張國(guó)卉 朱紫妍 慕沁汝 劉 謙

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355）

丹參為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根和根莖[1]，是我國(guó)傳統(tǒng)的大宗藥材，歷史悠久，藥理活性廣泛而復(fù)雜。丹參具有保護(hù)心肌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降低血壓和抗炎等作用，常用于治療心絞痛、冠心病、高血壓和炎癥等多種病癥[2]。其中，主治心絞痛和冠心病的復(fù)方丹參滴丸更是有望成為全球首個(gè)通過(guò)FDA認(rèn)證的復(fù)方中藥[3]。目前，丹參在全國(guó)多地均有栽培且產(chǎn)區(qū)逐年擴(kuò)大，但仍然面臨原藥材貨源緊缺的風(fēng)險(xiǎn)，一方面是由于我國(guó)社會(huì)進(jìn)入老齡化，心腦血管疾病的發(fā)病率不斷攀升，且近些年發(fā)病趨于年輕化的程度更加嚴(yán)重[4]；另一方面是因?yàn)殡S著研究人員對(duì)其藥理作用的深入研究，丹參的臨床應(yīng)用也有了更多新途徑。這些因素的共同作用促使丹參市場(chǎng)需求量呈逐年擴(kuò)增的態(tài)勢(shì)?，F(xiàn)今市售丹參基本為人工栽培品種，因產(chǎn)地環(huán)境不同，質(zhì)量也參差不齊，加之近年玉米、大豆等價(jià)格上漲[5]，藥農(nóng)種植丹參的積極性不高，提高丹參產(chǎn)量與質(zhì)量迫在眉睫。但是，丹參次生代謝機(jī)制尚不明確，品種選育年限過(guò)長(zhǎng)等問(wèn)題大大限制了新品種選育的進(jìn)程，無(wú)法滿足丹參生產(chǎn)多樣化、精準(zhǔn)化的需求。通過(guò)基因工程，可以輔助定向培育高產(chǎn)、高抗的優(yōu)質(zhì)新品種，或提高原藥材次生代謝產(chǎn)物含量用于有效成分提取，以滿足丹參巨大的市場(chǎng)需求量。1995年張蔭麟等[6]首次利用基因工程中的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以不含目的基因的根癌農(nóng)桿菌C58和發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834、LBA9402[7]對(duì)丹參無(wú)菌苗進(jìn)行侵染，最終獲得了丹參酮含量更高、根系更發(fā)達(dá)的再生植株。之后，相關(guān)研究人員在此基礎(chǔ)上導(dǎo)入不同的目的基因，構(gòu)建了各種丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系，涌現(xiàn)出大批相關(guān)報(bào)道?，F(xiàn)階段，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法仍是進(jìn)行丹參基因工程研究時(shí)使用的最普遍有效的手段。基于此，本文從轉(zhuǎn)化原理、影響因素和研究現(xiàn)狀三方面入手，對(duì)以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法為轉(zhuǎn)化手段的丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系建立進(jìn)行綜述，以期為今后丹參基因功能研究和新品種培育提供參考。

1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系研究的轉(zhuǎn)化原理

1.1 農(nóng)桿菌種類

農(nóng)桿菌是根瘤菌科（Rhizobitaceae）農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）的革蘭氏陰性細(xì)菌[8]，分為根癌農(nóng)桿菌、發(fā)根農(nóng)桿菌、放射性農(nóng)桿菌和旋鉤子農(nóng)桿菌。在丹參遺傳轉(zhuǎn)化研究中，常用的是根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）和發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）。

根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中均具有一個(gè)環(huán)狀DNA，分別稱為T(mén)i質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，研究人員根據(jù)質(zhì)粒誘導(dǎo)合成的冠癭堿不同對(duì)其進(jìn)行分類。在侵染丹參的試驗(yàn)中，常用的根癌農(nóng)桿菌為章魚(yú)堿型、胭脂堿型和農(nóng)桿堿型，常用的發(fā)根農(nóng)桿菌為甘露堿型、農(nóng)桿堿型和黃瓜堿型。外植體經(jīng)根癌農(nóng)桿菌侵染后可誘發(fā)產(chǎn)生冠癭瘤，經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后則產(chǎn)生大量不定根，在一定激素的誘導(dǎo)下可以再生成完整植株。

1.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化原理

Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒結(jié)構(gòu)相似，主要包括Ori復(fù)制起始區(qū)、Vir毒性蛋白區(qū)和T-DNA區(qū)3個(gè)功能區(qū)，這決定了它們具有相似的轉(zhuǎn)移機(jī)制。以下以Ti質(zhì)粒為例介紹農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化原理。

野生型Ti質(zhì)粒中有一段攜帶致瘤基因的TDNA序列，在Vir毒性區(qū)的作用下可被轉(zhuǎn)移插入到植物DNA組中完成植物的轉(zhuǎn)基因過(guò)程。具體可分為4步：①植物受傷后，傷口部位釋放的酚類物質(zhì)吸引農(nóng)桿菌靠近；②農(nóng)桿菌細(xì)胞膜上的VirA蛋白結(jié)合信號(hào)物質(zhì)并通過(guò)磷酸化突進(jìn)，進(jìn)一步激活另一個(gè)蛋白VirG；③核酸內(nèi)切酶VirD1和VirD2受到激活態(tài)的VirG蛋白誘導(dǎo)后，在T-DNA末端長(zhǎng)為25個(gè)堿基的重復(fù)序列位置進(jìn)行切割，產(chǎn)生一條在一端結(jié)合VirD2蛋白的單鏈T-DNA[9]；④VirE2蛋白與新產(chǎn)生的TDNA鏈結(jié)合形成成熟的T-DNA復(fù)合體進(jìn)入植物細(xì)胞，在植物細(xì)胞核中，T-DNA通過(guò)一系列作用被整合到植物基因組上。

但是，在實(shí)際的轉(zhuǎn)基因過(guò)程中，野生型Ti質(zhì)粒往往無(wú)法直接使用，主要是由于其上沒(méi)有合適的篩選標(biāo)記、缺乏直接為人所用的有效酶切位點(diǎn)、攜帶的致瘤基因太大且與研究不相關(guān)等。因此，研究人員通常會(huì)將T-DNA放置到另一個(gè)更容易被操作的載體上，而位于識(shí)別序列之間的DNA則被替換為要研究的目的基因，通過(guò)侵染，致病系統(tǒng)誘導(dǎo)T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞但不引入任何致瘤基因，從而使目的基因整合到植物基因組上，且不產(chǎn)生冠癭瘤。

2 丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系建立過(guò)程中影響轉(zhuǎn)化的因素

2.1 外植體選擇

外植體種類是影響丹參轉(zhuǎn)化效率的重要因素。這是由于農(nóng)桿菌中T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞完成轉(zhuǎn)化的階段在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生，要求植物細(xì)胞具有較強(qiáng)的分裂能力；而對(duì)于器官完整的植株來(lái)說(shuō)，不同器官的不同部位分裂能力有差異。因此，外植體選取的部位不同，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率不同。

目前，在以丹參為供試材料的試驗(yàn)中，主要將葉片作為外植體。在同一條件下，用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染丹參的葉片、葉柄和莖段，葉片的誘導(dǎo)效率最高，是最適合進(jìn)行毛狀根誘導(dǎo)的外植體[10-11]。尤其是葉片基部，因葉脈更粗，對(duì)農(nóng)桿菌的侵染更加敏感，是葉片中轉(zhuǎn)化率最高的部位[12]。蔡 媛等[13]對(duì)丹參葉片大小進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明，1.0～1.2 cm2為最佳葉面積，考慮到實(shí)際操作的便利性，最終將最佳條件確定為0.8 cm2。但也有少數(shù)試驗(yàn)結(jié)果表明，葉柄的分化率更高，分化速度更快，較葉片和莖段有明顯優(yōu)勢(shì)，具體可能與丹參葉齡有關(guān)。當(dāng)?shù)⑷~齡為7～14 d時(shí)，葉片分化效率較高；當(dāng)葉齡超過(guò)14～28 d甚至更長(zhǎng)時(shí)，葉柄分化效率較高[14]。由此可見(jiàn)，在選用外植體時(shí)還需考慮丹參葉齡。

2.2 外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間

適宜的預(yù)培養(yǎng)處理對(duì)丹參轉(zhuǎn)化率的提高具有促進(jìn)作用。外植體之所以需要預(yù)培養(yǎng)，有3個(gè)方面的原因：一是外植體剛從植株上分離，需要進(jìn)行生理狀態(tài)調(diào)整，從而加快細(xì)胞分裂，提高轉(zhuǎn)化效率；二是在植物傷口愈合過(guò)程中，細(xì)胞需要一定時(shí)間完成酚類化合物等信號(hào)分子的產(chǎn)生與釋放，從而誘導(dǎo)農(nóng)桿菌完成轉(zhuǎn)化；三是在剪切外植體的過(guò)程中可能會(huì)對(duì)其造成污染，通過(guò)預(yù)培養(yǎng)可提前剔除被雜菌污染的外植體。

預(yù)培養(yǎng)時(shí)間通常不超過(guò)3 d，以1～2 d居多。王麗娟[15]設(shè)置預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為 1、2、3、4 d，并以未經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的丹參葉片切塊為對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)預(yù)培養(yǎng)1 d或2 d的外植體轉(zhuǎn)化效率較高。若預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，植物細(xì)胞傷口基本愈合開(kāi)始形成愈傷組織或不定芽，農(nóng)桿菌侵染將較為困難，不僅會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率大大降低，同時(shí)還會(huì)提高假陽(yáng)性概率。

2.3 菌株種類

選用的菌株種類不同往往會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程產(chǎn)生直接影響。LBA4404、GV3101和EHA105是構(gòu)建丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系時(shí)常用的根癌農(nóng)桿菌，其中GV3101和EHA105的使用率更高，且EHA105生長(zhǎng)迅速、轉(zhuǎn)化操作簡(jiǎn)單，為轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中的首選菌種。常用的發(fā)根農(nóng)桿菌種類更為多樣。周 偉等[10]采用C58C1、R1601、A4進(jìn)行丹參毛狀根誘導(dǎo)率比較，結(jié)果表明，C58C1＞R1601＞A4， 且 C58C1的誘導(dǎo)率遠(yuǎn)大于 A4；談榮慧等[16]利用發(fā)根農(nóng)桿菌 LBA9402、A4、15834在pH值為4.81的MSOH液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)丹參毛狀根，發(fā)現(xiàn)其丹酚酸含量具有明顯差異，由LBA9402和A4誘導(dǎo)的毛狀根丹酚酸含量較高，15834誘導(dǎo)的毛狀根丹酚酸含量最低。

2.4 菌液濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間

菌液濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間是限制轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵因素，試驗(yàn)過(guò)程中三者經(jīng)常作為組合條件一同考慮。原因是農(nóng)桿菌侵染外植體后通常需要在創(chuàng)口部位生存16 h，從而將攜帶的目的基因整合到被侵染的樣品中，研究人員多采用農(nóng)桿菌和外植體在培養(yǎng)基上共培養(yǎng)的方式實(shí)現(xiàn)目的基因到植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，其時(shí)間長(zhǎng)短將直接影響轉(zhuǎn)化效率的高低。若共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，外植體會(huì)因農(nóng)桿菌過(guò)度繁殖而腐化死亡；若共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短，則無(wú)法完成目的基因的整合。其最優(yōu)時(shí)間的確定需要根據(jù)菌液濃度和侵染時(shí)間綜合而定。因此，三者息息相關(guān)。在以丹參為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究的多篇文獻(xiàn)中，均提到了菌液濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間的篩選（表1）。

表1 丹參不同遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化結(jié)果

分析前人研究成果可知，雖然在丹參不同轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建過(guò)程中得到的最優(yōu)結(jié)果有所差異，但菌液濃度基本維持在OD600=0.2～1.0，侵染時(shí)間控制在5～30 min，共培養(yǎng)時(shí)間為 1～4 d。 若低于常用范圍，農(nóng)桿菌難以附著并完成轉(zhuǎn)化；若高于常用范圍，丹參外植體可能因?yàn)楸砻孓r(nóng)桿菌過(guò)多難以剔除，最終受到毒害褐化，甚至死亡。

2.5 是否添加乙酰丁香酮

外源酚類化合物的添加可能會(huì)促進(jìn)丹參轉(zhuǎn)化率的提高。在以其他藥用植物為供試材料進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的試驗(yàn)中證實(shí)，植物受傷后產(chǎn)生的酚類物質(zhì)能夠激活vir基因，促使Ti/Ri質(zhì)粒向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移，如黃偉劍等[18]在誘導(dǎo)廣藿香外植體產(chǎn)生毛狀根時(shí)，人為添加了質(zhì)量濃度為15 mg/L的乙酰丁香酮，所用的2種不同菌株均表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化率的顯著提高。因此，推測(cè)通過(guò)人為添加乙酰丁香酮提高轉(zhuǎn)化效率的方式也可應(yīng)用到丹參的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中。

周 偉等[10]用發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1侵染外植體時(shí)，在預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)階段均加入了400 μmol/L乙酰丁香酮，其轉(zhuǎn)化率是不添加乙酰丁香酮時(shí)的1.55倍；超過(guò)最佳濃度后，丹參外植體會(huì)因高濃度小分子酚類物質(zhì)產(chǎn)生的氧化傷害褐化或老化死亡。但是，也有其他研究人員驗(yàn)證后表明，在一定情況下乙酰丁香酮并不是影響轉(zhuǎn)化率的限制性因素，可能是因?yàn)榈⑹軅麜r(shí)自然分泌的信號(hào)物質(zhì)已足以誘導(dǎo)農(nóng)桿菌中vir基因的活化[15]。

目前，有關(guān)乙酰丁香酮對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系的影響研究較少，試驗(yàn)結(jié)論的對(duì)立具體是因?yàn)楦骶觐愋蛯?duì)酚類化合物的敏感程度不同，還是因?yàn)椴僮鬟^(guò)程中各條件的差異，仍需進(jìn)一步研究。

2.6 除菌抗生素的添加

不同濃度和種類的除菌抗生素可以通過(guò)影響農(nóng)桿菌生長(zhǎng)及外植體分化間接影響轉(zhuǎn)化效率。目前，在構(gòu)建丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系過(guò)程中常用的除菌抗生素有3種類型：頭孢霉素、羧芐青霉素、特美汀。試驗(yàn)證明，這3種抗生素都能夠起到抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的作用。在頭孢霉素濃度低于400 mg/L時(shí)，丹參外植體會(huì)被過(guò)度繁殖的農(nóng)桿菌污染；當(dāng)頭孢霉素濃度達(dá)到400 mg/L時(shí)，雖能有效抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，但也抑制了外植體分化，出芽率較低。與頭孢霉素相比，羧芐青霉素和特美汀更適用于丹參外植體的脫菌，尤其是特美汀，在濃度達(dá)到400 mg/L后不僅有較好的除菌效果，同時(shí)丹參出芽率和轉(zhuǎn)化率也是三者中最高的；用羧芐青霉素除菌時(shí)，丹參轉(zhuǎn)化率隨其濃度的增大而升高，400 mg/L為最佳濃度[19]。

因此，綜合考慮除菌效果、外植體分化效果和轉(zhuǎn)化率三方面，特美汀是最適宜丹參外植體除菌的抗生素，其次是羧芐青霉素，頭孢霉素的效果最差。

3 研究現(xiàn)狀

自以丹參為供試材料實(shí)現(xiàn)了目的基因的轉(zhuǎn)入后，更多研究人員將研究重心轉(zhuǎn)移到利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法提高丹參品質(zhì)和產(chǎn)量上，且隨著研究的不斷深入，此法不僅可作為引入外源基因獲得具有優(yōu)良性狀丹參植株的利器，還逐漸成為探究丹參中影響有效成分含量的關(guān)鍵基因功能和輔助其他生物技術(shù)發(fā)揮作用的重要手段，近幾年發(fā)展勢(shì)頭尤為迅猛。

3.1 引入外源基因培育高抗丹參

3.1.1 抗旱丹參的培育。Zhang等[20]在CaMV 35S啟動(dòng)子控制下，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將從紅景天中分離得到的GPX基因家族成員RcGPX5在丹參中進(jìn)行表達(dá)，與野生型相比，在干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因丹參幼苗的枯萎時(shí)間更晚，丹參對(duì)干旱脅迫的耐受性增強(qiáng)。

3.1.2 抗除草劑丹參的培育。Liu等[21]將bar基因作為目的基因，通過(guò)農(nóng)桿菌導(dǎo)入到丹參中，并采用抗除草劑和gus表達(dá)兩步法進(jìn)行篩選，最終獲得的陽(yáng)性植株經(jīng)Basta噴灑后，表現(xiàn)出對(duì)除草劑較強(qiáng)的耐受性，成功獲得了抗除草劑的丹參品種。

3.2 探究與丹參有效成分含量提高相關(guān)的基因功能

通過(guò)與原植株對(duì)比，分析農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化成功后的過(guò)表達(dá)株系中有效成分含量變化水平，可以證明目的基因是否具有直接促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物合成的功能。如張建紅等[22]通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了丹參中SmCYP81C16基因的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因毛狀根株系，經(jīng)過(guò)與對(duì)照株系比較發(fā)現(xiàn)，在SmCYP81C16過(guò)表達(dá)陽(yáng)性株系中，丹參酮類化合物的含量升高，且過(guò)表達(dá)毛狀根中丹參酮合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量也顯著上升。由此證明，SmCYP81C16具有正向調(diào)控丹參酮生物合成的功能。

除此之外，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法還可作為探明部分基因如何間接影響有效成分含量的輔助手段。Wu等[23]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功獲得了過(guò)表達(dá)AtPAP1基因和過(guò)表達(dá)SmbHLH51基因的丹參植株，在此基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的分析和驗(yàn)證得出，AtPAP1通過(guò)激活SmbHLH51的表達(dá)來(lái)刺激丹參酚酸的合成，并可能與SmbHLH51形成潛在的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，明確了AtPAP1轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)丹參酚酸產(chǎn)生的分子機(jī)制。

3.3 證明其他生物技術(shù)用于提高丹參品質(zhì)的可行性

Zhou等[24]先利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)篩選出的RAS基因進(jìn)行特異性編輯，再將編輯好的目的基因用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式導(dǎo)入丹參細(xì)胞中，最終在轉(zhuǎn)基因毛狀根中觀察到了酚酸水平的變化，驗(yàn)證了CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為丹參甚至藥用植物基因組修飾工具的可行性。

4 結(jié)語(yǔ)

丹參是常用中藥材，同時(shí)丹參基因組小、染色體少，在轉(zhuǎn)基因再生植株時(shí)世代周期較短，作為藥用模式植物有著極高的研究?jī)r(jià)值[25]。根是植物進(jìn)行次生代謝最活躍的部分，而包括丹參在內(nèi)的大部分藥用植物有效成分都是次生代謝產(chǎn)物。由發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根來(lái)源于同一個(gè)植物細(xì)胞，每個(gè)毛狀根細(xì)胞都是轉(zhuǎn)化的，不會(huì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體，遺傳穩(wěn)定性好；且由毛狀根再生出的植株大多節(jié)間短、頂端優(yōu)勢(shì)較弱，有利于轉(zhuǎn)化植株的篩選，在作為生物反應(yīng)器和改良丹參品質(zhì)方面具有很大的市場(chǎng)和潛力。近幾年，以發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法為轉(zhuǎn)化手段得出的試驗(yàn)成果逐漸增多，但相比于根癌農(nóng)桿菌，由發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系還不夠成熟，部分與轉(zhuǎn)化效率有關(guān)的影響因素有待進(jìn)一步優(yōu)化。相信隨著農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)的日臻成熟，定會(huì)在優(yōu)化和豐富丹參種質(zhì)資源方面實(shí)現(xiàn)質(zhì)的飛躍。