗原誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，從而引起肝細(xì)胞損傷[3]。藥物性肝損傷在臨床上分為肝功能損害型、膽汁淤積型及混合型三型[4]，臨床表現(xiàn)為單純肝細(xì)胞酶升高(ALT、AST)或膽系酶升高(γ-GT、ALP)或兩類酶均升高。

細(xì)胞角蛋白(CK)是肝細(xì)胞內(nèi)重要的骨架纖維蛋白，具有維持肝細(xì)胞形態(tài)的功能。目前，已經(jīng)確定至少有37個(gè)不同的人角蛋白，其中，CK8、CK18在肝臟中最豐富[5]。當(dāng)各種因素破壞肝細(xì)胞膜完整性時(shí)，CK18大量釋放進(jìn)入外周血。M30是CK18的一個(gè)表位抗原，在肝細(xì)胞凋亡早期釋放入外周循環(huán)，具有凋亡特異性抗原位點(diǎn)，被用作細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物；而M65是從凋亡細(xì)胞中直接釋放的未被裂解的CK18，其水平能夠反映CK18的總體表達(dá)及釋放情況[6]。既往研究顯示，M30及M65在各種肝臟疾病中都存在異常表達(dá)，并與疾病的進(jìn)展及預(yù)后有一定的相關(guān)性[7-10]。

本研究中，我們檢測(cè)了因各種藥物引起肝損傷的患者血清中M30、M65的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，不論是輕-中度組還是重度組，其M30、M65的水平均較健康對(duì)照組明顯增高，提示M30、M65可作為判斷肝臟損傷的無創(chuàng)指標(biāo)。這可能與M30、M65在肝細(xì)胞中含量豐富有關(guān)，同時(shí)其半衰期短，當(dāng)存在肝細(xì)胞壞死及凋亡時(shí)，其水平可在短時(shí)間內(nèi)迅速變化，并早于血清轉(zhuǎn)氨酶升高。進(jìn)一步研究顯示，重度組的M30、M65的水平高于輕-中度組，且M65與ALT、AST、γ-GT及ALP成正相關(guān)，M30與ALT、AST成正相關(guān)，與γ-GT及ALP雖成正相關(guān)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在健康對(duì)照組中，血清M30、M65與臨床各指標(biāo)無顯著相關(guān)性。提示M30和M65可反映肝臟炎癥損傷的程度，其值越高，肝臟炎癥程度越重，這與其他研究相符合[11]。而M30與γ-GT及ALP的相關(guān)性不強(qiáng)，原因考慮藥物性肝損傷有3種臨床表現(xiàn)，在肝細(xì)胞型中，僅有單純的肝細(xì)胞損害，而膽管并無損害，ALP及γ-GT不高。另外，在Joka等[12]的研究中，發(fā)現(xiàn)M65在肝組織炎癥和纖維化方面均優(yōu)于M30，因在各種方式死亡的肝細(xì)胞都會(huì)釋放M65，而M30僅在肝細(xì)胞凋亡時(shí)釋放。

當(dāng)經(jīng)過藥物治療，肝功能逐漸好轉(zhuǎn)后，再次檢測(cè)血清M30、M65，發(fā)現(xiàn)其水平已較前明顯降低，肝臟炎癥恢復(fù)，M30水平與健康對(duì)照組相比差異不大，但恢復(fù)組的M65與健康對(duì)照組相比仍高。因在藥物性肝損傷患者中，經(jīng)過護(hù)肝、改善肝臟炎癥藥物治療后，肝臟炎癥恢復(fù)，血清轉(zhuǎn)氨酶降低，但組織炎癥恢復(fù)較血清學(xué)指標(biāo)慢，故M65能更準(zhǔn)確反映肝臟炎癥，且比血清轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)更靈敏。

綜上，血清M30和M65水平是反映藥物性肝損傷患者肝細(xì)胞壞死和凋亡較靈敏的指標(biāo)，但本研究存在一定不足之處，其中包括樣本量較少，可擴(kuò)大樣本量以獲得更為可靠的數(shù)據(jù)；同時(shí)可將M30、M65與其他檢測(cè)肝臟炎癥的方法進(jìn)行比較，尤其是肝臟病理學(xué)，從而更加精確分析M30、M65水平與肝臟炎癥及纖維化的關(guān)系。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。