謝利娜,張小雷,陳俊伊

(湖南省腦科醫(yī)院、湖南省第二人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,長(zhǎng)沙 410000)

伴有持續(xù)性單器官或多器官衰竭和(或)局部胰腺并發(fā)癥的急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)稱(chēng)為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)[1]。SAP患者在診斷后的前2周內(nèi)早期死亡的風(fēng)險(xiǎn)很高,總病死率超過(guò)40%[2]。由于對(duì)SAP特異性調(diào)節(jié)機(jī)制缺乏了解,目前對(duì)器官衰竭SAP患者的治療在很大程度上仍然是支持性的[3]。由RETN基因編碼的抵抗素(Resistin)水平升高作為AP患者炎癥的早期標(biāo)志物,與主要局部和全身炎癥反應(yīng)有關(guān)[4]。Resistin會(huì)影響胰腺和胰周內(nèi)臟脂肪組織的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),從而影響AP臨床癥狀的嚴(yán)重程度[5]。然而,在SAP進(jìn)展過(guò)程中,Resistin是否以及如何參與腺泡細(xì)胞凋亡仍未闡明。因此,本研究分析Resistin對(duì)雨蛙素(caerulein,CN)誘導(dǎo)的小鼠SAP模型的影響,并探討其惡化機(jī)制,旨在為SAP臨床管理策略的制定提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

CN、3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)、Td T Frag DNA Fragmentation Imaging試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。用于免疫印跡的一抗:Resistin、P62、GAPDH和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3),均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。淀粉酶檢測(cè)試劑盒和脂肪酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建城生物工程研究所。ECL plus試劑購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。放射免疫沉淀測(cè)定緩沖液購(gòu)自北京Solarbio公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

選取雄性BALB/C小鼠50只,6～8周齡,體重(25±3)g,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。將實(shí)驗(yàn)小鼠關(guān)在籠子里,室溫為26℃,光照/黑暗循環(huán)12 h。給小鼠喂食標(biāo)準(zhǔn)食物制劑并隨意提供水。按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為5組:對(duì)照組、CN組、重組AAV-Resistin(Resistin)＋CN組、AAV-sh-Resistin(sh-Resistin)＋CN組和Resistin＋CN＋3-MA組,每組10只。為了考察AAV-Resistin和AAV-sh-Resistin的體內(nèi)上調(diào)和敲低Resistin的作用,分別通過(guò)尾靜脈注射不同滴度(5×1011GC·m L-1或1.0×1012GC·m L-1)慢病毒載體到小鼠體內(nèi),每個(gè)劑量組5只小鼠。

1.3 重組AAV-Resistin和AAV-sh-Resistin的構(gòu)建

重組AAV-Resistin和AAV-sh-Resistin的構(gòu)建由吉滿(mǎn)生物科技(上海)有限公司完成。Resistin＋CN組、sh-Resistin＋CN組和Resistin＋CN＋3-MA組:通過(guò)尾靜脈將75μL(5×1011GC·m L-1或1.0×1012GC·m L-1)的AVV病毒載體(AAVResistin或AAV-sh-Resistin)注射到小鼠體內(nèi)。在AAV-Resistin或AAV-sh-Resistin給藥7 d后,小鼠表現(xiàn)出足夠的轉(zhuǎn)染。

1.4 SAP模型的建立

注射AVV病毒載體7 h后,雄性小鼠按照標(biāo)準(zhǔn)程序注射CN[6]。除對(duì)照組同期注射PBS外,其他4組以1 h間隔腹膜內(nèi)注射10次CN(100μg·kg-1)誘導(dǎo)CN胰腺炎模型。Resistin＋CN＋3-MA組:在最后1次CN注射后2 h腹膜內(nèi)注射3-MA(20 mg·kg-1)。

1.5 組織學(xué)分析

通過(guò)尾靜脈將表達(dá)Resistin或sh-Resistin的AAV-9載體注射到BALB/C小鼠中,7 d后處死,取胰腺樣本在10%甲醛中固定24 h,石蠟包埋,切片。對(duì)切片進(jìn)行蘇木精和伊紅(HE)染色處理。如前期研究[7],基于4個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行胰腺組織病理學(xué)評(píng)分:水腫(0分,無(wú);1分,小葉間局部增加;2分,彌漫性增加);炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(0分,無(wú);1分,在導(dǎo)管內(nèi)或?qū)Ч苓吘壷車(chē)?2分,在＜50%小葉的實(shí)質(zhì)中;3分,在≥50%小葉的實(shí)質(zhì)中);出血和脂肪壞死(0分,無(wú);1分,1～2個(gè)病灶;2分,3～4個(gè)病灶;3分,＞5個(gè)病灶);腺泡壞死(0分,無(wú);1分,導(dǎo)管周?chē)鷫乃溃?%;2分,5%～20%局灶性壞死;3分,＞20%～50%彌漫性實(shí)質(zhì)壞死)。

1.6 血清淀粉酶和脂肪酶的測(cè)量

小鼠心臟穿刺采血,3000 r·min-1離心10 min收集血清。采用干化學(xué)法測(cè)量血清淀粉酶,和酶比色法檢測(cè)脂肪酶活性。

1.7 TUNEL法測(cè)定細(xì)胞凋亡

將胰腺組織包埋在常規(guī)石蠟中,使用二甲苯脫蠟,并使用梯度乙醇進(jìn)行水合。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū),使用Td T Frag DNA Fragmentation Imaging試劑盒測(cè)定胰腺組織的細(xì)胞凋亡。含有標(biāo)記DNA片段的陽(yáng)性細(xì)胞核中的綠色染色表明核小體間DNA切割。用Eclipse C1熒光顯微鏡(日本Nikon公司)捕獲5個(gè)隨機(jī)非重疊區(qū)域的熒光信號(hào)。所有圖像均通過(guò)Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析。

1.8 透射電子顯微鏡觀察胰腺自噬

將胰腺組織在2%戊二醛緩沖液中切成合適大小(約1 mm×1 mm×1 mm),然后用2%四氧化鋨固定。使用切片機(jī)進(jìn)行超薄切片(70 nm)。通過(guò)透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)觀察切片以確定胰腺腺泡中自噬泡的變化。

1.9 Western Blot檢測(cè)胰腺組織中Resistin表達(dá)

使用放射免疫沉淀測(cè)定緩沖液提取組織中的蛋白質(zhì)。通過(guò)BCA測(cè)定法定量蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量濃度。用1×蛋白上樣緩沖液將蛋白樣品稀釋成1μg·μL-1,并在8%～12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠恒壓90 V電泳30～40 min,轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。然后使用以下針對(duì)指定靶蛋白的一抗在4℃下孵育過(guò)夜:抗Resistin抗體(1∶1000),抗LC3抗體(1∶1000),抗P62抗體(1∶1000)和抗GAPDH抗體(1∶5000)。從一抗孵育液中取出PVDF膜,用1×TBST洗膜液洗滌5 min×3次,再將PVDF膜與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠或抗兔IgG抗體在室溫?fù)u床孵育1 h。最后,用ECL plus試劑觀察印跡。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。進(jìn)行Studentt檢驗(yàn)以分析2個(gè)獨(dú)立組之間的差異,并進(jìn)行單向方差分析和Tukey事后檢驗(yàn)以檢驗(yàn)多組之間的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 AAV-9介導(dǎo)的胰腺組織中Resistin表達(dá)

與對(duì)照組相比,2個(gè)劑量Resistin組胰腺組織中Resistin的表達(dá)升高,2個(gè)劑量sh-Resistin組胰腺組織中Resistin的表達(dá)顯著降低。見(jiàn)圖1。

圖1 免疫印跡檢測(cè)各組小鼠胰腺組織中Resistin表達(dá)

2.2 胰腺組織中Resistin表達(dá)的調(diào)節(jié)可影響CN誘導(dǎo)SAP的嚴(yán)重程度

對(duì)照組未產(chǎn)生任何胰腺炎跡象。組織學(xué)檢查顯示,CN組在CN誘導(dǎo)后胰腺出現(xiàn)組織損傷,其特征是明顯的水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和大量壞死的腺泡細(xì)胞。與CN組相比,Resistin＋CN組的血清淀粉酶、脂肪酶活性,胰腺組織病理學(xué)評(píng)分和TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著增加(P＜0.05);sh-Resistin＋CN組的血清淀粉酶、脂肪酶活性,胰腺組織病理學(xué)評(píng)分和TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著降低(P＜0.05)(圖2、表1)。提示,升高的Resistin可能會(huì)加重CN誘導(dǎo)的SAP的嚴(yán)重程度,而Resistin下調(diào)可能預(yù)防實(shí)驗(yàn)性胰腺炎。

表1 各組血清淀粉酶和脂肪酶、胰腺組織學(xué)評(píng)分和TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比比較 ±s

表1 各組血清淀粉酶和脂肪酶、胰腺組織學(xué)評(píng)分和TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比比較 ±s

*P＜0.001與對(duì)照組相比;＃P＜0.05、△P＜0.01與CN組相比。

組別 n 血清淀粉酶/(U·L-1)血清脂肪酶/(U·L-1)胰腺組織學(xué)評(píng)分/分胰腺組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比/%對(duì) 照 組 10 2 600.44±246.18 110.39±6.74 1.00±0.05 3.24±0.25 CN組 10 8 420.53±374.82* 293.07±17.28* 5.24±0.30* 26.77±1.38*Resistin＋CN組 10 12 768.38±416.59＃ 388.54±21.32＃ 7.12±0.58＃ 37.49±1.83＃sh-Resistin＋CN組 10 4 833.91±376.75△ 197.30±15.17△ 3.08±0.24＃ 15.07±1.15△F 249.150 186.421 53.472 38.749 P ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖2 Resistin的調(diào)節(jié)影響體內(nèi)CN誘導(dǎo)SAP的嚴(yán)重程度

2.3 調(diào)節(jié)Resistin表達(dá)對(duì)CN誘導(dǎo)SAP小鼠自噬影響

與對(duì)照組相比,CN組胰腺組織中P62、LC3Ⅱ水平升高(圖3A、表2)。TEM測(cè)定顯示,與CN組相比,Resistin＋CN組中每個(gè)細(xì)胞質(zhì)區(qū)域的自噬泡百分比顯著增加,sh-Resistin＋CN組的自噬泡百分比顯著降低(圖3B)。Western Blot結(jié)果顯示,Resistin＋CN組胰腺組織中P62、LC3Ⅱ水平較CN組顯著增加,而sh-Resistin＋CN組胰腺組織中P62、LC3Ⅱ水平較CN組顯著降低(圖3A、表2)。因此,Resistin敲低可以通過(guò)減少CN誘導(dǎo)的小鼠中未消化的自噬體的積累來(lái)減輕SAP的嚴(yán)重程度。

表2 各組胰腺組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62水平和自噬泡百分比比較 ±s

表2 各組胰腺組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62水平和自噬泡百分比比較 ±s

*P＜0.05與對(duì)照組相比,**P＜0.01、***P＜0.001;△P＜0.05與CN組相比。

組別 n LC3Ⅱ/LC3Ⅰ P62 自噬泡百分比/%對(duì) 照 組 10 1.00±0.02 1.00±0.03 4.25±0.37 CN組 10 2.53±0.22* 5.02±0.44** 21.42±1.25***Resistin＋CN組 10 4.67±0.15△ 6.54±0.42△ 32.70±1.92△sh-Resistin＋CN組 10 1.08±0.05△ 2.20±0.04△ 13.28±0.95△F 22.407 29.642 33.560 P ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖3 調(diào)節(jié)Resistin表達(dá)對(duì)CN誘導(dǎo)SAP小鼠自噬影響

2.4 抑制自噬起始可減輕Resistin過(guò)表達(dá)加重SAP嚴(yán)重程度

在用CN＋Resistin處理的小鼠中,施用3-MA能夠減少胰腺水腫、炎癥和壞死(圖4A)。與Resistin＋CN組相比,Resistin＋CN＋3-MA組小鼠的胰腺組織學(xué)評(píng)分以及胰腺組織中P62、LC3Ⅱ水平和自噬泡百分比均顯著降低(P＜0.05)(圖4、表3)。

圖4 抑制自噬起始可減輕Resistin過(guò)表達(dá)加重SAP嚴(yán)重程度

表3 2組胰腺組織學(xué)評(píng)分、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和自噬泡百分比比較 ±s

表3 2組胰腺組織學(xué)評(píng)分、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和自噬泡百分比比較 ±s

*P＜0.05、**P＜0.01與Resistin＋CN組相比。

組別 n 胰腺組織學(xué)評(píng)分 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ P62 自噬泡百分比/%Resistin＋CN組 10 7.04±0.62 1.00±0.02 1.00±0.03 33.51±1.83 Resistin＋CN＋3-MA組 10 3.08±0.24** 0.68±0.07* 0.71±0.08* 15.23±0.97**t 4.742 3.581 3.279 5.071 P 0.008 0.018 0.024 0.001

3 討論

SAP臨床治療效果通常不理想,主要?dú)w因于其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。Resistin已在正常和異常免疫反應(yīng)、炎癥和癌癥條件下的免疫系統(tǒng)中得到廣泛研究[8]。有研究[4,9]發(fā)現(xiàn),急性和慢性胰腺炎患者的Resistin表達(dá)水平高于健康對(duì)照組。本研究對(duì)Resistin在小鼠SAP模型中的惡化機(jī)制進(jìn)行探索,并選擇AAV-9介導(dǎo)胰腺組織中Resistin表達(dá)。在AAV血清型中,AAV-9在體內(nèi)表現(xiàn)出更有效的胰腺遞送,介導(dǎo)長(zhǎng)期轉(zhuǎn)基因表達(dá)而沒(méi)有免疫反應(yīng)[10]。本研究結(jié)果顯示,AAV-9介導(dǎo)的Resistin遞送至胰腺中是有效的,并且Resistin上調(diào)加重了CN誘導(dǎo)的SAP的嚴(yán)重程度,而Resistin抑制則減輕了SAP的嚴(yán)重程度;Resistin敲低可以通過(guò)減少CN誘導(dǎo)的小鼠中未消化的自噬體的積累來(lái)減輕SAP的嚴(yán)重程度。

自噬是主要的分解代謝過(guò)程,細(xì)胞通過(guò)該過(guò)程去除受損、壞死或不需要的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)來(lái)延長(zhǎng)壽命,并回收這些成分以滿(mǎn)足能量和生物需求[11]。在自噬過(guò)程中,自噬體通過(guò)包裹降解材料形成,然后轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體,導(dǎo)致自噬溶酶體的形成,其中細(xì)胞器通過(guò)酶水解、消化和降解進(jìn)行更新[12]。LC3是自噬體形成和自噬囊泡的必需蛋白,是自噬膜的通用標(biāo)志物。LC3有兩種形式,Ⅰ型和Ⅱ型;LC3Ⅱ位于細(xì)胞內(nèi)自噬體的膜上,其含量與自噬泡的數(shù)量成正比[13]。P62作為一種自噬體蛋白,在選擇性自噬中起作用以靶向和降解其他蛋白質(zhì),并參與多種細(xì)胞過(guò)程的調(diào)節(jié),包括自噬和氧化應(yīng)激[13]。在正常生理?xiàng)l件下,自噬通量沒(méi)有自噬囊泡堆積。自噬體的積累可以通過(guò)自噬形成或溶酶體融合障礙增加,并會(huì)導(dǎo)致溶酶體降解障礙。P62被自噬特異性降解,在正常生理?xiàng)l件下保持低水平。因此,P62的過(guò)度積累和自噬泡的形成(尤其是LC3Ⅱ)是自噬受損的標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)Resistin增加P62、LC3Ⅱ水平,并促進(jìn)自噬體的形成,這些自噬體由于無(wú)法完成對(duì)SAP損傷的反應(yīng)而積累;另一方面,Resistin的沉默抑制了自噬的啟動(dòng),進(jìn)而減少自噬體形成。

胰腺炎動(dòng)物模型研究[14]表明,自噬受損主要是由溶酶體功能障礙引起的。胰腺炎患者可見(jiàn)大量空泡和胰蛋白酶原在腺泡細(xì)胞中聚集;胰蛋白酶原被激活以誘導(dǎo)SAP的發(fā)展[15]。受損的自噬可通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)SAP,如線粒體損傷、P62積累、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和ROS釋放,從而促進(jìn)酶原活化、腺泡細(xì)胞分泌異常、細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)[16]。為了進(jìn)一步證實(shí)自噬在Resistin影響胰腺損傷中的作用,本研究采用自噬抑制劑3-MA抑制自噬的發(fā)生。有研究[17]已證實(shí),3-MA在體外減少了由膽囊收縮素刺激胰腺腺泡細(xì)胞引起的受損自噬囊泡的形成。本研究中,3-MA的施用改善了Resistin對(duì)CN誘導(dǎo)的SAP嚴(yán)重程度影響,并降低了胰腺組織中P62、LC3Ⅱ水平和自噬泡。表明Resistin可能通過(guò)削弱自噬通量來(lái)加重SAP的嚴(yán)重程度,而自噬通量可以通過(guò)使用自噬體形成抑制劑來(lái)減輕。因此,由于功能失調(diào)的自噬通量與早期胰腺炎癥密切相關(guān),Resistin在自噬體形成中的誘導(dǎo)作用有望成為SAP治療的新靶點(diǎn)。

綜上,本研究揭示了Resistin通過(guò)誘導(dǎo)自噬受損在SAP發(fā)展中發(fā)揮重要作用。這些發(fā)現(xiàn)為Resistin觸發(fā)信號(hào)作為胰腺炎有希望的靶向治療提供了新的見(jiàn)解。