孫智輝,徐仲秋,董 麗,畢 闖,王惠琳,韓新文,李志帥,李 麗

(青島濱海學(xué)院附屬醫(yī)院(青島軍民融合醫(yī)院)a.口腔科;b.病理科;c.神經(jīng)外科;d.康復(fù)科,青島 266400)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(鱗癌)是最常見(jiàn)的口腔頜面部的惡性腫瘤[1]?？谇击[癌具有很高的局部復(fù)發(fā)率,早期進(jìn)展后具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期肺、肝轉(zhuǎn)移的趨勢(shì),常常累及骨骼和其他器官,而腫瘤轉(zhuǎn)移是最主要的患者死亡原因[2],JAK/STAT3信號(hào)通路是口腔鱗癌進(jìn)展的重要激活信號(hào)通路之一[3],其激活與下調(diào)對(duì)口腔鱗癌進(jìn)展具有重要作用,微生物代謝產(chǎn)物是否影響癌細(xì)胞增殖、遷移及其關(guān)鍵信號(hào)通路是目前的研究熱點(diǎn)[3]。

乳桿菌是常見(jiàn)的益生菌[4],其對(duì)乳清蛋白具有分解作用,而乳清蛋白被分解后產(chǎn)物具有促進(jìn)腫瘤凋亡的作用。乳桿菌A-2在以乳清蛋白為主要成分的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)和降解,可以獲得具有潛在腫瘤抑制作用的乳桿菌代謝物[5]。目前研究[6]證明,乳桿菌及其代謝產(chǎn)物具有抗感染、抗氧化、甚至降低腫瘤發(fā)病的作用,并能調(diào)控細(xì)胞周期,影響細(xì)胞凋亡和分化。乳桿菌在分解不同種類培養(yǎng)基時(shí)會(huì)產(chǎn)生不同種類的代謝物[7]。經(jīng)由復(fù)原乳清培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí),乳桿菌代謝產(chǎn)物L(fēng)SPM1包含有乳酸、有機(jī)酸、乙醛、胞外多糖(EPS)、胞外多聚糖、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)和羅依氏素等[8],本文通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探究LSPM1對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞Cal-27增殖、凋亡和遷移的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

乳桿菌A-2由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院微生物生態(tài)工程技術(shù)研究中心保藏;人舌鱗癌細(xì)胞Cal-27購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)研究所細(xì)胞中心;胎牛血清(10100)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;乳桿菌A-2培養(yǎng)基(MRS)由青島濱海學(xué)院附屬醫(yī)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室配置;復(fù)原乳清培養(yǎng)基由實(shí)驗(yàn)室配置;細(xì)胞培養(yǎng)使用的高糖DMEM培養(yǎng)基(11054001)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;MTT甲臜干粉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(M2003);JAK/STAT3信號(hào)通路抑制劑AG-490(Tyrphostin B42)購(gòu)自美國(guó)GLPBIO公司;JAK2抗體、p-JAK2抗體、STAT3抗體和p-STAT3抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(C1062L)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 MRS培養(yǎng)基的配制

大豆蛋白胨10 g,牛肉粉10 g,酵母粉5 g,葡萄糖20 g,吐溫80 m L,磷酸氫二鉀2 g,無(wú)水乙酸鈉5 g,檸檬酸三銨2 g,硫酸鎂200 mg,硫酸錳50 mg,若為固體培養(yǎng)基,添加瓊脂粉15 g。加水至1 L,p H 6.0～6.5,121℃滅菌15 min。

1.3 復(fù)原乳清培養(yǎng)基的配制

乳清粉50 g,碳酸鈣20 g,加水至1 L。121℃滅菌15 min。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 LSPM1制備及細(xì)胞培養(yǎng)

乳桿菌A-2經(jīng)過(guò)MRS培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)3代后,使用生理鹽水懸浮菌體細(xì)胞,制備細(xì)菌懸液,并接種于復(fù)原乳清培養(yǎng)基中,40℃、120 r·min-1震蕩培養(yǎng)48 h,待培養(yǎng)基渾濁之后4000 r·min-1離心10 min,取上清液,經(jīng)真空、冷凍、干燥后獲得凍干粉,即為代謝產(chǎn)物L(fēng)SPM1,實(shí)驗(yàn)中使用PBS稀釋后使用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后加入細(xì)胞培養(yǎng)基中,使其終質(zhì)量濃度為30 mg·m L-1。人舌鱗癌細(xì)胞Cal-27培養(yǎng)使用DMEM高糖培養(yǎng)基加10%胎牛血清,在5%CO2、37℃培養(yǎng)環(huán)境下恒溫培養(yǎng)。

1.4.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

采用MTT法檢測(cè)LSPM1對(duì)Cal-27細(xì)胞增殖及JAK/STAT3信號(hào)通路的影響。鏡下觀察細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí),使用0.25%胰蛋白酶在37℃消化10 min,離心重懸后將細(xì)胞按照1×104的密度接種于96孔板中,37℃培養(yǎng)24 h后待細(xì)胞貼壁,分組并加樣:Blank組(空白對(duì)照)、LSPM1組(加入LSPM1凍干粉稀釋液,終濃度30 mg·m L-1)、AG-490組(加入JAK/STAT3信號(hào)通路抑制劑AG-490)和LSPM1＋AG-490組(同時(shí)加入LSPM1和AG-490)。分別在加樣后6、24、36、48、72 h加入配置好的MTT溶液(5 mg·m L-1),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清,向96孔板中每孔加入150μL DMSO,在搖床上低速震蕩10 min,使紫色結(jié)晶溶解,在酶標(biāo)儀檢測(cè)490 n M吸光值,計(jì)算細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)增殖率。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)LSPM1對(duì)Cal-27細(xì)胞凋亡及JAK/STAT3信號(hào)通路的影響。當(dāng)細(xì)胞處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí),使用0.25%胰蛋白酶在37℃對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化10 min,后將細(xì)胞按照1×105密度接種于6孔板中培養(yǎng)24 h待細(xì)胞完全貼壁,分組并加樣:Blank組(空白對(duì)照)、LSPM1組(加入LSPM1凍干粉稀釋液)、AG-490組(加入JAK/STAT3信號(hào)通路抑制劑AG-490)和LSPM1＋AG-490組(同時(shí)加入LSPM1和AG-490)。繼續(xù)培養(yǎng)36 h后,消化重懸后1100 r·min-1離心收集細(xì)胞,加入PBS重懸細(xì)胞,離心后置于2 m L離心管中加入事先在冰上預(yù)冷的70%乙醇固定,冰上靜置1 h后每管加入1 m L PBS洗滌重懸,加入Annexin-V-FITC/PI染料進(jìn)行染色,在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移

采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分析終濃度30 mg·m L-1的LSPM1對(duì)Cal-27細(xì)胞遷移及JAK/STAT3信號(hào)通路的影響。將生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞按照1×105密度接種于6孔板中培養(yǎng),培養(yǎng)24 h細(xì)胞完全貼壁后使用200μL槍頭在6孔板底面平行劃線3條,間隔約0.5 cm,在劃線后進(jìn)行換液,洗去懸浮的細(xì)胞,培養(yǎng)6 h后分組并加樣:Blank組(空白對(duì)照)、LSPM1組(加入LSPM1凍干粉稀釋液,終濃度30 mg·m L-1)、AG-490組(加入JAK/STAT3信號(hào)通路抑制劑AG-490)和LSPM1＋AG-490組(同時(shí)加入LSPM1和AG-490)。分別在培養(yǎng)0、12、24、36、48 h時(shí)顯微鏡鏡下觀察,拍照后使用image J軟件進(jìn)行面積統(tǒng)計(jì),計(jì)算細(xì)胞劃痕縮小面積,分析細(xì)胞遷移能力。

1.4.5 蛋白提取和Western blot分析

設(shè)置Blank組、LSPM1組、AG-490組和LSPM1＋AG-490組4組,細(xì)胞培養(yǎng)36 h后,加入細(xì)胞裂解液RIPA、PMSF 100∶1冰上裂解30 min,4℃12 000 r·min-1離心后保留上清,并使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量,將細(xì)胞上清液100℃高溫煮沸,各組等量蛋白50μg加入預(yù)先配置好的SDSPAGE凝膠中電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上;使用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;加入抗JAK2及磷酸化JAK2、STAT3及磷酸化STAT3一抗,4℃過(guò)夜孵育,使用TBST清洗后加標(biāo)記HRP的二抗,室溫孵育1 h,清洗后于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光拍照,并用Image J軟件統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 LSPM1通過(guò)JAK/STAT3信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖

與Blank組相比,加入LSPM1后細(xì)胞增殖受到明顯抑制:24、36、48、72 h細(xì)胞增殖率LSPM1組分 別 為0.68±0.03、0.70±0.03、0.77±0.02、0.81±0.03,Blank組 分 別 為0.72±0.03、0.83±0.03、0.87±0.02、0.93±0.04,各觀察時(shí)點(diǎn)LSPM1組細(xì)胞增殖率均明顯低于Blank組(P＜0.05或P＜0.01)。加入AG-490后,LSPM1對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用減弱;72 h內(nèi)AG-490組和LSPM1＋AG-490組細(xì)胞增殖率與Blank組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 LSPM1和AG-490對(duì)細(xì)胞增殖的影響

2.2 LSPM1通過(guò)JAK/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡

加入終濃度30 mg·m L-1LSPM1培養(yǎng)36 h后,Blank組細(xì)胞凋亡率為0.11±0.01,LSPM1組細(xì)胞凋亡率為0.21±0.01,LSPM1組與Blank組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);在加入AG-490后,LSMP1對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用下降,LSPM1＋AG-490組與Blank組細(xì)胞凋亡率相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 LSPM1和AG-490對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

2.3 LSPM1通過(guò)JAK/STAT3信號(hào)通路抑制細(xì)胞遷移

分別在細(xì)胞劃痕0、12、24、36、48 h時(shí)使用顯微鏡觀察并拍照記錄6孔板上的劃痕變化,結(jié)果見(jiàn)圖3:LSPM1組48 h內(nèi)劃痕面積縮小2.3×104個(gè)單位,Blank組劃痕面積縮小4.2×104個(gè)單位,AG-490組48 h內(nèi)劃痕面積縮小3.3×104個(gè)單位,LSPM1＋AG-490組48 h內(nèi)劃痕面積縮小3.2×104個(gè)單位,LSPM1組與Blank組劃痕面積比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);LSPM1＋AG-490組與AG-490組劃痕面積比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 LSPM1通過(guò)JAK/STAT3信號(hào)通路抑制細(xì)胞遷移

2.4 LSPM1提高JAK/STAT3信號(hào)通路活性

Western Blot結(jié)果顯示JAK/STAT3信號(hào)通路的2個(gè)關(guān)鍵蛋白JAK2和STAT3及其磷酸化蛋白(p-JAK2蛋白、p-STAT3蛋白)在加入LSPM1后表達(dá)量上升;Blank組、LSPM1組、AG-490組、LSPM1＋AG-490組JAK蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.00、1.62、0.20、0.60;p-JAK2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.00、1.66、0.30、0.60;STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.00、1.22、0.09、0.12;p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.00、1.17、0.07、0.10。LSPM1組四種蛋白表達(dá)均高于Blank組、AG-490組和LSPM1＋AG-490組(P＜0.05),表明LSPM1可以促進(jìn)JAK/STAT3信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白JAK2和STAT3磷酸化并發(fā)揮功能,當(dāng)加入通路抑制劑AG-490后LSPM1對(duì)STAT蛋白和JAK2蛋白表達(dá)和磷酸化作用下降。見(jiàn)圖4。

圖4 LSPM1提高JAK/STAT3信號(hào)通路活性和蛋白表達(dá)

3 討論

口腔鱗癌作為常見(jiàn)的癌癥種類具有高轉(zhuǎn)移性和低治愈率的特點(diǎn)[8],多年來(lái)其治療方法與用藥處于研究熱點(diǎn)。乳桿菌廣泛存在于動(dòng)植物發(fā)酵產(chǎn)品中,其培養(yǎng)代謝物種類根據(jù)不同的培養(yǎng)環(huán)境具有不同的功能成分[9],且具有抗腫瘤、抗氧化的作用。乳桿菌A-2在40℃環(huán)境下分解乳清蛋白后得到代謝產(chǎn)物L(fēng)SMP1,其成分主要包含特定比例的乳酸、有機(jī)酸、乙醛等物質(zhì)[10],根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道[11],這些產(chǎn)物對(duì)腫瘤進(jìn)展具有遏制作用,具有潛在的抗癌潛能。在本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)[11]中,經(jīng)MRS培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)乳桿菌獲得其穩(wěn)定代謝產(chǎn)物L(fēng)SPM1,在提取菌液OD值在分光光度計(jì)600 nm檢測(cè)值為1時(shí)進(jìn)行離心提取并進(jìn)行Ca2＋離子濃度測(cè)定,使用鄰苯二甲本法(OPA)對(duì)產(chǎn)物中游離氨基和酸性可溶性多肽含量進(jìn)行測(cè)定,通過(guò)不斷改進(jìn)和優(yōu)化試驗(yàn)方案和技術(shù),目前實(shí)驗(yàn)中使用的LSPM1產(chǎn)物組分穩(wěn)定:Ca2＋離子2.28 mg·m L-1、游離氨基0.091 mg·m L-1和酸性可溶性多肽0.016 mg·m L-1。相對(duì)穩(wěn)定和確定的LSPM1成分保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性并有利于檢測(cè)產(chǎn)物具體功能。本文驗(yàn)證了乳桿菌代謝物L(fēng)SMP1在人舌鱗癌細(xì)胞Cal-27的增殖、遷移和凋亡中的作用,并研究了LSMP1與口腔鱗癌相關(guān)通路JAK/STAT3信號(hào)通路的關(guān)系。JAK/STAT3信號(hào)通路在多種癌癥進(jìn)程中被激活[12],且在細(xì)胞增殖、凋亡等多種生物學(xué)功能中發(fā)揮作用,目前已有相關(guān)報(bào)道[13]顯示JAK/STAT3信號(hào)通路在口腔鱗癌進(jìn)展中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示,LSMP1可以在終濃度為30 mg·m L-1時(shí)顯著促進(jìn)Cal-27細(xì)胞凋亡,并抑制細(xì)胞增殖和遷移,且此過(guò)程與JAK/STAT3信號(hào)通路密切相關(guān)。當(dāng)加入AG-490抑制JAK/STAT3信號(hào)通路表達(dá)時(shí),LSMP1對(duì)Cal-27細(xì)胞的增殖、遷移功能調(diào)控能力下降,且JAK/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白JAK2和STAT3的激活或磷酸化進(jìn)程受到LSMP1的影響,加入30 mg·m L-1LSPM1可以顯著提升JAK2蛋白和STAT3蛋白的表達(dá)和磷酸化[14-15]。本研究探索了乳桿菌A-2代謝物L(fēng)SMP1在腫瘤治療領(lǐng)域的潛在價(jià)值,為日后口腔鱗癌的治療提供了研究方向。