毛家英，白玉英，彭麟杰，解靜,2,3*，田洋,2,3*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201）（2.國家辣木加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，云南昆明 650201）（3.食藥同源資源開發(fā)與利用教育部工程中研究中心，云南昆明 650201）

近年來，全球超重和肥胖的發(fā)病率增長明顯，在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家均呈快速蔓延之勢(shì)，帶來了巨大的疾病隱患和健康威脅[1]，尤其是達(dá)到病態(tài)性肥胖時(shí)（BMI≥40 kg/m2），死亡率會(huì)急劇增加[2]。目前，抗肥胖藥物種類繁多，雖然這些減肥藥物具有顯著的降低體重功效，但往往具有明顯的副作用[3]。天然產(chǎn)物被認(rèn)為是一種藥理活性高的安全有效的天然資源，被認(rèn)為是藥物先導(dǎo)物的主要來源，因其結(jié)構(gòu)簡單且便于大規(guī)模生產(chǎn)而廣受關(guān)注，因此，開發(fā)具有降脂活性、純度較高的天然化合物藥物具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

辣木（Moringa oleifera.Lam）是一種極具降脂潛力的天然產(chǎn)物，它含有的多種天然活性成分（如揮發(fā)油等）以及辣木提取物已被證實(shí)具有降低膽固醇吸收[4,5]、降低血糖[6]以及增加高脂飲食小鼠能量消耗的功效且無副作用[7,8]。異硫氰酸酯是一類具有殺菌[9]、抗氧化[10]、抗癌[11]及降血糖和降血脂[12]等生物活性的化合物。最新研究表明，辣木葉和辣木籽中富含辣木異硫氰酸酯 -4-[(α-L-rhamnosyloxy) benzyl]Isothiocyanates（MIC-1）[13]，相比于其它十字花科蔬菜中的異硫氰酸酯化合物具有更高的化學(xué)穩(wěn)定性[14]，并且有證據(jù)顯示MIC-1可能是辣木提取物調(diào)控糖脂代謝的主要活性物質(zhì)[15,16]。因此，本研究以MIC-1 為實(shí)驗(yàn)材料，研究MIC-1 對(duì)3T3-L1 脂肪細(xì)胞脂質(zhì)積累的抑制作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3T3-L1 前脂肪細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究。辣木籽購買于云南天佑科技開發(fā)有限公司。DMEM 培養(yǎng)基，Hyclone 公司；青霉素-鏈霉素、1 mol/L Tris-HCl（pH 值6.8）、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 值8.8）、BCA 蛋白測(cè)定試劑盒，碧云天公司；細(xì)胞裂解液、胰蛋白酶消化液、二甲基亞砜（DMSO）、油紅O，solarbio公司；甘油含量測(cè)定試劑盒、甘油三酯測(cè)定試劑盒與游離脂肪酸測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；胎牛血清（FBS），BI 公司；qRT-PCR 試劑，TaKaRa公司。二抗，ABclonal 公司；一抗，萬類生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱，蘇州貝茵醫(yī)療器械有限公司；Z36HK 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國 Hermle Labortechnik GmbH 公司；多功能酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，北京德泉興業(yè)商貿(mào)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MIC-1 的制備

辣木籽粉碎后用石油醚去油，以料液比（m:V）為1:60、溫度30 ℃、pH 值為5、時(shí)間9 h 的提取條件獲得酶解提取液，采用萃取、減壓濃縮及重結(jié)晶獲取純凈晶體備用，純度達(dá)98%，MIC-1 的結(jié)構(gòu)式如圖1所示[17]。

圖1 MIC-1 結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of MIC-1

1.3.2 3T3-L1 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代與分化生長

細(xì)胞傳代：3T3-L1 前脂肪細(xì)胞用含w=10% FBS的高糖DMEM 培養(yǎng)基于在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)覆蓋率達(dá)80%左右經(jīng)胰酶消化后接種于5 mm 培養(yǎng)皿中分化。

細(xì)胞分化：接種于5 mm 培養(yǎng)皿的3T3-L1 前脂肪細(xì)胞貼壁生長5～6 d 后，依次用MDI 和INS 誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，再用10% FBS 高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)明顯脂滴可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[18]。

1.3.3 3T3-L1 細(xì)胞存活率檢測(cè)

將3T3-L1 前脂肪細(xì)胞以每孔1×104個(gè)接種于96孔板中，用不同濃度的MIC-1（0、1、2、4、8、16 μmol/L）的10% FBS 培養(yǎng)基處理細(xì)胞48 h，倒掉上清，取含0.5 mg/mL MTT 的培養(yǎng)基以每孔100 μL 的量加入培養(yǎng) 4 h，每孔加入100 μL 二甲基亞砜（DMSO）。在492 nm 處測(cè)定吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.4 油紅O 染色

油紅O 和雙蒸水以3:2 比例配制油紅O 染液，混合后靜置10 min，用0.45 μm 有機(jī)濾頭過濾備用。將對(duì)數(shù)生長期的3T3-L1前脂肪細(xì)胞以每皿2×105個(gè)的密度接種于5 mm 培養(yǎng)皿，按照分化步驟分化成功后，換以含不同濃度MIC-1（0、2、4 μmol/L）的10% FBS培養(yǎng)基處理48 h。用油紅O 染色后，倒置顯微鏡觀察脂滴形成情況。

1.3.5 3T3-L1 脂肪細(xì)胞Gly、TG 和FFA 含量的測(cè)定

將對(duì)數(shù)生長期的3T3-L1 前脂肪細(xì)胞以每皿2×105個(gè)的密度接種于5 mm 培養(yǎng)皿，按照分化步驟分化成功后，按1.3.4 中給藥方式處理細(xì)胞，給藥48 h 后，收集各組細(xì)胞，低速離心除雜后收集培養(yǎng)上清液。上清液中的Gly 和FFA 濃度按照試劑盒說明書測(cè)定。細(xì)胞勻漿液由PBS 洗滌2 次后勻漿獲得，按BCA 法測(cè)定蛋白含量，進(jìn)一步進(jìn)行TG 含量的測(cè)定。

1.3.6 qRT-PC 法測(cè)定細(xì)胞中脂代謝相關(guān)因子mRNA 的表達(dá)水平

將對(duì)數(shù)生長期的3T3-L1 前脂肪細(xì)胞以每皿2×105個(gè)的密度接種于5 mm 培養(yǎng)皿，按照分化步驟分化成功后，按1.3.4 中給藥方式處理細(xì)胞，給藥48 h 后，收集各組細(xì)胞。按照試劑盒說明進(jìn)行3T3-L1 細(xì)胞RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，qPCR 測(cè)定獲得樣品CP值。采用相對(duì)定量法（ΔΔCT）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.7 Western Blot 法檢測(cè)3T3-L1 脂肪細(xì)胞中AMPK 蛋白和PPARγ蛋白表達(dá)水平

將對(duì)數(shù)生長期的3T3-L1 前脂肪細(xì)胞以每皿2×105個(gè)的密度接種于5 mm 培養(yǎng)皿，按照分化步驟分化成功后，按1.3.4 中給藥方式處理細(xì)胞48 h。裂解30 min后離心獲取蛋白上清液，并BCA 法測(cè)定其濃度。制得蛋白樣品后進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，通過Image J 軟件分析蛋白質(zhì)條帶，定量檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Graphpad prism 等軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，組間比較采用單因素方差分析（所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次），*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***p＜0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 MIC-1 對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞存活率的影響

如圖2 所示，用不同濃度的MIC-1（0、1、2、4、8、16 μmol/L）處理3T3-L1 前脂肪細(xì)胞48 h 后，與對(duì)照組（0 μmol/L）相比，MIC-1 對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞存活率無明顯影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明MIC-1 對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞無毒性。

圖2 MIC-1 對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effect of MIC-1 on the survival rate of 3T3-L1 adipocytes

2.2 MIC-1 對(duì)3T3-L1 脂肪細(xì)胞脂質(zhì)積累的影響

前脂肪細(xì)胞的過度分化和脂肪細(xì)胞體積的增大是肥胖的主要表現(xiàn)[19]。通過油紅O 染液染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化是確定細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂肪沉積的常用方法。如圖3 所示，對(duì)照組（0 μmol/L）脂肪細(xì)胞分布密集，脂滴較大，胞質(zhì)內(nèi)脂滴聚集明顯，表明細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的成脂分化現(xiàn)象；用2、4 μmol/L 的MIC-1 處理48 h 后，細(xì)胞脂滴聚集明顯減少，分布較稀疏，有許多未著色細(xì)胞群，而且MIC-1 的處理濃度越高，脂滴數(shù)量以及大小也隨之減小。結(jié)果表明，MIC-1 具有抑制脂質(zhì)積累的作用。與Huang 等[20]的研究結(jié)果一致。

圖3 不同濃度MIC-1 對(duì)3T3-L1 脂肪細(xì)胞脂質(zhì)積累的影響Fig.3 Effect of different concentrations of MIC-1 on lipid accumulation of 3T3-L1 adipocytes

2.3 MIC-1 對(duì)3T3-L1 脂肪細(xì)胞內(nèi)TG、FFA 和Gly 水平的影響

分化成熟的脂肪細(xì)胞合成的TG 以脂滴的形式在胞質(zhì)內(nèi)過度堆積，當(dāng)機(jī)體能量消耗比攝取量多時(shí)，儲(chǔ)存的甘油三酯就會(huì)分解為Gly 和FFA[21]。研究表明FFA 的異?？赡苁且甬愇恢|(zhì)積聚和脂毒性的關(guān)鍵因素之一[22]。通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)TG 濃度及其水解物含量的測(cè)定可以進(jìn)一步確定MIC-1 對(duì)3T3-L1 脂肪細(xì)胞脂代謝的影響。如圖4 所示，經(jīng)MIC-1 處理后，與對(duì)照組（0 μmol/L）相比，MIC-1 處理降低了脂肪細(xì)胞內(nèi)TG 濃度及其上清液中的FFA 濃度，2 μmol/L 和4 μmol/L MIC-1 組中TG 濃度較對(duì)照組分別下降53.00%（p＜0.001）和64.00%（p＜0.001），F(xiàn)FA 濃度分別下降59.00%（p＜0.001）和75.00%（p＜0.001）。同時(shí)，MIC-1 處理還能提升細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的Gly濃度，當(dāng)MIC-1 的濃度達(dá)到4 μmol/L 時(shí)，Gly 濃度較對(duì)照組相比可顯著增加87.93%（p＜0.05）。上述結(jié)果表明MIC-1 顯著促進(jìn)3T3-L1 脂肪細(xì)胞中TG 水解，同時(shí)抑制FFA 的溢出[23]，改善脂肪細(xì)胞的脂代謝。

圖4 MIC-1 對(duì)3T3-L1 脂肪細(xì)胞內(nèi)TG(a)、FFA(b)和Gly(c)濃度的影響Fig.4 Effect of MIC-1 on the levels of TG (a),FFA (b) and Gly(c) in 3T3-L1 adipocytes

2.4 MIC-1 對(duì)3T3-L1 脂肪細(xì)胞脂代謝相關(guān)因子mRNA 表達(dá)水平的影響

脂肪的生成需要多種核轉(zhuǎn)錄因子的參與。在脂代謝的過程中，PPARγ是脂肪生成和分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，SCD1是參與合成的關(guān)鍵酶，二者與脂肪的生成、貯存等過程密切相關(guān)。如圖5 所示，經(jīng)不同濃度的MIC-1 處理后的3T3-L1 脂肪細(xì)胞中PPARγ和硬脂酰輔酶A 去飽和酶1（SCD1）mRNA 表達(dá)水平顯著降低。與對(duì)照組相比，當(dāng)MIC-1 劑量為4 μmol/L 時(shí)，3T3-L1 脂肪細(xì)胞的PPARγ和SCD1mRNA 表達(dá)水平分別顯著降低了46.00%（p＜0.05）和62.00%（p＜0.05）。據(jù)報(bào)道白藜蘆醇可通過抑制SCD1mRNA表達(dá)水平抑制HepG2 細(xì)胞的脂肪合成[24]，與本研究結(jié)果相一致。上述結(jié)果表明，MIC-1 通過抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂肪合成相關(guān)因子PPARγ和SCD1的轉(zhuǎn)錄，抑制脂肪的生成，進(jìn)而抑制脂質(zhì)積累。

圖5 MIC-1 對(duì)3T3-L1 脂肪細(xì)胞中PPARγ(A)和SCD1(B) mRNA表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of MIC-1 on PPARγ (A) and SCD1 (B) mRNA levels in 3T3-L1adipocytes

2.5 MIC-1 對(duì)3T3-L1 脂肪細(xì)胞AMPK 通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

圖6 MIC-1 對(duì)3T3-L1 脂肪細(xì)胞中p-AMPK 和PPARγ 蛋白表達(dá)水平的影響Fig.6 Effect of MIC-1 on p-AMPK and PPARγ protein expression levels in 3T3-L1adipocytes

AMPK 是PPARγ的上游因子，AMPK 通過改變參與脂肪代謝的蛋白質(zhì)和酶的表達(dá)模式直接調(diào)節(jié)脂肪酸合成和氧化，并且調(diào)節(jié)前脂肪細(xì)胞分化。在之前的研究中我們發(fā)現(xiàn)辣木葉石油醚提取物可激活A(yù)MPK信號(hào)通路從而抑制脂肪生成[25]。在本研究中，經(jīng)不同濃度的MIC-1 處理后，3T3-L1 脂肪細(xì)胞中AMPK 蛋白磷酸化水平呈遞增趨勢(shì)，當(dāng)MIC-1 的濃度達(dá)到4 μmol/L 時(shí)，AMPK 蛋白磷酸化水平與對(duì)照組相比顯著增加64.47%（p＜0.01）。同時(shí)PPARγ蛋白表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，2 μmol/L 和4 μmol/L MIC-1 處理后，PPARγ蛋白表達(dá)水平分別下降了27.39%（p＜0.05）和52.10%（p＜0.01）。結(jié)果表明MIC-1 可能通過活化AMPK 從而抑制PPARγ的表達(dá)來調(diào)控脂肪的合成及儲(chǔ)存。

3 結(jié)論

目前，在我國的面臨的公共衛(wèi)生問題中，肥胖位居前列。如何醫(yī)治肥胖癥是人們共同面臨的問題與挑戰(zhàn)。在本研究中，天然化合物MIC-1 對(duì)3T3-L1 脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)積累具有顯著的抑制作用，并且其機(jī)制可能是活化AMPK，下調(diào)PPARγ和SCD1mRNA 表達(dá)水平有關(guān)，進(jìn)而促進(jìn)TG 分解和抑制TG 的合成。研究結(jié)果為深入探討MIC-1抑制脂肪積累的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為辣木資源的深加工提供科學(xué)依據(jù)。