熊永強(qiáng) ,李江偉 ,李韌 ,黃娜 ,鞏妮 ,張澍

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院:1.干部病房普通外科;2.科研中心實(shí)驗(yàn)室,陜西西安 710004)

肝硬化是各種慢性肝損傷機(jī)制導(dǎo)致的炎癥壞死、纖維化及假小葉形成[1-2],其原因多種多樣,如肝炎病毒感染、自身免疫性肝病、酒精性或非酒精性脂肪肝病[3],其特點(diǎn)是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成和降解不平衡,導(dǎo)致明顯的ECM 沉積[4]。肝硬化最終可能發(fā)展成肝衰竭和肝癌,這極大地影響患者的生存和生活質(zhì)量[5]。肝硬化中藥復(fù)方治療可基本分為經(jīng)典方、現(xiàn)代名家名方和自擬方。中藥復(fù)方治療體現(xiàn)了病證結(jié)合的辨證思想,針對肝硬化病因、分期、并發(fā)癥、特有臨床指標(biāo)辨證施治,在改善臨床癥狀、阻止及預(yù)防和治療并發(fā)癥方面有顯著優(yōu)勢。相關(guān)研究證明,益氣解毒通絡(luò)方(YQJDTLF)可明顯緩解臨床癥狀,療效顯著。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法確定YQJDTLF 治療肝硬化的潛在機(jī)制,以助于肝硬化藥物的篩選,改進(jìn)YQJDTLF的劑型,并為探索其他中藥的治療機(jī)制提供有益的可能參考。

1 材料與方法

1.1 YQJDTLF的活性化合物和相應(yīng)潛在治療靶點(diǎn)的篩選

應(yīng)用TCMSP[Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform(tcmsp-e.com)]篩選YQJDTLF 的活性化合物和相應(yīng)的潛在治療靶點(diǎn)[6]。在TCMSP 中檢索YQJDTLF中相對生物利用度(OB)≥30%、藥物相似度(DL)≥0.18被設(shè)置為活性化合物和相應(yīng)的潛在治療靶點(diǎn)篩選的閾值。

1.2 肝硬化相關(guān)治療靶點(diǎn)的篩選

肝硬化相關(guān)靶點(diǎn)篩選通過搜索如下數(shù)據(jù)庫進(jìn)行,如Drugbank(https://go.drugbank.com/structures/search/small_molecule_drugs/structure)[7]、OMIM(https://omim.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)[8]、DisGeNET(https://www.disgenet.org/)[9]、GeneCard(http://www.genecards.org)[10],檢索名詞為肝硬化。刪除重復(fù)的靶點(diǎn)基因以獲得最終的疾病靶點(diǎn)合集。

1.3 YQJDTLF 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將檢索獲得的YQJDTLF 相關(guān)靶點(diǎn)和肝硬化相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行維恩圖分析,找出交叉的目標(biāo),然后用Cytoscape(Cytoscape_v3.8.2)構(gòu)建藥物-化合物-靶點(diǎn)基因圖網(wǎng)絡(luò)[11]。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)代表YQJDTLF 中的活性化合物和靶點(diǎn),網(wǎng)絡(luò)中的邊代表每個(gè)節(jié)點(diǎn)的關(guān)系,每條邊的數(shù)量被定義為“度”。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建主要是通過交叉靶點(diǎn)上傳至String 在線數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)生成的[12]。所需的最低交互分?jǐn)?shù)設(shè)置為“中等置信度=0.9”,而其他參數(shù)保持默認(rèn),然后將生成的PPI網(wǎng)絡(luò)加載到Cytoscape。進(jìn)一步利用CytoCNA 的內(nèi)置模塊生成主要目標(biāo)網(wǎng)絡(luò),當(dāng)介數(shù)、接近度、度/連通性、特征向量、基于局部平均連通性的方法和每個(gè)節(jié)點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)都大于中位數(shù)時(shí),通過拓?fù)浞治錾珊诵哪繕?biāo)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 基因本體論(GO)生物學(xué)功能富集及基因組百科全書(KEGG)通路分析

使用Metascape(http://metascape.org/)進(jìn)行了GO 和KEGG 的通路富集分析,以P-Value 值(P≤0.01)為篩選條件,GO 分析依據(jù)相關(guān)性選用靠前的10位生物學(xué)過程(biological process,BP)、前10位分子功能(molecular function,MF),將KEGG的前20條富集途徑在氣泡圖中可視化,氣泡的大小代表在指定途徑中富集的目標(biāo)數(shù)量,氣泡的顏色代表富集的P值,富集分析的KEGG通路以及相應(yīng)的化合物和靶標(biāo)隨后被加載到Cytoscape軟件中,通過單獨(dú)調(diào)整繪圖,生成了一個(gè)可視化的化合物-目標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)。

1.5 分子對接

從PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)下載PPI網(wǎng)絡(luò)中相互作用核心蛋白的3D 結(jié)構(gòu),并從PubChem數(shù)據(jù)庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)及ZINC數(shù)據(jù)庫(http://zinc.docking.org)下載活性小分子的3D結(jié)構(gòu)。應(yīng)用AutoDock Tools 1.5.6對獲取的小分子及蛋白3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行去水、加氫、計(jì)算電荷等處理后,導(dǎo)入到AutoDock Vina進(jìn)行對接,計(jì)算出藥物活性成分與靶蛋白相結(jié)合所需的最低結(jié)合效能,通過Rx64 4.1.3將核心蛋白及小分子結(jié)合能繪制熱圖,再利用Pymol2.1.1將對接所獲得的相互作用結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 主要化學(xué)成分及靶點(diǎn)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查找YQJDTLF 的所有成分,根據(jù)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)篩選出其中口服OB≥30%且DL≥0.18的潛在活性成分及相應(yīng)靶點(diǎn),YQJDTLF的活性化合物93個(gè),相應(yīng)潛在治療靶點(diǎn)1 460 個(gè)(表1)。將“肝硬化”置于Drugbank、OMIM、TTD、DisGe NET、GeneCard搜索,經(jīng)過篩選最終獲得總共1 266個(gè)肝硬化相關(guān)靶點(diǎn)基因,中藥成分-潛在靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖由Cytoscape構(gòu)建(圖1)。

圖1 YQJDTLF-中藥成分-潛在靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Yiqi Jiedu Tongluo Recipe-Traditional Chinese Medicine Ingredients-Potential Target Gene Network Map

表1 YQJDTLF的中藥成分和相應(yīng)的潛在治療靶點(diǎn)數(shù)目Tab.1 The number of Chinese herbal components and corresponding potential therapeutic targets of Yiqi Jiedu Tongluo Recipe

2.2 藥物-化合物-靶點(diǎn)基因圖網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

得到Y(jié)QJDTLF和肝硬化相關(guān)的潛在靶點(diǎn)后,通過維恩圖確定相交的靶點(diǎn),得到Y(jié)QJDTLF與肝硬化交集靶點(diǎn)共135個(gè)(圖2)。根據(jù)化合物中靶點(diǎn)基因數(shù)目篩選活性化合物,篩選出前10位活性化合物(表2)。

表2 YQJDTLF的中藥化合物相關(guān)靶點(diǎn)Tab.2 Targets related to traditional Chinese medicine compounds in Yiqi Jiedu Tongluo Recipe

續(xù)表2

圖2 YQJDTLF與肝硬化的交集靶點(diǎn)維恩圖Fig.2 Venn diagram of intersection target of Yiqi Jiedu Tongluo Recipe and liver cirrhosis

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵成分和靶點(diǎn)分析

由String 數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/)構(gòu)建的蛋白PPI網(wǎng)絡(luò),生成主要目標(biāo)網(wǎng)絡(luò),截?cái)嘀翟O(shè)置如下:節(jié)點(diǎn)=135,邊=697,度數(shù)中位數(shù)=10.3,PPI網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)愈大、顏色愈深,此節(jié)點(diǎn)蛋白與其他節(jié)點(diǎn)蛋白的作用關(guān)系就越多,重要性就越強(qiáng)(圖3)。將YQJDTLF與肝硬化的核心靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Cytoscape,生成相應(yīng)的網(wǎng)狀圖,進(jìn)一步利用CytoCNA 內(nèi)置模塊生成主要目標(biāo)網(wǎng)絡(luò),并通過拓?fù)浞治?得到核心網(wǎng)絡(luò)。利用MOCDE 插件篩選出10個(gè)藥物治療疾病的核心靶點(diǎn),包括腫瘤蛋白p53(TP53)、AKT1、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、白介素6(IL6)、腫瘤壞死因子(TNF)、絲裂原激活蛋白激酶3(MAPK3)、MAPK8、胱天蛋白酶3(CASP3)、JUN、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT 3)。

圖3 YQJDTLF與肝硬化交叉靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Protein-protein interaction (PPI) network of crosstargets between Yiqi Jiedu Tongluo Recipe and liver cirrhosis

2.4 核心靶點(diǎn)GO 生物學(xué)功能及KEGG 通路富集分析結(jié)果

將YQJDTLF治療肝硬化的135個(gè)核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫,得到富集的通路與核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖4),說明YQJDTLF是通過多條通路與多個(gè)靶點(diǎn)相互配合,共同起到治療肝硬化的目的。以P＜0.01為篩選條件,GO 分析獲得813條生物過程(BP)主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡpromoter)、基因表達(dá)的正向調(diào)控(positive regulation of gene expression)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)等,79條細(xì)胞組成(CC)主要涉及胞質(zhì)溶膠(cytosol)、細(xì)胞核(nucleus)、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)、核質(zhì)(nucleoplasm),127條分子功能(MF)主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)相同的蛋白質(zhì)結(jié)合(identical protein binding)、酶結(jié)合(enzyme binding)、蛋白激酶結(jié)合(protein kinase binding)等,各選取前10條信息如圖5A(圖中的Count值代表與此條目相關(guān)的靶點(diǎn)基因的數(shù)量,Count值愈大,代表相關(guān)的靶點(diǎn)基因數(shù)量愈多)。以P＜0.01為篩選條件,KEGG 富集分析獲得135條信號通路,選擇前20條KEGG 通路并以氣泡圖方式呈現(xiàn),氣泡的大小代表在指定途徑中富集的目標(biāo)數(shù)量,氣泡的顏色代表富集的P值。富集程度較高的代謝通路為pathways in cancer、fluid shear stress and atherosclerosis、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、proteoglycans in cancer、TNF signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway等(圖5B)。

圖4 YQJDTLF治療肝硬化的135個(gè)核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫獲得的富集通路與核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Enrichment pathway-core target network diagram

圖5 YQJDTLF治療肝硬化的核心靶點(diǎn)GO 分析(A)和KEGG 分析(B)的結(jié)果Fig.5 The results of GO analysis(A)and KEGG analysis(B)of the core targets of Yiqi Jiedu Tongluo Recipe in the treatment of liver cirrhosis

2.5 分子對接結(jié)果

為了明確YQJDTLF治療肝硬化的內(nèi)在分子機(jī)制,選取PPI網(wǎng)絡(luò)中的10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)作為受體,選擇篩選的活性化合物作為配體。當(dāng)配體與受體結(jié)合能量越低時(shí),其結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定,相互作用的可能性越大。分子對接中最低化學(xué)結(jié)合能小于0 kJ/mol時(shí)可以在自然狀態(tài)下對接,最低化學(xué)結(jié)合能小于＜-5 kJ/mol時(shí),對接結(jié)果良好。從分子對接熱力圖可看出關(guān)鍵基因與有效成分對接后,CASP3、STAT3與活性化合物結(jié)合能處于0～5 kJ/mol,其余靶點(diǎn)與活性化合物最低化學(xué)結(jié)合能小于＜-5 kJ/mol(圖6),提示有效成分有可能成為先導(dǎo)藥物,為藥物的設(shè)計(jì)開發(fā)提供思路。利用Pymol 軟件將結(jié)合能較低的相關(guān)靶點(diǎn)蛋白與有效成分的蛋白對接模式進(jìn)行可視化結(jié)果(圖7) 。

圖6 活性成分與潛在靶點(diǎn)對接結(jié)果熱圖Fig.6 Heat map of the docking results of active ingredients and potential targets

圖7 核心靶點(diǎn)分別與其結(jié)合能最低活性化合物生成的對接模式圖Fig.7 The docking pattern of the core target and its lowest binding energy compound

3 討 論

2007年HOPKINS[13]首次明確網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)概念。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用可解決中藥現(xiàn)代化遇到的困難,揭示潛在的機(jī)制。北京東直門醫(yī)院徐光福教授[14]自擬YQJDTLF 治療肝硬化患者,取得滿意效果。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)明確YQJDTLF 對于肝硬化的治療的相關(guān)可能機(jī)制,為今后研究中藥配方治療肝硬化的具體機(jī)制提供了參考。本研究使用TCMSP、GeneCard、KEGG、TTD、DrugBank和Dis-GeNET 明確藥物相關(guān)基因可能是YQJDTLF 改善肝硬化的關(guān)鍵靶點(diǎn),然后生成化合物-靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò),并通過使用Cytoscape和String數(shù)據(jù)庫確定核心靶點(diǎn),對核心靶點(diǎn)的GO 和KEGG 富集分析顯示,介導(dǎo)的pathways in cancer、fluid shear stress and atherosclerosis等相關(guān)信號通路是最富集的通路。

研究顯示,槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、黃芩素(baicalein)、小紅參醌丙(trijuganone B)、異鼠李素(isorhamnetin)、豆甾醇(stigmasterol)是YQJDTLF治療肝硬化的主要活性化合物。槲皮素屬于黃酮醇家族,具有抗氧化、抗炎、保護(hù)心臟和抗肥胖的作用[15],參與調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT 和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2/c-Jun N 端激酶/絲裂原活化蛋白激酶(ERK-1/2/JNK/MAPK)信號通路[16],以及通過調(diào)控細(xì)胞色素C參與凋亡途徑[17]。黃芩素是一種從黃芩根中提取的黃酮類化合物,可誘導(dǎo)人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞(Hep G2)凋亡,黃芩素可能是急性肝細(xì)胞凋亡或損傷的治療候選藥物[18-20]。槲皮素和黃芩素還顯示出體外抗纖維化活性,可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的結(jié)節(jié)形成[21-22]。木犀草素能增加了肝臟基質(zhì)金屬蛋白酶-9的水平和金屬硫蛋白(MT)Ⅰ/Ⅱ的表達(dá),可消除纖維蛋白沉積物,促進(jìn)纖維化肝組織中的ECM 降解和增強(qiáng)肝再生能力來治療肝纖維化[23]。異鼠李素可以抑制TGF-β1表達(dá),從而影響TGF-β1/Smad3 及TGF-β1/p38 MAPK 通路的活化,緩解氧化應(yīng)激從而起到抗纖維化的作用[24-25]。而越來越多的研究證實(shí),線粒體激活的蛋白激酶(MAPK)下游信號在肝硬化病程中起著重要的作用[26]。Smads、ERK/MAPK、PI3K/AKT、NF-κB、PPAR 等信號通路是肝硬化發(fā)生發(fā)展過程中細(xì)胞因子發(fā)揮作用的重要信號通路。

通過cytoscape軟件拓?fù)浞治龅贸鯵QJDTLF治療肝硬化的核心靶點(diǎn)基因有TP53、AKT1、VEGFA、IL6、TNF、MAPK3、MAPK8、CASP3、JUN、STAT 3。TNFα參與TNF受體相關(guān)因子(TRAF)2、受體相互作用蛋白-1、絲裂原活化蛋白(MAP)激酶、c-Jun-N末端激酶(JNK)、核因子κB(NFκB)通路的調(diào)控[27],而TNF/TNFR1 復(fù)合物可以引起caspase-8 的激活[28],caspase-8可激活如caspase-3的下游效應(yīng)子,從而誘發(fā)凋亡細(xì)胞死亡[29-30],這些通路對肝損傷、肝硬化進(jìn)展起著一定的作用。蛋白激酶(AKT)是PI3K 信號通路的主要下游點(diǎn),AKT1通過IKKα激活NF-κB 參與多種促炎反應(yīng)作用的共同通路,從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)介導(dǎo)肝硬化的發(fā)生[31-33]。

GO 富集分析主要集中在凋亡過程的負(fù)調(diào)控、藥物敏感性、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖的正調(diào)節(jié)等。肝細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的肝細(xì)胞死亡是肝硬化演變過程中炎癥和肝星狀細(xì)胞活化的主要觸發(fā)因素[34-35],靶點(diǎn)基因參與凋亡過程中的負(fù)調(diào)控有利于肝硬化的治療。病毒性肝炎是肝硬化疾病進(jìn)展諸多因素中的最主要因素之一。乙型肝炎病毒能引起免疫應(yīng)答導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷及炎癥壞死,肝細(xì)胞進(jìn)入“炎性壞死與再生修復(fù)”的循環(huán)中,部分患者最終發(fā)展為肝硬化[36-38],炎癥反應(yīng)調(diào)控對于改善肝硬化結(jié)局是有益的。KEGG 分析得出YQJDTLF通過pathways in cancer、TNF signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway 等通路在肝硬化的治療中發(fā)揮作用。pathways in cancer是富集程度最高的通路。通路靶點(diǎn)圖可以看出該復(fù)方主要通過干預(yù)關(guān)鍵靶點(diǎn)的上下游基因,而發(fā)揮對pathways in cancer中的ERK signaling、TGF-βsignaling pathway、calcium signaling、nuclear receptor signaling、cell cycle G1/S 等信號通路的間接調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn),肝硬化的發(fā)生和發(fā)展與Raf/MEK/ERK信號通路有密切的關(guān)系,若抑制該通路的活性,可起到抑制星狀細(xì)胞肝的增殖、促進(jìn)其凋亡的作用[39-40]。TGF-β是生理(傷口愈合)和病理纖維發(fā)生的主要調(diào)節(jié)因子[41]。本研究結(jié)果表明,該中藥復(fù)方通過調(diào)控AR 參與androgen receptor signaling pathway,可能起到干預(yù)肝硬化進(jìn)一步進(jìn)展的作用。THOLE 等[42]報(bào)道,使用甾體或非甾體抗雄激素可能會(huì)導(dǎo)致肝硬化,表明雄激素/AR信號可能會(huì)阻止肝硬化的進(jìn)展。在小鼠模型研究中,WU 等[43]證明AR 在促進(jìn)HBV復(fù)制和肝炎中起關(guān)鍵作用,其發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞中AR的敲除導(dǎo)致HBV復(fù)制減少。雄激素/AR信號抑制脂肪變性的發(fā)展,也可能抑制肝硬化的發(fā)展。在非癌性肝病的研究中,肝病AR敲除小鼠模型顯示雄激素/AR信號可以抑制脂肪變性、病毒相關(guān)肝炎和肝硬化的發(fā)展。

通過對核心靶點(diǎn)對關(guān)鍵靶點(diǎn)和關(guān)鍵中藥成分進(jìn)行分子對接研究,除了CASP3、STAT 3與活性化合物結(jié)合能處于0～5 kJ/mol,其他對接復(fù)合物的最低結(jié)合能都小于-5.0 kJ/mol,其中IL6 與豆甾醇結(jié)合能為-11.1 kJ/mol。一般認(rèn)為,結(jié)合能小于-4.25 kJ/mol、-5.0 kJ/mol或-7.0 kJ/mol分別表示配體和受體之間的特定、良好或強(qiáng)的結(jié)合活性[44],表明這些中藥成分都能夠較好地結(jié)合到關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的活性位點(diǎn)中。

綜上所述,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接的方法學(xué),通過對YQJDTLF 中的化學(xué)活性成分的生物學(xué)功能通路富集分析,闡明了其通過腫瘤相關(guān)通路等生物學(xué)過程,參與治療肝硬化過程的分子機(jī)制。并通過分子對接初步驗(yàn)證了化學(xué)活性成分與肝硬化疾病靶點(diǎn)的相互作用模式。而目前的研究工作主要來自生物信息學(xué)分析,未來可采用體外和體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究為后續(xù)的研究奠定了思路基礎(chǔ)。