陳鈕振， 李正炎,2**

(1. 中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 山東 青島 266100； 2. 中國海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室， 山東 青島 266100)

自1950年代塑料產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展以來，其在環(huán)境中的含量持續(xù)增加。大型塑料垃圾被排放進入水體后，經(jīng)由物理、化學(xué)和生物作用逐漸分解成不同尺寸的塑料碎片，學(xué)術(shù)界通常將粒徑在5 mm以下的塑料碎片稱為微塑料[1-3]。微塑料在水環(huán)境中廣泛分布，目前水環(huán)境中常見的微塑料類型主要包括聚乙烯(Polyethylene, PE)、聚丙烯(Polypropylene, PP)、聚氯乙烯(Polyvinyl chloride, PVC)、聚苯乙烯(Polystyrene, PS)等。從濱海沙灘到開闊大洋、從表層海水到海底、深海沉積物及海洋生物體內(nèi)均有不同類型的微塑料檢出。微塑料污染主要集中在沿海地區(qū)和亞熱帶環(huán)流區(qū)，但即使在遠離污染源的極地地區(qū)也有微塑料的存在。由于其具有體積小、疏水性強、不易被生物降解的特點，可以在環(huán)境中長期存在。微塑料進入貽貝(Mytilusedulis)體內(nèi)后可誘導(dǎo)溶酶體膜的穩(wěn)態(tài)失衡并形成粒細胞瘤，且隨著暴露時間的延長炎癥反應(yīng)加劇[4]。這表明微塑料可以進入細胞內(nèi)，并在組織和細胞水平上對生物產(chǎn)生毒害作用。盡管大粒徑塑料的研究最為廣泛，但納米塑料在海洋環(huán)境中的數(shù)量可能更為龐大[5]。大粒徑塑料的進一步碎片化是水環(huán)境中納米塑料的重要來源之一，納米塑料顆粒能降低蛋白核小球藻細胞葉綠素a含量，并增加細胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species, ROS)水平[6]；納米塑料還具有生物積累和生物放大的潛力[7]，已有研究證明其可沿食物網(wǎng)從藻類向浮游動物和魚類傳遞。納米塑料是微塑料相關(guān)研究中報道最少的一種塑料類型，目前對其環(huán)境濃度、生物積累潛力和毒性知之甚少。

多溴聯(lián)苯(Polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是一類溴化阻燃劑，穩(wěn)定性強且價格低廉，因此被廣泛應(yīng)用于電子電器、建筑材料以及塑料的加工過程中。溴化程度較低的溴化二苯醚(主要是BDE-47、-99、-100)是生物樣品中檢測到的主要同系物，其中BDE-47占PBDEs總量的70%左右。BDE-47的高度親脂性(logKow=6.67)使其容易在生物體內(nèi)積累[8]，因此，其對水生生物的毒性效應(yīng)已引起學(xué)術(shù)界和民眾的高度關(guān)注。Jiang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于BDE-47溶液中的貽貝(Mytilusedulis)血細胞死亡率和微核率均增加，溶酶體的吞噬能力顯著降低。此外，BDE-47暴露顯著增加了鮭魚頭腎巨噬細胞中超氧陰離子的產(chǎn)生量，并使鮭魚在鰻利斯頓氏菌(Listonellaanguillarum)攻擊下的存活率降低，這表明BDE-47暴露可改變鮭魚的先天免疫應(yīng)答和疾病易感性[10]。但在自然環(huán)境中，海洋往往受到多種化學(xué)污染物的共同作用，Oliveira等[11-12]研究發(fā)現(xiàn)，在PS與芘的聯(lián)合暴露組中，鰕虎魚(Pomatoschistusmicrops)體內(nèi)乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)和異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate dehydrogenase, IDH)活性顯著降低。PS和PAHs復(fù)合暴露可在細胞和基因水平上干擾日本青鳉(Oryziaslatipes)內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能。已有研究表明[13]，與BDE-47單獨暴露相比，PS和BDE-47聯(lián)合暴露顯著提高了貽貝(Mytilusedulis)的呼吸速率和體內(nèi)丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量。因此，微塑料與其他環(huán)境污染物復(fù)合污染的潛在風(fēng)險值得進一步研究，以期更深入地了解微塑料對海洋生物的生態(tài)毒性。

生物標(biāo)志物是反映環(huán)境污染狀況的毒理學(xué)指標(biāo)，可通過監(jiān)測其變化情況來評估污染物的毒性效應(yīng)[14]。但不同生物標(biāo)志物對污染物的響應(yīng)強度及變化各異，孤立使用單一生物標(biāo)志物無法全面準(zhǔn)確評估某一種環(huán)境污染物的毒性效應(yīng)。而綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)(Integrated Biomarker Response, IBR)則可以定量評估一系列生物標(biāo)志物對環(huán)境污染物的綜合響應(yīng)情況。李傳慧[15]通過檢測幾種抗氧化酶和免疫酶的含量來探究原油污染對半滑舌鰨幼魚(Cynoglossussemilaevis)的毒性效應(yīng)，IBR分析結(jié)果表明，溶菌酶(Lysozyme，LSZ)和Na+-K+-ATPase對石油污染更敏感，適合作為石油類污染的生物標(biāo)志物。李志華等[16]以鱒魚為受試生物，運用IBR指數(shù)分析污水排放對河流上、下游環(huán)境的影響，結(jié)果表明水體中39種污染物對下游的污染均顯著強于上游。除上述應(yīng)用外，國內(nèi)外其他學(xué)者也運用該方法對不同水體的污染程度進行了一系列評估[17-19]。

黑褐新糠蝦(Neomysisawatschensis)是一種較小的甲殼類浮游動物，常見于河口近岸水域。由于其具有易于培養(yǎng)和操作、生命周期短等優(yōu)點，被認為是生態(tài)毒理學(xué)研究很有前景的模式生物。納米塑料具有更大的比表面積和強疏水性，可吸附海洋環(huán)境中其他化學(xué)污染物，形成“外源污染物+納米塑料”的復(fù)合污染模式。已有研究報道了微塑料和BDE-47單獨暴露下的毒性效應(yīng)，但2種污染物聯(lián)合暴露下的復(fù)合效應(yīng)目前尚不明確。為了探究微塑料和BDE-47對黑褐新糠蝦的毒性效應(yīng)，本研究選擇PS和BDE-47作為脅迫因子，通過測定黑褐新糠蝦體內(nèi)過氧化氫酶(Catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPX)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase, GST)、谷胱甘肽(Glutathione, GSH)和MDA的活性水平，并結(jié)合IBR指數(shù)定量評估PS和BDE-47單獨及聯(lián)合暴露下的毒性效應(yīng)，研究結(jié)果可為評估PS和BDE-47共存條件下的海洋環(huán)境健康風(fēng)險提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用海水來自青島市近岸潔凈海區(qū)，經(jīng)過濾、消毒后使用；黑褐新糠蝦(Neomysisawatschensis)由中國海洋大學(xué)海洋生物博物館提供。實驗前室內(nèi)馴養(yǎng)一周：鹽度為21±0.6；溫度為(22.6±0.6) ℃；pH為8.1±0.1，每天以新孵化的鹵蟲(Artemiafranciscana)為餌料投喂兩次(上午8:00，下午17:00)。每48 h更換新鮮海水，并及時清理排泄物、殘餌和死亡個體。2.5%(W∶V)的聚苯乙烯微球購自天津倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心(90 nm，10 mL)；2,2′,4,4′-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47，純度95%,購自上海源葉生物科技有限公司)，用二甲亞砜(DMSO，分析純，購自科密歐化學(xué)試劑有限公司)作為助溶劑配置1.5 g·L-1的母液。

1.2 實驗方法

1.2.1 暴露濃度設(shè)計 根據(jù)研究報道[20]，目前微塑料豐度最高值(102 000 個/L)出現(xiàn)在瑞典沿海水域。根據(jù)Lenz等的估計，塑料微球直徑每減少10倍，其環(huán)境豐度將增加1 000倍[21]?；谖墨I報道的海洋環(huán)境中微塑料豐度和水生生物毒性試驗濃度設(shè)置[18,22]，本研究中微塑料暴露設(shè)置4個濃度：9.74、97.4、974和9 740 μg·L-1，另設(shè)一個空白對照組，每組三個重復(fù)。

BDE-47溶解度較低，在自然海水中的環(huán)境濃度一般在1 μg·L-1左右[23]。目前已有相關(guān)研究表明1～15 μg·L-1的BDE-47暴露對海洋生物有顯著毒性[24-25]。基于海水中BDE-47的環(huán)境濃度和已有報道中海洋生物毒性試驗的濃度設(shè)置，本研究將BDE-47的暴露濃度設(shè)為1.5、15和150 μg·L-1。另設(shè)一個空白對照組，一個溶劑對照組(0.002% DMSO)，每組三個重復(fù)。

聯(lián)合暴露組：9.74 μg·L-1PS+1.5 μg·L-1BDE-47，9.74 μg·L-1PS+150 μg·L-1BDE-47，9 740 μg·L-1PS+1.5 μg·L-1BDE-47，9 740 μg·L-1PS+150 μg·L-1BDE-47；另設(shè)一個空白對照組，一個溶劑對照組(0.002% DMSO)，每組三個平行。分別記為LP+LB組，LP+HB組，HP+LB組，HP+HB組，CK組和SOLVENT組。

1.2.2 染毒實驗與樣品制備 選擇馴化后體長相近(5±0.5) mm、健康活潑的黑褐新糠蝦，隨機將其分配到20 L玻璃缸中(加入15 L海水)，每缸放入80只糠蝦，連續(xù)曝氣培養(yǎng)，每48 h更換全部溶液，其他實驗條件與馴養(yǎng)期相同。每天定時投喂并清理玻璃缸，于第21天收集受試生物用于各項生物標(biāo)志物測定。用去離子水沖洗掉樣本體表粘附的溶液，并用濾紙拭干多余水分，取10只糠蝦置于Eppendorf管中，在冰水浴條件下，以PBS緩沖液作為勻漿介質(zhì)，采用電動生物組織研磨器(G10，生工生物工程股份有限公司，上海)將樣品制成質(zhì)量分數(shù)為10%的組織勻漿液。經(jīng)4 ℃、8 000 r·min-1低溫離心10 min，取上清液用于各項指標(biāo)的測定。

1.2.3 實驗指標(biāo)測定 蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍法；SOD、CAT、MDA、GST、GSH和GPX的活性均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測定，具體操作按照說明書進行，并借助酶標(biāo)儀(SP-Max 2300A，上海閃譜生物科技有限公司，上海)及紫外分光光度計(UV754N，青島路博建業(yè)環(huán)?？萍加邢薰?，青島)測定吸光度。

IBR數(shù)值的具體計算過程主要包括以下步驟[26]：

(1)

各生物標(biāo)志物在每個實驗水平下的得分情況按下式計算：

Si=Z+|Min|。

(2)

式中：|Min|是各生物標(biāo)志物在所有實驗水平下的Zi最小值的絕對值；Z由上一步均一化數(shù)值推導(dǎo)而來，若生物標(biāo)志物受到激活，則令Z=+Yi；若生物標(biāo)志物受抑制，則令Z=-Yi。

其次繪制星狀圖并計算面積：星狀圖中每條輻射線的長度分別表示某一實驗水平下一種生物標(biāo)志物的得分Si。按照以下公式計算面積：

Ai=0.5×Si×sinβ×(Si×cosβ+Si+1×sinβ)。

(3)

式中：Si和Si+1分別表示星狀圖中順時針方向連續(xù)兩個得分；n表示所測定的生物標(biāo)志物的數(shù)目；Ai表示第i條和第i+1條輻射線所圍成的三角形的面積。

(4)

式中α為相鄰兩條輻射線之間的夾角。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值(標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，并借助SPSS 25.0對各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用最小顯著差數(shù)法(LSD法)檢驗組內(nèi)及組間的顯著性差異(P<0.05差異顯著，P<0.01差異極顯著)。采用Origin 2018進行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 PS單獨暴露對黑褐新糠蝦體內(nèi)生物標(biāo)志物的影響

所有PS暴露濃度下的CAT活性均低于空白對照組，并隨著暴露濃度的增加而逐漸降低。當(dāng)暴露濃度較高時(97.4～9 740 μg·L-1)，實驗組的CAT活性與對照組間差異顯著，并在974 μg·L-1濃度組中達到最低活性水平，濃度繼續(xù)增加至9 740 μg·L-1時，CAT活性未繼續(xù)降低(見圖1(a))。SOD活性僅在高暴露濃度組中(974～9 740 μg·L-1)顯著低于對照組(見圖1(b))。與對照組相比，低濃度PS組中(9.74 μg·L-1)MDA含量未顯著改變，隨著暴露濃度的增加， MDA含量逐漸升高且與對照組間有顯著差異(見圖1(c))。與對照組相比，GST活性在較高濃度組中(97.4～9 740 μg·L-1)顯著降低，但各PS實驗組間并無顯著差異，GST活性整體呈現(xiàn)降低的趨勢(見圖1(d))。當(dāng)暴露濃度為97.4 μg·L-1時，GSH含量顯著升高，但其他實驗組與對照組間并無顯著差異，GSH含量隨暴露濃度的增加總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(見圖1(e))。當(dāng)暴露濃度為974～9 740 μg·L-1時，GPX活性顯著低于對照組，且各實驗組間GPX活性存在顯著差異，隨著暴露濃度的增加GPX活性整體呈降低的趨勢(見圖1(f))。

2.2 BDE-47單獨暴露對黑褐新糠蝦體內(nèi)生物標(biāo)志物的影響

暴露21 d后，空白對照組和溶劑對照組間無顯著差異，說明溶劑對實驗結(jié)果無顯著影響。與空白和溶劑對照組相比，各實驗組中CAT活性均顯著降低，當(dāng)暴露濃度為150 μg·L-1時，CAT活性達到最低活性水平，CAT活性整體呈現(xiàn)降低的趨勢(見圖2(a))。當(dāng)暴露濃度為1.5～15 μg·L-1時，SOD活性顯著高于空白對照組和溶劑對照組，而當(dāng)濃度進一步增加到150 μg·L-1時，SOD活性恢復(fù)至對照組水平，SOD活性整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(見圖2(b))。與對照組相比，隨著暴露濃度的增加，各實驗組的MDA含量逐漸升高，當(dāng)濃度為15～150 μg·L-1時，MDA含量顯著高于對照組，且各實驗組間的MDA含量差異顯著(見圖2(c))。當(dāng)暴露濃度較高時(15～150 μg·L-1),GST活性顯著低于對照組，但無顯著的組間差異(見圖2(d))。與對照組相比，低濃度組(1.5 μg·L-1)中的GSH含量未發(fā)生顯著變化，當(dāng)濃度進一步升高時，GSH含量顯著降低，GSH含量隨著暴露濃度的升高整體呈現(xiàn)降低的趨勢(見圖2(e))。當(dāng)暴露濃度處于低水平時(1.5 μg·L-1)，GPX活性與對照組無顯著差異，隨著暴露濃度繼續(xù)升高，GPX活性與對照組間存在顯著差異,并在15 μg·L-1的濃度組中達到最大活性水平，GPX活性整體呈現(xiàn)先升后降的趨勢(見圖2(f))。

圖1 PS單獨暴露對黑褐新糠蝦抗氧化機能的影響(不同字母表示各實驗組間有顯著差異，P<0.05)

圖2 BDE-47單獨暴露對黑褐新糠蝦抗氧化機能的影響

2.3 PS和BDE-47聯(lián)合暴露對黑褐新糠蝦體內(nèi)生物標(biāo)志物的影響

與對照組相比，在BDE-47實驗組中投加低濃度PS后，CAT活性顯著升高，隨著PS投加量的增加，CAT活性出現(xiàn)顯著下降。與BDE-47單獨暴露時相比，各聯(lián)合暴露組的CAT活性均顯著升高(見圖3(a))。在低濃度PS和高濃度BDE-47、高濃度PS和低濃度BDE-47、高濃度PS和高濃度BDE-47聯(lián)合暴露組中，觀察到SOD活性與對照組間均存在顯著差異。與BDE-47單獨暴露組相比，當(dāng)BDE-47濃度較低時，加入低濃度PS可使SOD活性顯著升高，繼續(xù)升高PS濃度則會使SOD活性降低但未見顯著差異；當(dāng)BDE-47濃度較高時，加入低濃度PS同樣會使SOD顯著升高并達到最大活性水平(見圖3(b))。在各聯(lián)合暴露組中，當(dāng)BDE-47暴露濃度較低時,高濃度PS的存在使MDA含量顯著高于BDE-47單獨暴露組；當(dāng)BDE-47暴露濃度較高時，隨著PS濃度的升高MDA含量逐漸升高，且在高濃度PS和高濃度BDE-47共存時出現(xiàn)最大含量(見圖3(c))。

各聯(lián)合暴露組中GST活性與對照組相比無顯著差異，且均低于BDE-47單獨暴露組，當(dāng)BDE-47濃度較低時，GST活性隨著PS投加濃度的升高而顯著增加；當(dāng)BDE-47濃度較高時，增加PS的投加濃度并未顯著改變GST活性(見圖3(d))。當(dāng)?shù)蜐舛萈S分別與低、高濃度的BDE-47聯(lián)合暴露時，GSH含量與對照組間無顯著差異；當(dāng)高濃度PS分別與低、高濃度的BDE-47聯(lián)合暴露時，GSH含量與對照組間有顯著差異，且隨著BDE-47濃度升高顯著降低。與BDE-47單獨暴露相比，當(dāng)BDE-47濃度較低時，投加高濃度PS可使GSH含量顯著升高，而當(dāng)BDE-47濃度較高時，低濃度PS的存在可使聯(lián)合暴露組的GSH含量顯著升高(見圖3(e))。與對照組相比，僅高濃度PS和高濃度BDE-47聯(lián)合暴露組的GPX活性顯著降低，且各聯(lián)合暴露組的GPX活性均顯著低于BDE-47單獨暴露組(見圖3(f))。

(CK：空白對照；Solvent：溶劑對照；LB：低濃度BDE-47組；HB：高濃度BDE-47組；LP+LB：低濃度PS+低濃度BDE-47組；LP+HB：低濃度PS+高濃度BDE-47組；HP+LB：高濃度PS+低濃度BDE-47組，HP+HB：高濃度PS+高濃度BDE-47組。CK: Control; SOLVENT: Solvent control; LB: Low BDE-47 concentration groups; HB: High BDE-47 concentration groups; LP+LB: Low PS+Low BDE-47 concentration groups; LP+HB: Low PS+High BDE-47 concentration groups; HP+LB: High PS+ Low BDE-47 concentration groups; HP+HB：High PS+High BDE-47 concentration groups.)

2.4 綜合生物標(biāo)志物分析

星狀圖中每個不規(guī)則多邊形的面積分別代表該實驗組的IBR數(shù)值，六種生物標(biāo)志物在不同的實驗組中具有不同的響應(yīng)模式，與其他實驗組相比，最高濃度組的星狀圖覆蓋面積最大，即IBR數(shù)值也最大。由圖4(a)可知，在較低暴露濃度下(9.74 μg·L-1)，GPX、CAT、MDA及SOD幾種生物標(biāo)志物有較高的響應(yīng)水平，最高響應(yīng)水平為9 740 μg·L-1濃度組的MDA含量(4.31)。總體而言，SOD、CAT、MDA和GPX在所有濃度下均有較高的響應(yīng)水平，說明這幾種生物標(biāo)志物對于PS污染的反應(yīng)比較靈敏。不同BDE-47暴露濃度下的IBR響應(yīng)水平如圖4(b)所示，隨著暴露濃度的升高，星狀圖的覆蓋面積逐漸增加，說明BDE-47對黑褐新糠蝦的脅迫作用隨濃度增加而加劇，其中最大響應(yīng)水平出現(xiàn)在150 μg·L-1濃度組的CAT活性中(3.81)。整體而言，CAT、MDA、GST和GSH有較高的響應(yīng)水平，表明以上幾種生物標(biāo)志物對于BDE-47污染的反應(yīng)比較靈敏。PS和BDE-47聯(lián)合暴露下的IBR響應(yīng)水平如圖4(c)所示，不同聯(lián)合暴露條件下的響應(yīng)情況不一致，當(dāng)高PS濃度和高BDE-47濃度聯(lián)合暴露時，星狀圖覆蓋面積最大，IBR數(shù)值也最大(28.1)，表明當(dāng)高濃度PS和高濃度BDE-47共存時黑褐新糠蝦受到的脅迫效應(yīng)最強。SOD、MDA、CAT、GST和GSH在所有暴露濃度下均有較高的響應(yīng)水平，說明以上生物標(biāo)志物在PS和BDE-47共存時具有較高的靈敏度。

(CK：空白對照；Solvent：溶劑對照；LB：低濃度BDE-47組；HB：高濃度BDE-47組；LP+LB：低濃度PS+低濃度BDE-47組；LP+HB：低濃度PS+高濃度BDE-47組；HP+LB：高濃度PS+低濃度BDE-47組，HP+HB：高濃度PS+高濃度BDE-47組。(a) PS單獨暴露下黑褐新糠蝦體內(nèi)綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)星狀圖；(b) BDE-47單獨暴露下黑褐新糠蝦體內(nèi)綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)星狀圖；(c) PS和BDE-47聯(lián)合暴露下黑褐新糠蝦體內(nèi)綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)星狀圖。CK: Control; Solvent: Solvent control; LB: Low BDE-47 concentration groups; HB: High BDE-47 concentration groups; LP+LB: Low PS + Low BDE-47 concentration groups; LP+HB: Low PS + High BDE-47 concentration groups; HP+LB: High PS+ Low BDE-47 concentration groups; HP+HB：High PS+ High BDE-47 concentration groups. (a) Integrated Biomarker Response in Neomysis awatschensis exposed to PS; (b) Integrated Biomarker Response in Neomysis awatschensis exposed to BDE-47; (c) Integrated Biomarker Response in Neomysis awatschensis under combined exposure of PS and BDE-47)

各實驗組IBR響應(yīng)水平隨暴露濃度的變化情況如圖5所示。當(dāng)PS單獨暴露時(見圖5(a))，IBR響應(yīng)水平隨著暴露濃度的增加整體上呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢，當(dāng)暴露濃度為97.4 μg·L-1時有最低的響應(yīng)水平(9.21)，隨著暴露濃度的進一步增加，IBR值逐漸增加并在9 740 μg·L-1濃度組中達到最大水平(14.98)。當(dāng)BDE-47單獨暴露時(見圖5(b))，與對空白對照組和溶劑對照組相比，隨著暴露濃度的增加IBR數(shù)值逐漸增大，并在150 μg·L-1濃度組中達到最大響應(yīng)水平(15.69)。當(dāng)PS和BDE-47聯(lián)合暴露時(見圖5(c))，所有聯(lián)合暴露實驗組的IBR響應(yīng)水平均高于空白對照組和溶劑對照組，在低濃度PS存在時，增加BDE-47的暴露濃度并未觀察到IBR響應(yīng)水平的升高，而在高濃度PS存在時，增加BDE-47的暴露濃度可使IBR響應(yīng)水平隨之升高，在高濃度PS和高濃度BDE-47共存時有最大響應(yīng)水平(28.1)。

((a) PS單獨暴露下黑褐新糠蝦體內(nèi)綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)；(b) BDE-47單獨暴露下黑褐新糠蝦體內(nèi)綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)；(c) PS和BDE-47聯(lián)合暴露下黑褐新糠蝦體內(nèi)綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)。(a) IBR variation with concentrations in Neomysis awatschensis exposed to PS; (b) IBR variation with concentrations in Neomysis awatschensis exposed to BDE-47; (c) IBR variation with concentrations in Neomysis awatschensis under the combined exposure of PS and BDE-47)

3 討論

本研究選用的黑褐新糠蝦是一種小型雜食性甲殼動物，由于其在環(huán)境中分布范圍廣、室內(nèi)馴養(yǎng)便利，已被用作生態(tài)毒理學(xué)的模式生物。研究表明[27-29]，ROS水平升高和氧化應(yīng)激是機體在納米顆粒脅迫下產(chǎn)生損傷的早期事件。本文以黑褐新糠蝦為受試生物進行PS的脅迫實驗，結(jié)果表明PS暴露可能增加黑褐新糠蝦體內(nèi)的ROS水平，從而激活細胞抗氧化防御系統(tǒng)來對抗氧化應(yīng)激，這與先前的研究報道結(jié)論相符[30-31]。在高暴露濃度下(974～9 740 μg·L-1)，SOD和GPX的活性被顯著抑制，這與Yu等[20]的研究結(jié)果相似。這可能是因為在高濃度PS暴露下超氧陰離子的產(chǎn)生速率超過抗氧化防御系統(tǒng)的清除速率，致使生物機體受到不可逆轉(zhuǎn)的損傷。而MDA含量在低濃度下低于對照組，這是因為隨著抗氧化防御系統(tǒng)被激活，機體產(chǎn)生的抗氧化物質(zhì)清除了可對組織細胞造成損傷的自由基，隨著PS暴露濃度繼續(xù)增加，MDA含量逐漸升高，表明PS以濃度依賴的方式誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化。Zheng等[32]的研究表明PS暴露可使大鼠肝細胞的MDA含量被顯著誘導(dǎo)，這與本研究的結(jié)果相符。Abidli等[33]通過14 d暴露試驗探究了PE對貽貝的潛在毒性，結(jié)果表明抗氧化系統(tǒng)內(nèi)的CAT與GST活性均降低。本研究中，隨著PS濃度的增加CAT和GST活性也都受到抑制，這一現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是因為高濃度PS需要抗氧化防御系統(tǒng)產(chǎn)生大量的抗氧化酶來將其清除，另外在高濃度PS的長期毒害作用下，機體抗氧化防御系統(tǒng)的解毒功能受到損傷，故CAT和GST活性迅速降低。

在選取的BDE-47暴露濃度范圍內(nèi)，所有實驗組的CAT和GST活性均受到顯著抑制，這與先前的研究結(jié)果相似[34]。這一過程表明在低濃度外源污染物的長期暴露下，機體內(nèi)自由基、過氧化物的含量大量增加，需要消耗抗氧化酶來將其清除，故造成CAT和GST活性顯著低于對照組，當(dāng)濃度升高至中等濃度時，CAT與GST活性未繼續(xù)增加，這可能是因為黑褐新糠蝦在通過自身的調(diào)節(jié)能力適應(yīng)該濃度范圍內(nèi)的BDE-47脅迫。當(dāng)暴露濃度升高至最大水平時，CAT活性繼續(xù)降低，而GST活性仍未出現(xiàn)顯著變化，由此可知BDE-47對CAT活性的影響較GST更強。已有研究表明[15]，解除石油污染脅迫后，半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)幼魚體內(nèi)的CAT活性在一定濃度范圍內(nèi)可恢復(fù)至空白水平，并得到了石油脅迫對CAT活性的影響閾值。由此推斷，SOD活性在高濃度暴露下可恢復(fù)至與對照組相近水平的潛在原因可能是本文所設(shè)暴露濃度尚未超過BDE-47對黑褐新糠蝦SOD活性的影響閾值，機體仍能通過調(diào)節(jié)作用適應(yīng)污染環(huán)境。而MDA含量則隨著濃度的增加呈現(xiàn)顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系，這與先前的研究報道相同[35]，表明脂質(zhì)過氧化作用在逐漸加強，最終可能導(dǎo)致生物膜系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)失衡[36]，在今后的研究中可結(jié)合組織病理學(xué)分析深入探究BDE-47的毒害作用。GSH是生物抗氧化防御系統(tǒng)中的重要成分，可作為GST和GPX的反應(yīng)底物通過催化反應(yīng)清除自由基和過氧化物，對于維護生物體免疫系統(tǒng)的正常功能具有重要作用[37-38]。較高濃度組(15～150 μg·L-1)的GSH含量顯著降低，而GPX的活性顯著增加，原因可能是機體受到環(huán)境中高濃度BDE-47的長期脅迫后，抗氧化防御系統(tǒng)會產(chǎn)生大量的GPX來清除自由基。

由于其特殊的理化性質(zhì)，納米塑料作為載體吸附其他外源化學(xué)污染物的潛力值得關(guān)注，如有機氯農(nóng)藥[39]、多環(huán)芳烴[40]、多溴聯(lián)苯醚[41]、多氯聯(lián)苯[42]、雙酚A[43]和重金屬[44]，其中包括致癌物和內(nèi)分泌干擾物。微塑料的吸附作用可能會增加污染物在生物體內(nèi)的濃度，并通過食物網(wǎng)向更高營養(yǎng)級生物轉(zhuǎn)移[45]。PS和BDE-47聯(lián)合暴露組的CAT活性均顯著高于BDE-47單獨暴露組，表明PS的加入緩解了BDE-47對黑褐新糠蝦體內(nèi)CAT的損傷。聯(lián)合暴露組的GST活性顯著低于BDE-47單獨暴露組，并且與對照組活性水平相近，GPX活性的變化規(guī)律同GST活性相似，僅在高濃度BDE-47和高濃度PS共存時表現(xiàn)出顯著的抑制效應(yīng)。低濃度PS與低、高濃度BDE-47聯(lián)合暴露下的GSH含量與對照組相近，以上結(jié)果進一步說明PS的存在可能在一定程度上緩解了BDE-47對糠蝦機體抗氧化防御系統(tǒng)的脅迫作用，隨著PS暴露濃度的繼續(xù)增加，抗氧化物質(zhì)的活性會受到抑制，這種效應(yīng)是產(chǎn)生中毒反應(yīng)的前兆。由聯(lián)合暴露組的IBR隨濃度變化趨勢可知，當(dāng)PS濃度較低時，升高BDE-47的暴露濃度并未增加氧化脅迫，這也證實了PS的存在可在一定范圍內(nèi)緩解BDE-47的暴露毒性。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是微塑料的吸附作用降低了BDE-47的生物可利用度，故在一定范圍內(nèi)削減了BDE-47對機體的氧化應(yīng)激。有研究報道稱[46]， PVC和低濃度17α-乙烯基雌二醇(EE2)聯(lián)合暴露時，PVC可通過吸附作用降低EE2的自由態(tài)來減緩其對斑馬魚(Daniorerio)運動行為的抑制。Oliveira等[47]研究發(fā)現(xiàn)加入低濃度PS微球可將芘對鰕虎魚(Pomatoschistusmicrops)的半數(shù)致死時間(LT50)從29.0 h延緩至42.1 h。此前也有研究表明[48-49]，總比表面積越大，微塑料的吸附效率越大，這可能是低濃度PS暴露減輕脅迫而高濃度PS暴露無此效應(yīng)的潛在解釋。當(dāng)PS的投加濃度較高時，PS顆粒聚集結(jié)合從而減少了總比表面積，降低了PS對自由態(tài)BDE-47的吸附，脅迫作用加劇。也有研究表明[50]，四溴雙酚A(TBBPA)和PS對斑馬魚(Daniorerio)抗氧化防御系統(tǒng)的毒性作用主要表現(xiàn)為協(xié)同作用；Lu等[51]的研究也表明，PS與Cd聯(lián)合暴露可顯著抑制斑馬魚(Daniorerio)腸道組織中GSH的含量，二者表現(xiàn)出協(xié)同作用；何君儀[52]的研究結(jié)果表明，PS的加入會增強三磷酸苯酯(TPP)對斑馬魚(Daniorerio)抗氧化防御系統(tǒng)的氧化脅迫，這與本研究的結(jié)論相反。PS與熒蒽聯(lián)合暴露對貽貝(Mytilusedulis)細胞中ROS的含量先表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)，后表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)[53]。由此可知，微塑料與外源污染物聯(lián)合暴露對水生生物的毒性作用模式較為復(fù)雜，本文選取了一系列生物標(biāo)志物作為評價指標(biāo)來表征微塑料和BDE-47單獨及聯(lián)合暴露對黑褐新糠蝦的毒性效應(yīng)，今后可在本研究的基礎(chǔ)上結(jié)合組織病理學(xué)分析、基因組學(xué)和代謝組學(xué)等先進分子生物學(xué)技術(shù)，深入探究其毒性作用機制。

4 結(jié)論

(1)隨著PS暴露濃度的增加，CAT、GST、SOD和GPX活性均表現(xiàn)出抑制效應(yīng)，MDA含量表現(xiàn)出誘導(dǎo)效應(yīng)，而GSH含量僅在97.4 μg·L-1下被顯著誘導(dǎo)。隨著BDE-47暴露濃度的增加，CAT、GST和GSH均表現(xiàn)出抑制效應(yīng)，MDA和GPX在較高濃度下被顯著誘導(dǎo)，SOD在低濃度下被誘導(dǎo)，當(dāng)濃度增加至最大水平時恢復(fù)至空白水平。

(2) PS和BDE-47聯(lián)合暴露21 d后，各聯(lián)合組的CAT和SOD活性隨PS投加濃度升高表現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制的效應(yīng)，且均顯著高于BDE-47單獨暴露組，MDA含量隨PS投加濃度升高表現(xiàn)出誘導(dǎo)效應(yīng)，GST和GPX活性與空白水平相近，低濃度PS暴露組中的GSH含量也有相似的變化規(guī)律。由于微塑料可以調(diào)節(jié)污染物的生物可利用度，加入PS可在一定范圍內(nèi)減緩BDE-47對黑褐新糠蝦抗氧化防御系統(tǒng)的氧化脅迫，此效應(yīng)在低濃度PS聯(lián)合暴露組中更加顯著。