周年，周萍，任琦，趙敏敏,2，劉寧，付輝政

1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004

覆盆子是薔薇科懸鉤子屬植物華東覆盆子Rubus chingii Hu 的干燥未成熟果實(shí)，具有補(bǔ)腎、固精、明目之功效。作為江西省道地藥材，覆盆子在江西省德興市進(jìn)行了規(guī)?；耘啵渲械屡d覆盆子已登記為全國(guó)農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志?，F(xiàn)代藥理研究表明覆盆子具有顯著的抗腫瘤作用，但作用機(jī)制僅局限于體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖［1-2］。中藥作為我國(guó)獨(dú)特的天然藥物寶庫(kù)，國(guó)內(nèi)已有許多文獻(xiàn)報(bào)道如薏苡仁、姜黃等具有抗血管生成作用［3-4］，而覆盆子分離的化合物抗血管生成的作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道?？寡苌煽汕袛嗄[瘤惡性生長(zhǎng)的供養(yǎng)途徑，并阻斷腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的血行通道，有效遏制腫瘤的惡性發(fā)展［5］。腫瘤與血管形成有著密切的關(guān)系，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖是血管形成的關(guān)鍵步驟。本課題組前期采用MTT 法對(duì)覆盆子分離的化合物體外抗腫瘤的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選出抗腫瘤活性較強(qiáng)的化合物覆盆子苷-F3。在此基礎(chǔ)上，以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）作為研究對(duì)象，采用MTT 法篩選出具有明顯差異細(xì)胞毒性的活性化合物，并進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞劃痕、體外血管生成實(shí)驗(yàn)考察其對(duì)HUVECs 遷移能力和血管生成能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI1640 完全培養(yǎng)基（批號(hào)WH01112202SP15，上海語(yǔ)純生物科技有限公司）；噻唑藍(lán)（MTT）（批號(hào)723A051，上海語(yǔ)純生物科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）（批號(hào)BCBN0845V，美國(guó)Sigma 公司）；ECM 專(zhuān)用完全培養(yǎng)基（批號(hào)34356，Sciencell）；重組人源血管內(nèi)皮生產(chǎn)因子（rh-VEGF165）（批號(hào)B211228，北京博爾西科技有限公司）；基質(zhì)膠（批號(hào)BP2107002Z220224，Biozellen）；肝素鈉（批號(hào)605K021，北京索萊寶科技有限公司）；紫杉醇（批號(hào)1534-200001，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；康萊特注射液（批號(hào)2110247-2，浙江康萊特藥業(yè)有限公司）。

1.2 細(xì)胞株

Bel-7402 細(xì)胞來(lái)源于上海語(yǔ)純生物科技有限公司，置RPMI1640 完全培養(yǎng)基（89%RPMI1640 培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗），37 ℃恒溫、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)；HUVECs 來(lái)源于上海語(yǔ)純生物科技有限公司，于ECM 專(zhuān)用完全培養(yǎng)基（88%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑+1%雙抗），37 ℃恒溫、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。分別取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Bel-7402 細(xì)胞，第二代至第五代之間的HUVECs 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 儀器

Multiskan go 酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司）；IC1000 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；XDS-1 倒置顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；BS224S 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；311 型CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.4 MTT 法對(duì)覆盆子分離的化合物體外抗腫瘤活性的篩選

本次研究取華東覆盆子，利用各種色譜方法進(jìn)行分離純化，經(jīng)鑒定后共分離得到17 個(gè)化合物［6］。經(jīng)前期藥效初篩選取覆盆子苷-F3 化合物，經(jīng)連續(xù)2 倍稀釋成6 個(gè)稀釋濃度后備用。以紫杉醇作為陽(yáng)性藥，用培養(yǎng)基配制成0.03 μg/mL。將Bel-7402 細(xì)胞以5×103/孔接種于96 孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h 后，依次吸棄上清液，更換為上述配制的覆盆子苷-F3 化合物溶液，設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，24 h 后吸棄上清液，每孔加入含MTT（終濃度為0.5 mg/mL）的培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h 后，吸棄孔內(nèi)液體，加入150 μL DMSO，孵育1 min，震蕩5 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)490 nm 處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率（細(xì)胞存活率=給藥組A490nm值/對(duì)照組A490nm值的均值×100%）。

1.5 覆盆子苷-F3 化合物對(duì)HUVECs 生物學(xué)行為的影響

1.5.1 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為經(jīng)rh-VEGF165（+）處理和無(wú)rh-VEGF165（-）處理兩類(lèi)，前者以rh-VEGF165（4 ng/mL）與覆盆子苷-F3 同時(shí)加入HUVECs 培養(yǎng)24 h，以rh-VEGF165（4 ng/mL）與ECM 專(zhuān)用完全培養(yǎng)基同時(shí)加入HUVECs 培養(yǎng)24 h作為對(duì)照組；后者除不添加rh-VEGF165 外與前者相同操作分組。覆盆子苷-F3 用ECM 專(zhuān)用完全培養(yǎng)基依次經(jīng)連續(xù)2 倍稀釋成6 個(gè)稀釋濃度。以康萊特注射液作為陽(yáng)性藥，用ECM 專(zhuān)用完全培養(yǎng)基稀釋成10 μg/mL 按照上述操作。將HUVECs 以5×103/孔接種于96 孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h 后，依次吸棄上清液，更換為上述配制的含rh-VEGF165+覆盆子苷-F3 化合物溶液或不含rh-VEGF165+覆盆子苷-F3 化合物溶液進(jìn)行干預(yù)，每個(gè)濃度設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，24 h 后吸棄上清液，每孔加入含MTT（終濃度為0.5 mg/mL）的ECM 專(zhuān)用培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h 后，吸棄孔內(nèi)液體，加入150 μL DMSO，孵育1 min，震蕩5 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)490 nm 處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率（細(xì)胞存活率=給藥組A490nm 值/對(duì)照組A490nm 值的均值×100%）。

1.5.2 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)將HUVECs 以5×104/孔接種于24 孔板上培養(yǎng)，每孔1 mL，待細(xì)胞貼壁融合后吸棄上清液，用200 μL 的槍頭在孔板底部劃出邊緣整齊的“一”字劃痕，然后用磷酸鹽緩沖液清洗1 次后，設(shè)對(duì)照組、低劑量、高劑量組，每組依次加入經(jīng)rh-VEGF165（+）處理的覆盆子苷-F3 化合物溶液（0、5 和 40 μg/mL），并設(shè)置一組陽(yáng)性對(duì)照組（10 μg/mL），分別于0 h 和24 h 用倒置顯微鏡對(duì)細(xì)胞向創(chuàng)面邊緣遷移的情況進(jìn)行拍照。

1.5.3 體外血管生成實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)所用槍頭和96 孔板進(jìn)行-20 ℃提前預(yù)冷，將96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板放置冰上，每孔加入50 μL A 膠后繼續(xù)置于冰上10 min，從冰盒中取出后每孔加入100 μL 冰的C 緩沖溶液，蓋過(guò)之前加入的A 膠，在冰上繼續(xù)反應(yīng)15 min 后，小心吸棄C 緩沖溶液，加入100 μL 含5 μg/mL 的rh-VEGF165 及0.25 mM肝素的HUVECs懸浮液，使得細(xì)胞濃度為2.5×105個(gè)/mL，每孔依次加入覆盆子苷-F3 化合物溶液（0、10 和80 μg/mL），并設(shè)置一組陽(yáng)性對(duì)照組（20 μg/mL），使得每孔內(nèi)液體終體積控制在200 μL 左右，放置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育6 h 之后，取出放置于倒置顯微鏡下觀察血管樣結(jié)構(gòu)的形成狀況，拍照并以血管結(jié)節(jié)為量化指標(biāo)，應(yīng)用Image J軟件血管生成插件對(duì)圖片進(jìn)行量化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)結(jié)果均用GraphPad Prism8 進(jìn)行分析及繪圖，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）的方法對(duì)多樣本間的均數(shù)進(jìn)行比較，所有的統(tǒng)計(jì)結(jié)果均以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 覆盆子苷-F3 對(duì)Bel-7402 細(xì)胞活力的影響

覆盆子苷-F3 化合物對(duì)Bel-7402 細(xì)胞活力有明顯的抑制作用（P＜0.01），并且具有劑量效應(yīng)，其對(duì)Bel-7402 細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（IC50）值為（158.9±20.2）μg/mL。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 覆盆子苷-F3對(duì)Bel-7402細(xì)胞活力的影響

2.2 覆盆子苷-F3 對(duì)HUVECs 活力的影響

覆盆子苷-F3 對(duì)經(jīng)rh-VEGF165 處理的HUVECs活力有明顯的抑制作用，其中抑制效果均強(qiáng)于不經(jīng)rh-VEGF165 處理的HUVECs。此外，陽(yáng)性藥康萊特注射液對(duì)經(jīng)rh-VEGF165 處理的HUVECs 和未經(jīng)rh-VEGF165 處理的HUVECs 活力同樣差異顯著，反映出中藥對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞活力的雙向調(diào)節(jié)作用。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 覆盆子苷-F3對(duì)經(jīng)rh-VEGF165（+）/rh-VEGF165（-）處理的HUVECs活力的影響

2.3 差異細(xì)胞毒性

覆盆子苷-F3 對(duì)Bel-7402 細(xì)胞和HUVECs 有明顯的差異細(xì)胞毒性作用。即在對(duì)腫瘤細(xì)胞亞細(xì)胞毒性濃度下作用于HUVECs 有明顯的增殖抑制作用（P＜0.01）。圖1 數(shù)據(jù)結(jié)果表明：當(dāng)覆盆子苷-F3濃度為76.875 μg/mL 時(shí)，對(duì)Bel-7402 細(xì)胞的活力抑制率為28.73 %。選取對(duì)Bel-7402 細(xì)胞抑制率在20%以下的作用濃度［5,7］，同時(shí)結(jié)合覆盆子苷-F3對(duì)HUVECs 的IC50值，選擇高濃度40 μg/mL 與低濃度5 μg/mL 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 覆盆子苷-F3 對(duì)HUVECs 細(xì)胞遷移的影響

根據(jù)圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)圖片可見(jiàn)，24 h 后對(duì)照組在rh-VEGF165 作用下，創(chuàng)面邊緣明顯消失，并長(zhǎng)滿了HUVECs，而覆盆子苷-F3 明顯對(duì)細(xì)胞遷移起到抑制作用，其中40 μg/mL 組倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變。

圖3 覆盆子苷-F3的細(xì)胞劃痕圖片（×40）

2.5 覆盆子苷-F3 對(duì)HUVECs 抗血管生成的影響

據(jù)圖4、圖5 可知，6 h 后的對(duì)照組與0 h 相比，倒置顯微鏡下形成了密切交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)明顯的血管樣，且交聯(lián)比較致密，血管結(jié)節(jié)數(shù)明顯增多（P＜0.01），證實(shí)成功建立了血管生成體外模型。而覆盆子苷-F3 化合物5 μg/mL 組雖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)還有少許存在，但可見(jiàn)少部分結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)斷裂式，交聯(lián)不夠致密，40 μg/mL 組基本沒(méi)有血管樣結(jié)構(gòu)，血管結(jié)節(jié)數(shù)明顯降低（P＜0.01），其中HUVECs 主要呈單一分散排布的狀態(tài)。該結(jié)果表明覆盆子苷-F3 以劑量依賴(lài)的方式抑制HUVECs血管生成。

圖4 倒置顯微鏡下觀察覆盆子苷-F3對(duì)HUVECs的抗血管生成作用（×100）

圖5 覆盆子苷-F3處理后的血管結(jié)節(jié)數(shù)統(tǒng)計(jì)

3 討論

文獻(xiàn)對(duì)覆盆子的抗腫瘤作用報(bào)道較多集中在對(duì)肝癌的研究［8-9］，本研究以人肝癌細(xì)胞株（Bel-7402細(xì)胞）作為研究對(duì)象，采用MTT 法考察覆盆子分離的化合物覆盆子苷-F3 體外抗腫瘤的活性。從結(jié)果可以看出，經(jīng)濃度為76.875～2 460 μg/mL 的覆盆子苷-F3 處理24 h 后，Bel-7402 細(xì)胞的增殖抑制率顯著上升，并且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性，表明覆盆子苷-F3 對(duì)人肝癌細(xì)胞株Bel-7402 細(xì)胞有明顯的抑制作用。

依據(jù)Miller［10］提出的四項(xiàng)抗血管生成藥物篩選標(biāo)準(zhǔn)之一“差異毒性”（即抗血管生成藥物應(yīng)該是其殺傷或抑制內(nèi)皮細(xì)胞的藥物劑量低于對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性劑量），本研究首先采用MTT 法篩選覆盆子分離的化合物中具有明顯差異細(xì)胞毒性的化合物，然后通過(guò)細(xì)胞劃痕、體外血管生成實(shí)驗(yàn)考察其對(duì)HUVECs 遷移能力和血管生成能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：覆盆子苷-F3 對(duì)Bel-7402 細(xì)胞的IC50值為（158.9±20.2 ）μg/mL，而覆盆子苷-F3 對(duì)HUVECs的IC50值為（34.5±3.6）μg/mL，表明覆盆子苷-F3對(duì)Bel-7402 細(xì)胞和HUVECs 有明顯的差異性細(xì)胞毒性作用。此外在篩選實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)覆盆子苷-F3化合物對(duì)經(jīng)rh-VEGF165 處理的HUVECs 增殖抑制效果均強(qiáng)于不經(jīng)rh-VEGF165 處理的HUVECs。VEGF 被認(rèn)為是作用最直接、特異性最高的一種血管化生長(zhǎng)因子，其中VEGF 165 在體內(nèi)含量最為豐富，促血管化作用最強(qiáng)，這種差異性可能與HUVECs 經(jīng)rh-VEGF165 處理后一定程度上模擬了體內(nèi)腫瘤組織通過(guò)分泌大量VEGF 刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管生成的狀態(tài)有關(guān)［11］，也反映出中藥對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞活力的雙向調(diào)節(jié)作用［12］。同時(shí)，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)方面發(fā)現(xiàn)覆盆子苷-F3 可明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。

盡管血管形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，但是將HUVECs 在含有特定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的基質(zhì)膠上進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞會(huì)快速遷移并排列形成復(fù)雜的網(wǎng)格狀血管結(jié)構(gòu)，可初步模擬體外血管生成。本研究通過(guò)體外血管生成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：覆盆子苷-F3 可以以劑量依賴(lài)的方式抑制HUVECs 血管生成。血管的生成是一個(gè)涉及內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)降解和重塑的復(fù)雜過(guò)程，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖是血管形成的關(guān)鍵步驟。因此我們推測(cè)覆盆子苷-F3 在體外能有效抑制血管生成，其作用機(jī)理可能與抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而達(dá)到抑制血管新生有關(guān)。本研究因覆盆子苷-F3 藥量較少，采用的腫瘤細(xì)胞種類(lèi)較為單一，有待采用較多的腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行全面的研究；同時(shí)抗血管生成作用還需建立體內(nèi)腫瘤血管動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停^察覆盆子苷-F3 對(duì)體內(nèi)腫瘤血管的抑制作用，為臨床抗腫瘤血管生成的應(yīng)用提供參考價(jià)值。