馬麗娜·阿新拜,毛麗旦·阿扎提,陳 陽,庫麗夏西·馬尼,梅拉·哈萬,阿依巴爾申·努爾拉提,蘭 衛(wèi)

(1.新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院a.中西醫(yī)結合系;b.實驗中心;c.中藥系,烏魯木齊 830000;2.新疆阿勒泰地區(qū)哈薩克醫(yī)醫(yī)院哈藥藥房,新疆 阿勒泰 836300)

代謝綜合征(metabolic syndrome,MS)是一組相互關聯(lián)的復雜的臨床征候群,包括肥胖、高血壓、血脂異常及高血糖等,進而可誘發(fā)心腦血管事件[1]。內臟肥胖和(或)胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是MS的核心。IR是MS發(fā)生、發(fā)展的中樞環(huán)節(jié),是其病理關鍵[2],IR水平與早期慢性系統(tǒng)性炎癥有關[3-4],相互影響的信號通路是其重要基礎環(huán)節(jié),這些通路主要包括胰島素信號通路和炎性信號通路[5]。MS的發(fā)病率在世界范圍內快速增長,并有年輕化的趨勢[6]。我國近幾年的MS患病率在19.58%～33.9%[7]。

G蛋白偶聯(lián)受體5(Takeda G-protein-coupled receptor 5,TGR5),也稱為GPBAR1或GPR131,是一種位于細胞膜的模式識別受體,隨著配體激活TGR5受體,體內多種信號通路啟動,從而誘導多種生物學效應。TGR5受體的重要影響作用體現(xiàn)在抗炎、免疫系統(tǒng)調節(jié)、葡萄糖代謝等方面[8],有望成為藥物靶點。多個動物模型研究[9-10]證實,激動TGR5還能使MS癥狀改善,包括非酒精性脂肪性肝病、肥胖和2型糖尿病。

柯孜木克顆粒由沙生蠟菊、黑果越桔、木賊組成,屬于民間常用經驗方。有研究[11-12]顯示,柯孜木克顆粒對小鼠急慢性炎癥有明顯的抗炎作用,其機制可能與抑制內源性介質PGE2及5-羥色胺的釋放有關。本研究通過MS模型大鼠,探討柯孜木克顆粒的抗炎作用和機制,為柯孜木克顆粒改善MS提供理論依據。

1 材料

1.1 實驗動物

普通級SD雄性大鼠,周齡為6～8周,體重(180±20)g,總數29只,由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供[動物許可證號:SYXK(新)2018-0003]。

1.2 藥物和試劑

柯孜木克顆粒(沙生蠟菊384 g、黑果越桔115 g、木賊192 g)由新疆阿勒泰地區(qū)哈醫(yī)醫(yī)院哈藥藥房制備。鹽酸二甲雙胍(北京索萊寶科技有限公司公司,批號:404I021)。高鹽高脂高糖飼料(江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司提供,由0.5%膽鹽、2%膽固醇、5%食用鹽、10%果糖、10%蛋黃粉、10%熟豬油、10%奶粉、52.5%基礎飼料組成)。Anti-GPCR TGR5抗體(艾博抗(上海)貿易有限公司,批號:ab72608),SP超敏免疫組織化學試劑盒(兔SP試劑盒)(北京中杉金橋生物技術有限公司,批號:SP9001),腫 瘤 壞 死 因 子-α(TNF-α)及 白 介 素-6(IL-6)的ELISA試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

2 方法

2.1 MS大鼠模型建立

高鹽高脂高糖飼料喂養(yǎng)SD大鼠8周(第1周適應性喂養(yǎng)),環(huán)境溫度約19～24℃,濕度保持在60%～70%,自由飲水,光照時間為12 h,明暗交替。

2.2 分組及給藥

將實驗大鼠按隨機數字表法分為正常組(n＝6)、模型組(n＝3)、用藥組[柯孜木克顆粒低劑量組(n＝6)、柯孜木克顆粒中劑量組(n＝5)、柯孜木克顆粒高劑量組(n＝5)和二甲雙胍組(n＝4)]。正常組喂養(yǎng)普通飼料8周,其余各組飼以高鹽高脂高糖飼料8周;8周后柯孜木克顆粒低劑量組給予柯孜木克顆粒17.6 mg·kg-1·d-1(按人和動物體表面積折算的等效劑量比值表計算)、柯孜木克顆粒中劑量組給予35.19 mg·kg-1·d-1、柯孜木克顆粒高劑量組給予70.38 mg·kg-1·d-1,二甲雙胍組予鹽酸二甲雙胍懸濁液3 mg·kg-1·d-1,正常組和模型組以生理鹽水灌胃,劑量為10 m L·kg-1·d-1。以上灌胃均為1次·d-1,連續(xù)給藥4周。用藥期間,各組大鼠繼續(xù)飼予原有飼料,整個實驗過程動物自由飲水。

2.3 取材

最后一次給藥后12 h禁食不禁水,使用10%水合氯醛溶液(0.3 m L·100 g-1)腹腔麻醉,從腹主動脈取血5 m L,靜置1 h,然后4℃、3000 r·min-1離心15 min,取上層血清備用。切取距離肝臟最大葉邊緣處1.0 cm的肝組織,大小約為0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm,于4%多聚甲醛溶液放置備用。剩余的最大葉肝組織切成若干塊,大小約為0.5 cm3,置于凍存管,-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 ELISA法測定動脈血TNF-α、IL-6水平

依照ELISA試劑盒說明書測定大鼠血清TNF-α、IL-6水平。

2.5 SP法免疫組織化學檢測肝臟組織TGR5蛋白的表達

取肝臟組織標本,石蠟包埋,切片。常規(guī)脫蠟水化,行抗原修復后,加入Anti-GPCR TGR5一抗(ab72608)(購自英國abcam公司,工作濃度為1∶200),再加入二抗,進行DAB染色,顯微鏡下觀察。后取切片置于顯微鏡下觀察并拍照,采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析。1)校正圖片光密度,將incident level中默認的255改為220;2)選色使用HSI模式,選擇H:0～30,S:0～255,I:0～230;3)設置分析環(huán)境,測量參數選擇面積、平均光密度值、累積光密度值;4)保存分析環(huán)境后用irregular工具畫出測量區(qū)域,測量該區(qū)域的面積、累積光密度值,平均光密度值＝累積光密度值/面積。

2.6 HE染色觀察肝組織病理形態(tài)學變化

將多聚甲醛溶液中保存的肝組織,脫水透明后石蠟包埋,采用石蠟切片機進行切片,厚度約為4μm,脫蠟后進行HE染色,將切片放入蘇木精(hematoxylin,H)水溶液中,先染色數分鐘,分色及脫水后,再用酒精伊紅(eosin,E)染色液染色,時長為2～3 min,染色后脫水透明,后用中性樹膠50μL進行封片,光學顯微鏡下觀察。

2.7 統(tǒng)計學方法

應用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行數據處理,計量資料用均數±標準差(±s)表示,采用單因素方差分析(one-way ANOVA),以LSD法進行多重比較,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠血清TNF-α及IL-6水平比較

與模型組相比,柯孜木克顆粒低、中、高劑量組血清TNF-α水平均降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);二甲雙胍組血清TNF-α水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

與模型組相比,柯孜木克顆粒低、中、高劑量組和二甲雙胍組血清IL-6水平差異均無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清TNF-α及IL-6水平±s,ng·m L-1

表1 各組大鼠血清TNF-α及IL-6水平±s,ng·m L-1

△P＜0.05與正常組比較,*P＜0.05與模型組比較。

組別 n TNF-α IL-6正 常 組 6 0.63±0.01 0.36±0.03模型組 3 0.67±0.02△ 0.41±0.02△二甲雙胍組 4 0.63±0.03 0.39±0.04柯孜木克顆粒低劑量組 6 0.57±0.07* 0.38±0.06柯孜木克顆粒中劑量組 5 0.60±0.06* 0.39±0.01柯孜木克顆粒高劑量組 5 0.56±0.04* 0.39±0.03 F 8.559 9.198 P 0.019 0.363

3.2 各組大鼠肝臟組織病理形態(tài)學表現(xiàn)

正常組大鼠的肝組織為正常的形態(tài)學表現(xiàn),特點為肝小葉結構完整、清晰,肝細胞索排列整齊,未見腫脹及炎性細胞浸潤;模型組肝小葉結構不清,肝細胞疏松、腫脹、排列紊亂,肝脂肪變明顯,炎性細胞浸潤;柯孜木克顆粒低劑量組肝小葉稍加完整,肝細胞腫脹程度減輕,炎性細胞浸潤減少,脂肪泡減少;柯孜木克顆粒中劑量組大鼠肝小葉結構明顯改善,肝細胞腫脹程度減輕;柯孜木克顆粒高劑量組鼠肝小葉結構更清晰、完整,肝細胞索更整齊,肝細胞無明顯腫脹;二甲雙胍組介于模型組與柯孜木克顆粒組之間,脂肪變性少見。見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理學表現(xiàn)(HE,×200)

3.3 各組大鼠肝臟組織TGR5蛋白的表達情況

與正常組相比,模型組平均光密度值降低(P＜0.05);與模型組相比,柯孜木克顆粒低、中、高劑量組及二甲雙胍組平均光密度值均升高(均P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肝臟組織TGR5蛋白陽性表達的平均光密度值比較 ±s

表2 各組大鼠肝臟組織TGR5蛋白陽性表達的平均光密度值比較 ±s

△P＜0.05與正常組比較,*P＜0.05與模型組比較。

組別 n TGR5正常組 6 186.24±0.35模型組 3 180.83±4.37△二甲雙胍組 4 184.55±0.98*柯孜木克顆粒低劑量組 6 185.85±1.14*柯孜木克顆粒中劑量組 5 186.11±0.93*柯孜木克顆粒高劑量組 5 186.19±2.31*F 8.199 P 0.133

4 討論

MS表現(xiàn)為一系列代謝異常,包括高血壓、腹部或中心性肥胖、IR、高血糖和導致動脈粥樣硬化的血脂異常(低水平的高密度脂蛋白膽固醇和高水平的血清甘油三酯)[13]。MS主要由遺傳因素和后天因素決定,同時還包括家族史、缺乏運動、糖尿病史、脂肪肝、不健康的飲食習慣、酗酒和吸煙等危險因素[14-15]。近20年的研究表明,MS是一種慢性炎癥性疾病[16]。炎癥既是MS發(fā)生的原因之一,又是MS發(fā)展的關鍵機制之一,同時炎癥介質也被視為IR發(fā)生不可或缺的因素,因此,IR和炎癥反應是MS復雜機制的關鍵環(huán)節(jié)。近年來人們日常生活更加便利和舒適,但隨之而來的生活方式的改變導致許多疾病的高發(fā),其中MS的高發(fā)影響人類健康和社會經濟,未來針對MS的慢性炎癥的治療策略有望得到發(fā)展。

4.1 MS與TNF-α、IL-6

聯(lián)結肥胖、IR、糖尿病、動脈粥樣硬化及MS的節(jié)點之一是脂肪細胞分泌的TNF-α、IL-6等炎性因子。有研究[17-18]證實,TNF-α、IL-6等炎性因子與IR密切相關,它們在誘發(fā)炎癥反應的同時,會共同誘導IR的發(fā)生,并且隨著IR的出現(xiàn),TNF-α、IL-6等水平也升高。TNF-α作為一種多功能的促炎細胞因子,可調節(jié)多種炎癥過程,是MS最普遍的特征之一,可誘導細胞和組織中的IR[19]。IL-6水平升高參與了炎癥、IR和β細胞功能障礙的發(fā)生,IL-6能抑制胰島素信號傳導,影響細胞核受體mRNA的表達,從而抑制脂、糖代謝酶的基因轉錄,黏附分子的釋放增加,糖原合成減少,胰島素敏感降低,最終導致IR[20]。

SAID等[21]以高果糖飲食誘導的MS大鼠為模型,發(fā)現(xiàn)spexin(一種多向性功能肽)通過抑制其TNF-a和IL-6,有效減輕MS,并具有預防MS的能力,提出spexin是一種治療MS的新型有前途的療法。周艷霞等[22]以高脂高糖高膽固醇飼料飼養(yǎng)制備MS大鼠模型,以桑生地黃湯進行干預,發(fā)現(xiàn)其能降低大鼠血清TNF-a和IL-6水平,使微炎癥反應改善從而減輕IR。本實驗同樣證實,MS模型組大鼠血清TNF-a和IL-6促炎細胞因子水平升高,說明MS大鼠出現(xiàn)全身炎癥反應。加用柯孜木克顆粒治療4周后,低、中、高劑量組大鼠血清TNF-α水平均顯著降低,與上述文獻[21-22]報道一致。此外柯孜木克顆粒低、中、高劑量組IL-6水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義,可見相對于IL-6促炎細胞因子,柯孜木克顆粒在抑制MS模型大鼠TNF-α水平方面有更加顯著的效果,進而改善炎癥狀態(tài),有利于MS的防治。BǎLǎ?OIU等[23]發(fā)現(xiàn),通過對TNF-α和IL-6等炎性因子的炎癥狀態(tài)的早期監(jiān)測,有利于對MS及其并發(fā)癥做到及早的發(fā)現(xiàn)并進行干預。TNF-a不僅能使胰島素受體信號通路減少,還能使脂肪細胞中葡萄糖轉運體-4減弱,抑制脂聯(lián)素[19]。由此可見,預防MS發(fā)生、發(fā)展可從抑制TNF-α的產生進行干預。

4.2 MS與TGR5

TGR5是首個被確認與漿膜結合的G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體[24],其結構典型并且作用模式具有代表性,可以通過多種途徑介導信號傳導,從而將信號從細胞外傳導至細胞內,進而引起下游級聯(lián)反應[25]。激活TGR5,一方面能使機體炎癥反應被抑制,進而使MS改善;另一方面,在動物模型中,TGR5激動劑還可改善肥胖、2型糖尿病及非酒精性脂肪肝性病這些MS組分的癥狀[26]。本實驗中,與正常組相比,MS模型組大鼠肝臟組織TGR5平均光密度值下降顯著,說明TGR5在MS模型大鼠中表達下調。分別以柯孜木克顆?；蚨纂p胍治療4周后,柯孜木克顆粒低、中、高劑量組及二甲雙胍組平均光密度值均顯著升高,即4組大鼠的肝臟組織TGR5蛋白表達均上調,發(fā)揮抑制炎癥反應的作用,與文獻[10,27]報道一致。KEITEL等[27]發(fā)現(xiàn),INT-777通過激活肝臟Kupffer細胞TGR5,進而上調c AMP水平,使TNF-α、l L-6、IL-1β等促炎細胞因子表達水平明顯下降。POLS等[10]的研究中,INT-777特異性激活TGR5后,以c AMP依賴性方式,使巨噬細胞中NF-κB的轉錄活性受到抑制,使TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細胞因子表達水平降低。

TGR5 KO小鼠高脂飲食后會誘發(fā)脂肪肝,使模型小鼠血漿三酰甘油水平升高[28],相反,TGR5激動劑使血漿三酰甘油水平降低[29],能使小鼠胰島素的敏感性改善,但是對TGR5缺陷小鼠的胰島素敏感性無改善作用[30]。TGR5的激活不僅能抑制炎性反應,保護機體免于肥胖和IR,改善MS,還能通過改善IR,調節(jié)肝臟脂質代謝,從而改善MS的肝脂肪變性。本實驗HE染色結果顯示,與模型組相比,柯孜木克顆粒組大鼠肝組織肝小葉結構改善,肝細胞腫脹程度減輕,炎性細胞浸潤減少,脂肪泡減少,說明柯孜木克顆粒在一定程度上具有改善MS大鼠肝組織病變程度的作用。

4.3 MS的治療

MS治療的最佳方法是生活方式的調整和改變,但是患者很難長期堅持,因此,目前西醫(yī)治療MS的方法仍以藥物為主,包括減肥藥物、胰島素增敏劑、他汀類藥物等,但是其不良反應也不容忽視。中醫(yī)藥治療MS的優(yōu)勢日益凸顯,也被廣泛接受和認同,其中包括一些少數民族民間常用經驗方?？伦文究祟w粒中沙生蠟菊為新疆民間特色藥材,具有抗炎、利尿、促進膽汁分泌等作用。有研究[31]表明沙生蠟菊的活性化合物芹菜素可以調控多種細胞信號通路,從而抑制TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎細胞因子的產生,改善肝臟炎性病變,減輕IR。黑果越桔盛產于新疆,具有解毒、利尿的作用[32]。TAKIKAWA等[33]研究發(fā)現(xiàn)黑果越桔可使胰島素敏感性增強,使肝臟中AMP-活化蛋白激酶激活,并使脂質減少,改善IR。KARLSEN等[34]研究發(fā)現(xiàn)黑果越桔可使血漿中IL-6等炎性因子水平降低,具有調節(jié)炎癥過程的作用。木賊又名接骨草,具有疏風散熱、解肌、退翳的作用。有研究[35]表明,在非酒精性脂肪肝病模型大鼠中,木賊能減輕大鼠肝細胞炎癥反應,修復受損肝功能。并且木賊萃取物能下調血脂,調節(jié)脂質代謝紊亂,阻止高脂引發(fā)的內皮細胞炎癥反應[36]。

本實驗利用高鹽高脂高糖飼料飼養(yǎng)制備MS模型大鼠,SP法免疫組織化學結果顯示模型組大鼠肝臟組織TGR5蛋白表達較正常組明顯降低,ELISA測定結果顯示模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平較正常組升高。加用柯孜木克顆粒及二甲雙胍干預后,TGR5蛋白表達的平均光密度值較模型組升高,柯孜木克顆粒低、中、高劑量組血清TNF-α水平較模型組降低,說明柯孜木克顆粒能夠上調具有抑制炎癥反應作用的TGR5的表達,使TNF-α等炎癥因子水平降低,改善炎癥狀態(tài)及肝組織病變程度,從而對MS具有防治作用。以后將加大樣本量、增加用藥療程,以進一步探究柯孜木克顆粒的治療機制。