肖淦泓，王敏，侯傳麗，廖林鋒，張穎，任嬌艷,3*

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510641）（2.無限極（中國）有限公司，廣東廣州 510665）（3.中新國際聯(lián)合研究院，廣東廣州 510405）

漿果（如藍(lán)莓、樹莓、接骨木莓等）富含多酚類物質(zhì)，具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)。研究報(bào)道漿果具有抗菌、抗炎、抗病毒、促進(jìn)血管張力等生物活性[1]，而多酚類物質(zhì)（如花色苷類、黃酮醇類、酚酸類等）是發(fā)揮其生物活性的主要成分之一[2,3]。由于多酚類化合物性質(zhì)活潑，因此在加工、貯藏和物流運(yùn)輸過程中，漿果易受溫度、氧氣和光照等因素影響而造成其所含多酚類物質(zhì)含量損失或生物活性降低等問題[4,5]。比如，多酚結(jié)構(gòu)中的酚羥基易發(fā)生自氧化反應(yīng)，產(chǎn)生過氧化物，使多酚含量降低，生物活性下降。多酚芳香環(huán)上的極性取代基的數(shù)量和位置均會影響其化學(xué)性質(zhì)。環(huán)上羥基的存在使花青素在酸性溶液中帶正電荷，過多的羥基會降低花青素分子的穩(wěn)定性[6]；溫度是影響多酚穩(wěn)定性的重要因素之一，在較高溫度儲存時(shí)，多酚會發(fā)生水解、氧化等反應(yīng)，直接導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)的變化[4]；光對于植物多酚的生物合成至關(guān)重要，但也會加速其降解，黑暗環(huán)境下儲存對多酚具有保護(hù)作用。此外，在不同貯藏條件下，環(huán)境溫度改變對不同漿果總多酚含量和抗氧化活性均有不同程度降低[7]。

漿果在物流過程中，尤其是陸運(yùn)，面臨著溫度高、運(yùn)輸久、顛簸震蕩等問題。在陽光照射充足的條件下，夏季路面溫度比氣溫高10～20 ℃，最高可達(dá)55 ℃以上[8]。由于不同材質(zhì)的廂體導(dǎo)熱性不同，非冷鏈運(yùn)輸車廂內(nèi)溫度隨著陸運(yùn)時(shí)間增加而上升的趨勢也不同，物料溫度亦隨之上升，這將直接影響漿果產(chǎn)品的活性成分。通常采用冷鏈運(yùn)輸、氣調(diào)保藏、添加蓄冷劑等方法以解決廂體內(nèi)高溫問題。實(shí)際公路運(yùn)輸中，白天的熱量不斷積累，根據(jù)企業(yè)提供的監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，00:00 a.m.至7:00 a.m.車廂內(nèi)溫度上升速率較低，約0.7 ℃/h；7:00 a.m.至6:00 p.m.隨著陽光照射強(qiáng)度增加，車廂內(nèi)溫度上升速率加快，約2.0 ℃/h；6:00 p.m.至12:00 p.m.光照減弱但車廂內(nèi)熱量無法傳遞至廂外，導(dǎo)致車廂內(nèi)溫度仍在持續(xù)上升，但速率放緩，約1.0 ℃/h。

漿果提取物作為功能性食品市場的重要原料，目前運(yùn)輸過程對其功能成分含量及活性的影響尚不明晰[8]，且大多數(shù)研究對象為漿果鮮果而非已加工產(chǎn)品。因此，本研究探究在模擬夏季公路運(yùn)輸條件下，藍(lán)莓、樹莓和接骨木莓的提取物總多酚含量和體外抗氧化活性變化，為未來相關(guān)功能食品開發(fā)及物流運(yùn)輸條件的優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

藍(lán)莓提取物、樹莓提取物和接骨木莓提取物均由無限極（中國）有限公司提供。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、無水乙醇、磷酸氫二鉀，天津市大茂化學(xué)試劑廠；碳酸鈉，廣州化學(xué)試劑廠；水溶性維生素E（Trolox）、2,2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2'-Azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride，AAPH ），Sigma-Aldrich 美國，純度≥97%；1.1-二苯基-2-苦肼基（2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH·），純度為96%，上海麥克林生化科技有限公司；福林酚，上海源葉生物科技有限公司。以上試劑如無特殊說明均為AR 級，實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 主要儀器設(shè)備

Binder KB240 型低溫恒溫箱，賓德環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備（上海）有限公司；Synergy H1 型全功能微孔板檢測酶標(biāo)儀，美國BioTek 公司；Model 752 型紫外分光光度計(jì)，上?，F(xiàn)科分光儀器有限公司；EXD-622B 型電子天平，福州華科電子儀器有限公司；XW-80A 型渦旋混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；PHS-3C 型pH 計(jì)，雷磁上海儀電科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模擬物流實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)?zāi)M非冷鏈夏季公路運(yùn)輸?shù)臏囟茸兓蜁r(shí)間積累，準(zhǔn)確稱取2 g 樣品粉末于棕色EP 管中，并置于Binder KB240 型低溫恒溫箱中，經(jīng)過30 ℃（7 h）→35 ℃（6 h）→45 ℃（5 h）→55 ℃（5 h）→60 ℃（1 h）→30 ℃（進(jìn)入新循環(huán)）共計(jì)24 h 循環(huán)模擬物流條件，并分別在第0、24、48 和72 h 取出樣品粉末，每組樣品設(shè)置三個(gè)平行。待樣品溫度降至室溫后置于4 ℃冰箱中貯存，以待后續(xù)檢測使用。本實(shí)驗(yàn)中溫度和時(shí)間參數(shù)均依據(jù)非冷鏈物流實(shí)際經(jīng)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置，以模擬在夏季夜間與白天公路運(yùn)輸?shù)膶?shí)際車廂溫度變化（圖1）。

圖1 模擬物流示意圖Fig.1 Schematic diagram of logistics simulation

第一階段：模擬夜間運(yùn)輸，溫度恒定為30 ℃，持續(xù)時(shí)間7 h；

第二階段：模擬白天運(yùn)輸，溫度變化和持續(xù)時(shí)間設(shè)置為35 ℃（6 h）→45 ℃（5 h）→55 ℃（5 h）；

第三階段：模擬車廂隔熱，經(jīng)歷白天后的熱量積累且未能及時(shí)散熱，溫度恒定為60 ℃，持續(xù)時(shí)間1 h，此后再進(jìn)入下一周期的循環(huán)。

1.3.2 多酚含量測定

參考GB/T 8313-2018 中福林酚法并稍作修改，測定樣品多酚含量。

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱取沒食子酸粉末10 mg 并配制濃度為100 μg/mL 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。將100 μg/mL 的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別吸取0、50、100、150、200、250 μL 于試管，再分別依次加入500、450、400、350、300、250 μL 去離子水于對應(yīng)試管中，得到0、10、20、30、40、50 μg/mL 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。向上述沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入2.5 mL 福林酚，渦旋搖勻，室溫反應(yīng)5 min 后立即加入2 mLw=7.5%Na2CO3溶液，渦旋搖勻，室溫靜置60 min。在765 nm處測定標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光值，記錄數(shù)據(jù)。以上實(shí)驗(yàn)均避光進(jìn)行。

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，得到線性回歸方程y=0.011 8x+0.052（R2=0.997 0），表明沒食子酸濃度在0～50 μg/mL 范圍內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系良好（圖2）。

圖2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Gallic acid standard curve

1.3.2.2 樣品多酚含量測定

待測液配制：準(zhǔn)確稱取樣品粉末10 mg 并配制濃度為5 mg/mL 樣品溶液。吸取50 μL 待測液于試管中，加入450 μL去離子水稀釋得到濃度為0.5 mg/mL待測液。分別向上述待測液中加入2.5 mL 福林酚，渦旋搖勻，室溫反應(yīng)5 min 后立即加入2 mLw=7.5% Na2CO3溶液，渦旋搖勻，室溫靜置60 min。在765 nm 處測定待測液吸光值，記錄數(shù)據(jù)。以上實(shí)驗(yàn)均在避光條件下進(jìn)行。

樣品多酚含量按式（1）計(jì)算：

式中：

Z——多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

C0——空白液濃度，μg/mL；

C1——待測液濃度，μg/mL；

V1——加入待測液于試管中的體積，本實(shí)驗(yàn)為50 μL；

V2——終體系的體積，本實(shí)驗(yàn)為5 mL；

CY——樣品溶液濃度，本實(shí)驗(yàn)為5 mg/mL。

1.3.3 DPPH·清除率測定

參照文獻(xiàn)[9]，用DPPH·清除率IC50值來表征提取物的抗氧化活性。Ai：取2 mL 樣品和2 mL DPPH·溶液于試管；Aj：在試管中取2 mL 樣品和2 mL 無水乙醇于試管；Ac：取2 mL 無水乙醇和2 mL DPPH·溶液于試管。三組均振動10 s，在37 ℃恒溫箱中保溫30 min 后，采用分光光度計(jì)測定樣品517 nm 處吸光值。按照式（2）計(jì)算DPPH·清除率（記為F，%）：

1.3.4 氧自由基吸收能力（ORAC）測定

參照文獻(xiàn)[10]方法，并稍作修改，采用酶標(biāo)儀檢測樣品熒光強(qiáng)度的變化，實(shí)驗(yàn)步驟如下，分別向96 孔板中加入20 μL 待測樣品、Trolox（6.25、12.5、25、50 μmol/L）標(biāo)準(zhǔn)液和磷酸緩沖工作液，37 ℃孵育10 min 后，加入200 μL Fluorescein 孵育20 min，其中對照組加入20 μL 磷酸緩沖工作液，其余每孔加入20 μL AAPH，檢測2 h 內(nèi)反應(yīng)液在538 nm 處吸光值的變化。氧自由基清除能力ORAC 值為通過相對熒光衰減曲線面積S的變化計(jì)算并以Trolox 當(dāng)量表示，公式如下：

式中：

Q——氧自由基清除能力（ORAC）；

S——熒光淬滅曲線下面積；

△t——相鄰兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的時(shí)間間隔，s；

F0,F1,...,Fn——分別表示淬滅曲線的微分。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD），圖表由Prism 8 分析繪制，采用SPSS 20.0 軟件單因素方差分析方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和線性回歸分析（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬物流前后多酚含量變化

漿果果實(shí)中多酚類物質(zhì)穩(wěn)定性易受溫度影響，溫度較高時(shí)，多酚會發(fā)生水解、氧化等反應(yīng)，直接導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)變化及含量下降[5]。為了分析藍(lán)莓提取物、樹莓提取物和接骨木莓提取物中多酚含量經(jīng)模擬物流運(yùn)輸條件下的變化，采用Folin 酚法測定三者在不同物流循環(huán)時(shí)間下的多酚含量。模擬物流前（第0 d）接骨木莓提取物、藍(lán)莓提取物和樹莓提取物多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為14.96%、5.11%和2.53%。然而，對比模擬物流前后藍(lán)莓提取物和樹莓提取物的多酚含量，發(fā)現(xiàn)二者均無顯著性差異（p＞0.05）；但接骨木莓提取物經(jīng)模擬物流后（第3 d）的多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于模擬物流前的多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)，達(dá)到17.03%（p＜0.05）（圖3）。三種漿果提取物多酚含量的變化可能由于結(jié)合態(tài)多酚轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)多酚，導(dǎo)致三者間的差異[11]。矯馨瑤等發(fā)現(xiàn)漿果果實(shí)多酚含量在30 ℃時(shí)多酚保存率出現(xiàn)顯著下降（p＜0.05）[5]，此現(xiàn)象與本文結(jié)果不同，推測可能由于提取物的含水量極低，降解反應(yīng)較難發(fā)生，導(dǎo)致漿果提取物多酚含量變化與漿果果實(shí)多酚含量變化間的差異。通過對數(shù)據(jù)庫 Phenol-Explorer 3.6（http://phenol-explorer.eu/）[12]中有關(guān)接骨木莓、藍(lán)莓和樹莓多酚物質(zhì)的匯總數(shù)據(jù)分析可知，三者多酚含量分別為1 358.66、307.02 和203.50 mg/100 g，其比例與本實(shí)驗(yàn)中采用福林酚法實(shí)際測得的接骨木莓提取物、藍(lán)莓提取物和樹莓提取物的多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)比例相近。

圖3 三種漿果提取物總酚含量Fig.3 Total phenol content of three kinds of berry extract

2.2 模擬物流前后DPPH·清除活性變化

DPPH·清除率是體外評價(jià)多酚類物質(zhì)抗氧化活性的常用手段之一[13]。在第0 天時(shí)三種提取物中DPPH·半數(shù)清除濃度IC50值大小順序?yàn)闃漭崛∥铮舅{(lán)莓提取物＞接骨木莓提取物，而三者的多酚含量恰好相反，表明多酚含量越高，DPPH·清除活性越強(qiáng)。與第0 天相比，模擬物流后三種漿果多酚提取物的IC50值在第3 天顯著升高（p＜0.05）且平均增長率均超過20%，藍(lán)莓提取物IC50值平均增長率最高，達(dá)63.32%（圖4a 和圖4b）。為進(jìn)一步分析三種漿果多酚提取物模擬物流不同天數(shù)的DPPH·清除活性變化，分別將三種漿果提取物第n天的IC50值與第n-1天的IC50值作差得到第n天ΔDPPH（圖4c）。在模擬物流第1 天時(shí)三種漿果提取物ΔDPPH均較低；在模擬物流第2 天時(shí)樹莓提取物和藍(lán)莓提取物ΔDPPH均為正值（分別為973.33 μg/mL 和156.93 μg/mL），而接骨木莓提取物ΔDPPH趨近于0；在模擬物流第3 天時(shí)藍(lán)莓提取物ΔDPPH明顯升高，而接骨木莓提取物ΔDPPH仍較低。結(jié)果表明，在模擬物流條件下，三種漿果提取物DPPH·清除活性穩(wěn)定性依次為樹莓提取物＜藍(lán)莓提取物＜接骨木莓提取物，三者在模擬物流第1 天后DPPH·清除活性均較穩(wěn)定，第2 天后樹莓提取物和藍(lán)莓提取物DPPH·清除活性均明顯降低，接骨木莓提取物DPPH·清除活性在三天模擬物流過程中較穩(wěn)定。Hacer 等[14]將漿果中花青素和非花青素餾分進(jìn)行抗氧化活性對比，發(fā)現(xiàn)花青素餾分DPPH·清除活性高于非花青素餾分，由于花色素環(huán)上羥基化和甲氧基化程度和位置影響其形成的花色苷穩(wěn)定性和抗氧化性[15]，因此花青素及花色苷含量越高、種類越多，其穩(wěn)定性越強(qiáng)且對DPPH·清除活性的貢獻(xiàn)越大。

圖4 三種漿果提取物DPPH·清除活性及變化Fig.4 DPPH· scavenging activity and change of three kinds of berry extract

根據(jù)數(shù)據(jù)庫Phenol-Explorer[11]可知，接骨木莓中花色苷絕對含量最高（1 316.66 mg/100 g），故具有最高的初始DPPH·清除活性且穩(wěn)定性最好；藍(lán)莓的多酚組成較復(fù)雜，花色苷、酚酸和黃酮醇絕對含量分別為133.99、133.23 和39.8 mg/100 g，故初始DPPH·清除活性比接骨木莓低；樹莓花色苷含量最低（71.94 mg/100 g），對DPPH·清除活性貢獻(xiàn)較大的鞣花單寧Lambertianin C 和Sanguin H-6 含量較高（分別為30.84 mg/100 g 和76.10 mg/100 g）[16]，但二者在中性、高溫（60～80 ℃）下易降解[17]。得出結(jié)論，模擬物流溫度變化和時(shí)間積累對藍(lán)莓提取物、樹莓提取物和接骨木莓提取物的DPPH·清除活性均有顯著影響（p＜0.05）。

2.3 模擬物流前后ORAC 活性變化

氧自由基吸收能力是體外評判抗氧化活性的重要手段，通常以水溶性維生素E（Trolox）為定量標(biāo)準(zhǔn)。樹莓提取物、藍(lán)莓提取物和接骨木莓提取物初始Trolox 當(dāng)量分別為0.67、1.44 和1.36 μmol Trolox/mg，三者ORAC 活性順序依次為藍(lán)莓提取物＜接骨木莓提取物＜樹莓提取物（圖5a）。在模擬物流不同循環(huán)周期下，三種漿果提取物ORAC 活性均有較大波動。經(jīng)歷3 d 模擬物流后，樹莓提取物、藍(lán)莓提取物和接骨木莓提取物的Trolox 當(dāng)量總損失率分別為32.74%、19.72%和62.76%（圖5b）。為進(jìn)一步分析三種漿果提取物在模擬物流不同天數(shù)下ORAC 活性的變化，分別將三種漿果提取物第n天的Trolox 當(dāng)量值與第n-1 天的Trolox 當(dāng)量值作差得到ΔORAC（圖5c）。在模擬物流第 1 天時(shí)，僅藍(lán)莓提取物ΔORAC為負(fù)值（-0.74 μmol Trolox/mg），而樹莓提取物和接骨木莓提取物ΔORAC≥0，說明在模擬物流第1 天后，藍(lán)莓提取物ORAC 活性出現(xiàn)明顯下降，而樹莓提取物和接骨木莓提取物ORAC 活性較穩(wěn)定；在模擬物流第2 天時(shí)，接骨木莓提取物ΔORAC為負(fù)值（-1.30 μmol Trolox/mg），ORAC 活性下降；在模擬物流第3 天時(shí)，樹莓提取物ΔORAC為負(fù)值（-1.00 μmol Trolox/mg），ORAC 活性下降。結(jié)果表明，在模擬物流條件下，三種漿果提取物ORAC 活性波動較大，活性下降后仍可能上升，根據(jù)首次出現(xiàn)活性下降時(shí)間先后順序來評判三者穩(wěn)定性大小，依次為藍(lán)莓提取物＜接骨木莓提取物＜樹莓提取物。接骨木莓提取物的多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)在模擬物流后顯著升高（p＜0.05），表明接骨木莓提取物中多酚組分含量及比例發(fā)生變化，由于酚類物質(zhì)的組分含量及比例不同會影響整體的氧自由基吸收活性[17]。因此推斷每經(jīng)歷24 h 模擬公路運(yùn)輸溫度變化條件后，藍(lán)莓提取物、樹莓提取物和接骨木莓提取物中多酚組分發(fā)生不同程度的變化，并在不同循環(huán)時(shí)間下表現(xiàn)出不同的ORAC活性。得出結(jié)論，模擬物流可能會通過改變酚類物質(zhì)組分含量及比例引起藍(lán)莓提取物、樹莓提取物和接骨木莓提取物ORAC 活性變化，三者ORAC 穩(wěn)定性依次為藍(lán)莓提取物＜接骨木莓提取物＜樹莓提取物。

圖5 三種漿果提取物ORAC 活性及變化Fig.5 ORAC activity and change of three kinds of berry extract

3 討論

漿果含有豐富的多酚類物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，其提取物常被用作功能性食品的原料。然而，多酚類物質(zhì)由于存在活性酚羥基而易在運(yùn)輸過程中損失，使其生物活性降低[4,5,18,19]。與其它文獻(xiàn)對漿果果實(shí)的研究結(jié)果不同[20]，本文發(fā)現(xiàn)三種漿果提取物的多酚含量經(jīng)過模擬物流三天后并未明顯降低，但DPPH·清除活性和ORAC 活性均有顯著變化。如圖6a所示，三種漿果的多酚組成不同，但均含有花色苷類和黃酮醇類物質(zhì)，不同的組分對ORAC 和DPPH·清除活性的貢獻(xiàn)不同。將Lutz 等[21]對不同蔬果多酚含量及抗氧化活性檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示總多酚含量與DPPH·清除活性相關(guān)系數(shù)最高（R=0.94），總花色苷含量與ORAC活性相關(guān)系數(shù)最高（R=0.97）（圖6b）。此結(jié)果提示在模擬物流過程中三種漿果提取物可能受到溫度升高和時(shí)間積累的影響，其花色苷降解成花色素?；ㄉ貑误w在連接不同糖基后抗氧化活性將發(fā)生不同的變化[15]，因此ORAC 活性可能在不同循環(huán)時(shí)間下發(fā)生波動。此外，三種漿果提取物總酚含量均出現(xiàn)先下降后上升的趨勢，相應(yīng)DPPH·半數(shù)清除濃度IC50先上升再下降，但總體而言DPPH·清除活性均下降。

圖6 （a）接骨木莓、藍(lán)莓和樹莓多酚組成；（b）藍(lán)莓、樹莓和接骨木莓多酚組成與DPPH·清除活性和ORAC 的相關(guān)性分析[21]Fig.6 (a) Polyphenol composition of blueberry extract,raspberry extract and elderberry extract;(b) Analysis of correlation between polyphenol composition and DPPH· scavenging activity and ORAC in blueberry,raspberry and elderberry

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過模擬夏季陸地運(yùn)輸溫度變化和時(shí)間積累過程以探究藍(lán)莓提取物、樹莓提取物和接骨木莓提取物的多酚含量及其抗氧化活性變化。結(jié)果顯示，在模擬物流溫度變化和時(shí)間積累的條件下，接骨木莓提取物多酚含量顯著增加，而藍(lán)莓提取物和樹莓提取物多酚含量受模擬物流影響較小；三者DPPH·清除活性均顯著降低，在模擬物流第1 天時(shí)三者DPPH·清除能力較穩(wěn)定，而在第2 天后藍(lán)莓提取物和樹莓提取物的DPPH·清除能力出現(xiàn)不同程度失穩(wěn)，僅接骨木莓提取物在三天模擬物流后仍能保持較高的DPPH·清除能力，三者DPPH·清除活性穩(wěn)定性依次為樹莓提取物＜藍(lán)莓提取物＜接骨木莓提取物；三者ORAC 活性波動較大，按照首次出現(xiàn)活性下降時(shí)間先后順序來評判三者穩(wěn)定性大小，依次為藍(lán)莓提取物＜接骨木莓提取物＜樹莓提取物。因此，在運(yùn)輸過程中，運(yùn)輸條件（溫度和時(shí)間）可對漿果提取物中多酚類物質(zhì)的含量及抗氧化活性產(chǎn)生影響，且提取物的抗氧化能力與酚類物質(zhì)的種類及占比存在一定的相關(guān)性。