戚 瑛 ,趙芯儀 ,姚佳輝 ,謝文俊 ,張伊

(1.西安交通大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系,陜西西安 710061;2.西安交通大學生命科學與技術學院,陜西西安 710049)

在心肌細胞內,由動作電位或其他原因引起的細胞內游離鈣濃度([Ca2+]i)周期性起伏波動,以一定的節(jié)律在細胞質中進行信息傳遞,稱為鈣振蕩[1-2],它是維持心肌細胞興奮功能的關鍵因素。結合目前眾多研究者對成年大鼠心肌細胞內鈣振蕩的研究,推測鈣振蕩的產生可能與肌漿網上的兩種通道蛋白——1,4,5-三磷酸肌醇受體(1,4,5-trisphosphate receptor,IP3R)和雷諾丁受體(ryanodine receptor,Ry R)密切相關[3-7]。它們通過調節(jié)肌漿網的鈣釋放來調節(jié)細胞內局部鈣離子濃度,影響鈣信號傳導,從而調節(jié)心肌細胞的生理狀態(tài)。但相比成年大鼠心肌細胞鈣振蕩研究工作的普遍與深入,對新生大鼠心肌細胞鈣振蕩的研究工作相對較少[8-9]?；诔赡昱c新生哺乳動物心肌細胞結構的差異,在未完全發(fā)育的新生大鼠心肌細胞內,IP3Rs與Ry Rs通道對鈣振蕩信號的調控作用及影響機制目前仍不清楚。

本研究以原代分離、體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞模型為基礎,使用IP3Rs與RyRs通道的激動劑phenylephrine、caffeine及阻斷劑2-APB、tetracaine改變通道活性,通過鈣離子熒光探針fura-2 在熒光顯微鏡上實時成像觀察心肌細胞內鈣振蕩的發(fā)生頻率及幅度,研究IP3Rs與RyRs通道對細胞質鈣振蕩信號的影響;同時記錄phenylephrine對不同培養(yǎng)時期新生大鼠心肌細胞內鈣瞬變信號的影響,探究哺乳動物心臟發(fā)育過程中IP3R通道對鈣振蕩的調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

出生后24 h 內的清潔級SD(Sprague-Dawley)大鼠,雌雄不限,由西安交通大學實驗動物中心提供。

1.2 主要藥物與試劑

高糖DMEM(dulbecco’s minimum essential medium)培養(yǎng)基(GIBCO),新生牛血清(杭州四季青公司),10 000 U/m L 青鏈霉素混合液(Solarbio),Ⅱ型膠原酶(GIBCO),5-溴-2-脫氧核苷(Sigma),Fura-2/AM(AAT),caffeine(RyRs激動劑,Sigma),2-APB(IP3Rs抑制劑,Sigma),tetracaine(Ry Rs 抑制劑,Sigma),phenylephrine(PE,IP3Rs激動劑,Santa),Pluronic f127(AAT)。

1.3 新生SD大鼠心肌細胞的分離、純化、培養(yǎng)及實驗分組

無菌條件下剖胸取出新生大鼠心臟,用含雙抗的磷酸緩沖液沖洗去殘血,剪成1 mm3大小的組織塊,用0.2%膠原酶在37℃水浴下梯度消化(每5 min收集一次細胞),直至組織團塊消失。收集消化液1 000 r/min離心5 min,將所得細胞置于含200 mL/L胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中,在37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)1 h,采用差速貼壁法去掉成纖維細胞。在新的培養(yǎng)皿中加入潔凈無菌的蓋玻片(0.17 mm 厚度,用于在熒光顯微鏡上進行鈣成像),將差速貼壁后的細胞懸液滴到蓋玻片上,靜置2 h使細胞貼壁并爬片,然后向培養(yǎng)皿中加入適量培養(yǎng)液,并加入5-溴-2-脫氧核苷(5-Brd U)以抑制非心肌細胞的生長,繼續(xù)培養(yǎng)至指定的時間用于鈣成像實驗。

為研究IP3Rs和RyRs對新生大鼠心肌細胞鈣振蕩的影響,細胞在培養(yǎng)3 d后,利用不同藥物刺激并分別與對照組(Control)進行比較(包括Controlvs.PE、Controlvs.2-APB、Controlvs.Caffeine、Controlvs.Tetracaine)。為探究IP3Rs對不同培養(yǎng)時間新生大鼠心肌細胞內鈣振蕩的影響,細胞分別培養(yǎng)3 d、7 d、10 d后,檢測PE刺激引起的胞內鈣振蕩頻率的變化(3 dvs.7 dvs.10 d)。

1.4 心肌細胞內鈣離子濃度的測量

本研究使用奧林巴斯熒光倒置顯微鏡CKX53來實時監(jiān)測細胞鈣信號,成像物鏡為20×,0.75 NA的空氣鏡,光源為功率300 W 的氙燈,能通過光柵發(fā)出穩(wěn)定的單色光,熒光信號由EM-CCD 采集。成像實驗的環(huán)境溫度通過空調系統(tǒng)維持在25℃左右,成像臺式液(Tyrode solution)預先放置在該環(huán)境下,使溫度與環(huán)境一致。

向待測量的細胞中加入終濃度為4μmol/L Fura-2/AM 與0.1%Pluronic F127,37℃避光條件下孵育30 min,而后用成像液沖洗3遍,將鋪種細胞的蓋玻片固定在成像皿并放置在顯微鏡載物臺上,選取一個細胞數量較多且鋪展成片的視野,用波長340 nm 和380 nm 紫外光交替激發(fā),采集510～530 nm 波段熒光信號成像,圖像采集頻率為10 幀/s,采集時間持續(xù)2 min。

圖像用Simple PCI軟件進行分析處理。同一盤(即一片蓋玻片)的細胞鈣振蕩頻率一致,取其中所有細胞的幅度均值和該頻率值,作為這盤細胞的幅度和頻率。

1.5 統(tǒng)計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示。每個數據點代表一盤細胞,每組包含9～12盤細胞,來自至少3批獨立的原代細胞分離。用GraphPad Prism 7.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析。多組均數比較采用單因素方差分析及Bonferroni多重比較檢驗,兩組間比較采用非配對t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 新生大鼠心肌細胞模型的建立

利用細胞計數控制每盤的細胞接種數量在2×105/m L。視野中未貼壁的心肌細胞數量大量減少,背景干凈,貼壁的心肌細胞密度適中,伸出偽足相互接觸而聚集成同步搏動的心肌細胞單層,活力狀態(tài)良好(圖1)。

2.2 IP3 R 通道抑制劑2-APB 與激動劑Phenylephrine作用后,心肌細胞鈣振蕩信號的測量結果

培養(yǎng)3 d的心肌細胞在熒光倒置顯微鏡下進行實時鈣成像。圖2展示了對照組(control)和IP3R 通道抑制劑10μmol/L 2-APB 處理組的鈣振蕩特征。圖2A 為各組同一視野的3個典型細胞的鈣振蕩曲線,這些細胞保持了同步鈣振蕩。經過對鈣信號處理和統(tǒng)計分析后,如圖2B 所示,與Control組相比,經2-APB作用后,細胞鈣振蕩信號頻率下降(P＜0.05),但幅度并沒有明顯變化。圖3 展示了control組和IP3R通道激動劑10μmol/L PE 處理組的鈣振蕩特征。圖3A 為各組同一視野的3個典型細胞的鈣振蕩曲線,這些細胞保持較好的同步性,跳動頻率一致。應用10μmol/L PE作用后,細胞的鈣振蕩信號頻率上升(P＜0.001),而鈣振蕩幅度雖有上升趨勢,但無統(tǒng)計學差異(圖3B)。

圖3 IP3 R 通道激動劑PE對新生大鼠心肌細胞鈣振蕩的影響Fig.3 Effect of IP3 Rs agonist PE on Ca2+oscillations in NRCMs

2.3 RyR 通道抑制劑tetracaine與激動劑caffeine作用后心肌細胞鈣振蕩信號的測量結果

培養(yǎng)3 d的心肌細胞,經100μmol/L tetracaine作用后,細胞原本節(jié)律性的鈣振蕩完全被抑制,沒有信號(圖4A、4B);經500μmol/L caffeine作用后,細胞的鈣振蕩信號頻率有所上升,但同一視野中不同細胞的鈣振蕩信號同步性被打亂,鈣信號頻率不再保持一致(圖4C、4D)。

圖4 RyR 通道活性改變對新生大鼠心肌細胞鈣振蕩信號的影響Fig.4 Effects of altered RyRs activities on Ca2+oscillations in NRCMs

2.4 IP3R 通道對鈣信號的調控作用隨時間變化情況的統(tǒng)計結果

用IP3R的激動劑PE分別對培養(yǎng)3 d、7 d及10 d的細胞進行處理,并分別統(tǒng)計其頻率變化的倍數。作為IP3R 的激動劑,PE 能夠增強IP3R 的活力,增加鈣振蕩的頻率,但被激動后的心肌細胞鈣振蕩的頻率上升倍數隨培養(yǎng)時間的增加而呈下降趨勢,并且培養(yǎng)7 d及10 d的細胞鈣振蕩頻率變化倍數與3 d的相比,其下降具有統(tǒng)計學意義(圖5)。

圖5 PE對不同培養(yǎng)時間的心肌細胞鈣振蕩信號頻率的影響Fig.5 Effect of PE stimulation on NRCMs cultured for different time

3 討 論

鈣離子作為細胞內的第二信使,調節(jié)著許多生物學功能。心肌細胞內的鈣離子以反復瞬變的方式在細胞質中的節(jié)律性傳遞稱為鈣振蕩,是心臟維持收縮-舒張功能的關鍵性過程[2,10]。相比于對成年哺乳動物心肌細胞內鈣信號研究的普遍與深入,對新生及發(fā)育期心肌細胞中鈣振蕩的相關研究工作還較為欠缺,其具體的調節(jié)機制仍是本領域尚待探討的問題之一[11-12]。

心肌細胞內鈣離子主要來自于肌漿網的鈣釋放,IP3Rs與Ry Rs作為心肌細胞內肌漿網上的兩種主要的鈣離子釋放通道,對鈣信號的調控方式卻并不完全相同[13]。在成年的心肌細胞中,IP3Rs通道所占比例降低[7,14],因此其對鈣信號的調控作用將下降,在新生期的心肌細胞中,IP3Rs通道占比較大,IP3Rs與Ry Rs如何協(xié)調肌漿網的鈣釋放一直是未解的問題之一[7,11]。本研究發(fā)現,對培養(yǎng)3 d的新生大鼠心肌細胞,加入IP3Rs通道的抑制劑2-APB 或者激動劑PE,心肌細胞內鈣振蕩的幅度并無明顯變化,而加入Ry Rs通道的抑制劑tetracaine能夠將細胞的鈣振蕩信號完全抑制。這些結果表明,在新生期的心肌細胞中,盡管IP3Rs的占比遠高于成年期,但Ry Rs通道仍是肌漿網鈣離子釋放的主要通道。

心臟的節(jié)律性舒縮由構成心臟的全體心肌細胞的協(xié)調一致的鈣振蕩和隨之而來的搏動所控制[2]。成年心臟中,由竇房結發(fā)放沖動傳導到不同部位的心肌細胞,使細胞膜去極化,膜上內陷的橫管系統(tǒng)上分布的L-型鈣離子通道開放,少量外鈣內流,與Ry Rs結合,從而激活該通道,使肌漿網內的鈣離子大量釋放,這就是經典的“鈣致鈣釋放機制”[2,10]。而在新生期的心肌細胞中,缺乏橫管系統(tǒng),因此需要另外的機制來協(xié)調心肌細胞的鈣振蕩節(jié)律[11-12,14]。本研究發(fā)現,體外培養(yǎng)的心肌細胞單層有自發(fā)的同步化的鈣振蕩,抑制或者激動IP3Rs能相應地降低或增加心肌細胞鈣振蕩的頻率,而加入RyRs通道的激動劑caffeine,雖能提高單個細胞鈣振蕩頻率,卻打亂了細胞搏動的同步化。這些結果說明,IP3Rs在維持新生大鼠心臟搏動的節(jié)律方面起主要作用。當細胞受到刺激時,肌漿網上的IP3Rs首先被激活并釋放少量Ca2+,這些Ca2+進一步激活鄰近的Ry Rs通道,使肌漿網鈣庫內的鈣離子大量釋放,引起細胞內鈣離子濃度上升。而PE對不同培養(yǎng)時間的細胞鈣振蕩信號的影響結果表明,隨著培養(yǎng)時間的增加,IP3Rs通道的激動劑PE對鈣振蕩的激動效果逐漸下降,這說明隨著心臟的發(fā)育,心肌細胞內的IP3Rs比例下降,對鈣振蕩的調控作用下降。心肌細胞鈣振蕩受到許多因素調控,舒張期鈣離子通過細胞膜外排和肌漿網的鈣回收是影響鈣振蕩頻率的重要因素。有研究表明,PE和caffeine除了作為鈣離子通道的激動劑,對細胞膜上的鈉鈣交換器(Na+-Ca2+exchanger,NCX)及肌漿網鈣泵(SERCA)也有調控作用[15]。因此,需要新的研究進一步闡明這些因素對鈣振蕩的調控作用。

自20世紀60年代開始,國內外許多學者對心肌細胞的原代培養(yǎng)方法展開了廣泛研究[16]。目前,新生大鼠心肌細胞已成為常用的體外細胞實驗模型。新生大鼠的出生時間越短,心肌細胞分離后越容易貼壁,成活率也越高,因此本研究選用出生24 h 內的SD(Sprague-Dawley)大鼠作為實驗對象。在新生大鼠心肌細胞培養(yǎng)過程中,有兩個必須關注的主要問題:一是分離細胞過程中酶的活力和消化時間會明顯影響心肌細胞的數量和活力狀態(tài)。消化力度過大,分離下來的細胞損傷嚴重甚至死亡;消化不足,則會導致分離的心肌細胞數量少,密度小,無法連成片而跳動。本研究采用0.2%膠原酶梯度消化法,消化時間持續(xù)30 min,期間每5 min搖震1次并收集上清細胞。二是快速增殖的非心肌細胞會對心肌細胞的生長造成影響,過度生長的非心肌細胞會抑制心肌細胞的生長。本研究在前人差速貼壁法去除非心肌細胞的基礎上[17-18],加入5-Brd U 來抑制非心肌細胞的增殖,同時保持心肌細胞生長狀態(tài)的穩(wěn)定,保證長時間培養(yǎng)后心肌細胞仍可保持較高純度,不會對研究結果造成明顯影響。

但目前針對幼鼠心肌細胞內鈣信號的發(fā)生與調節(jié)過程以及發(fā)育期心臟的鈣調控變化依然存在很多亟待解決的問題[11,14]。可以嘗試利用siRNA 或轉基因動物對IP3R 與RyR 分別進行特異性的敲除,從而研究單個通道對鈣振蕩的調控作用。除此之外,在二維培養(yǎng)心肌細胞的基礎上,可嘗試在膠原支架上接種心肌細胞,讓種植的心肌細胞在三維支架上生長分化成為具有收縮功能的心肌組織塊,為體外研究心臟的結構功能提供仿真實驗模型,同時也為利用組織工程手段培養(yǎng)出有功能的體外心肌組織替代物創(chuàng)造條件。

綜上,本研究揭示了新生期的心肌細胞中,IP3Rs在維持新生大鼠心臟搏動的節(jié)律方面發(fā)揮主要作用,而Ry Rs則承擔釋放內鈣的主要任務,IP3Rs通過激活Ry R 通道來實現對鈣信號的調控;隨著心臟的發(fā)育,心肌細胞內的IP3Rs比例下降,對鈣振蕩的調控作用下降。