姚國敏，李 蓉，鄧 穎，王小娣，張 勇

(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科，西安 710077;*通訊作者,E-mail:rechelrong198222@163.com)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是一種最常見的對視力危害極大的糖尿病并發(fā)癥，嚴(yán)重可致盲，在全球工作年齡人群致盲眼病中居首位[1,2]。DR屬于視網(wǎng)膜血管性疾病，其損傷視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)，破壞血-視網(wǎng)膜屏障，出現(xiàn)滲出，發(fā)生黃斑水腫，視力下降，病情進(jìn)一步發(fā)展出現(xiàn)新生血管，新生血管的生長會扭曲視網(wǎng)膜的微血管系統(tǒng)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離，最終導(dǎo)致失明[3]。DR的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜不明，同時針對DR的控制也無特效方法。

近幾年研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素(adiponectin，APN)與血管生成關(guān)系密切。APN是一種由脂肪細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，是唯一一個對人體起保護(hù)作用的脂肪因子[4]，在糖尿病等多種代謝性疾病中發(fā)揮有益作用[5]，并在視網(wǎng)膜的血管性損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[6]。但APN對各種代謝性疾病保護(hù)的具體機(jī)制目前未完全闡明。本課題組前期研究顯示APN對體外培養(yǎng)恒河猴脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(RF/6A)有一定影響[7-10]，并發(fā)現(xiàn)APN可以降低細(xì)胞在高糖及缺氧環(huán)境下的凋亡、自噬水平，減輕缺氧環(huán)境下的氧化應(yīng)激，促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖。由于RF/6A與人類細(xì)胞不同源造成的基因差異，本次實驗改用人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRMECs)作為研究對象，采用APN預(yù)處理后檢測增殖率、凋亡率、凋亡相關(guān)蛋白量等指標(biāo)，分析APN對高糖下HRMECs的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑和儀器

HRMECs購自中國上海中喬新舟生物科技公司；APN購自中國南京金斯瑞生物科技公司；M199培養(yǎng)基、0.25%胰酶購自中國武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司；胎牛血清購自中國上海依科賽(Excell Bio)生物科技有限公司；青霉素、鏈霉素購自中國上海阿拉丁(Aladdin)生化科技股份有限公司；封閉液中NaCl、冰醋酸、吐溫20購自中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；封閉液中Tris-base購自德國Biofroxx公司；PVDF膜(0.45 μm)購自德國Millipore公司；AE-CK-A362型CCK-8增殖檢測試劑盒、E-CK-A211型細(xì)胞凋亡試劑盒購自中國武漢伊萊瑞特(Elabscience)生物科技股份有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)公司；50599-2-Ig號兔多抗Bax、12789-1-AP號兔多抗Bcl-2以及19677-1-AP號兔多抗Caspase-3購自中國武漢三鷹生物技術(shù)公司；Multiskan MK3型全自動酶標(biāo)儀購自美國Thermo scientific；MCO-15AC型CO2恒溫培養(yǎng)箱購自日本SANYO；CytoFLEX型流式細(xì)胞儀購自美國BECKMAN。

1.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng)

HRMECs解凍后轉(zhuǎn)移入離心管中，加入完全培養(yǎng)基，室溫1 000 r/min離心5 min后收集細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基(89% M199+10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素)制成細(xì)胞懸液,接種至10 cm培養(yǎng)皿中,在37 ℃恒溫、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%時，按1 ∶3的比例傳代及擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞分組及處理

根據(jù)實驗?zāi)康碾S機(jī)將HRMECs分為3組：對照組、高糖組、高糖+APN組。對照組：DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，無干預(yù)；高糖組：在DMEM培養(yǎng)基內(nèi)加入25 mmol/L D-葡萄糖，制備成高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；高糖+APN組：細(xì)胞先用10 μg/ml APN預(yù)處理2 h(預(yù)處理同時段，對照組與高糖組均在DMEM培養(yǎng)基中正常培養(yǎng))，然后用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有細(xì)胞均在飽和濕度、37 ℃恒溫、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測HRMECs凋亡率

細(xì)胞經(jīng)不含EDTA的0.25%胰酶消化后收集；PBS清洗2次，1 500 r/min，5 min;檢測按照凋亡試劑盒說明進(jìn)行：加入500 μl緩沖液，使細(xì)胞懸??；加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC混勻，再加入5 μl PI混勻，同時設(shè)陰性對照(正常細(xì)胞不加Annexin和PI)，陽性對照1(以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對照，只加5 μl Annexin Ⅴ-FITC單標(biāo))以及陽性對照2(以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對照，只加5 μl PI單標(biāo))，室溫避光染色15 min；上機(jī)檢測。

1.5 Western blot檢測HRMECs凋亡過程中Bax、Bcl-2以及Caspase-3的蛋白表達(dá)水平

各組細(xì)胞處理完成后并收集，PBS預(yù)冷至4 ℃，用其洗滌細(xì)胞3次，置細(xì)胞于冰上，用RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)裂解30 min，12 000 r/min離心5 min，取上清，按照BCA法測定蛋白含量。蛋白變性，制備電泳膠，取40 μg等量蛋白上樣。電泳分離，轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜浸泡于封閉液(含5%脫脂奶粉)中，室溫?fù)u床封閉2 h。用封閉液稀釋一抗(Bax 1 ∶8 000、Bcl-2 1 ∶2 000、Caspase-3 1 ∶1 000)，PVDF膜與相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過夜，再用封閉液充分洗滌5次去除多余的一抗，隨后將PVDF膜浸泡于二抗孵育液(封閉液稀釋HRP標(biāo)記羊抗兔二抗至1 ∶10 000)中，室溫?fù)u床孵育2 h，ECL顯色，成像，晾干后掃描膠片，使用Band Scan分析膠片各條帶灰度值，通過計算指標(biāo)灰度值與內(nèi)參灰度值的比值，得出目的蛋白相對表達(dá)量。

1.6 CCK-8法檢測HRMECs增殖

取培養(yǎng)中生長良好的細(xì)胞，配置密度為5×104/ml的細(xì)胞懸液，按每孔100 μl將細(xì)胞懸液接于96孔板，最外圈孔不作為測定孔，設(shè)置3組復(fù)孔及空白對照孔，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中(37 ℃、5% CO2)預(yù)培養(yǎng)24 h。隨后按分組要求培養(yǎng)細(xì)胞24 h，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，最后測定各孔吸光值OD450。按公式計算，得出數(shù)值：細(xì)胞增殖率(%)=(OD實驗組-OD空白孔)/(OD對照組-OD空白孔)×100%。

1.7 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 APN預(yù)處理降低高糖誘導(dǎo)下HRMECs凋亡率

檢測結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞凋亡率最低，為7.03%±0.16%；與對照組比較，高糖組細(xì)胞凋亡率明顯升高，為26.51%±1.18%；與高糖組比較，高糖+APN組細(xì)胞凋亡率下降，為12.35%±0.37%(見圖1)。三組數(shù)據(jù)總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=588.35，P<0.001)。各組數(shù)據(jù)兩兩比較，高糖組和高糖+APN組細(xì)胞凋亡率均較對照組升高(P<0.001)；高糖+APN組較高糖組的細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.001，見圖2)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測各組HRMECs凋亡率Figure 1 Apoptosis rate of HRMECs in different groups by flow cytometry

與對照組比較,*P<0.001；與高糖組比較,#P<0.001圖2 各組HRMECs凋亡率的比較Figure 2 Comparison of apoptosis rate of HRMECs among three groups

2.2 APN預(yù)處理對高糖環(huán)境下HRMECs表達(dá)凋亡蛋白的影響

與對照組比較，高糖組Bax、Caspase-3水平明顯升高，但Bcl-2的表達(dá)量明顯降低；與高糖組比較，高糖+APN組Bax、Caspase-3水平降低，但Bcl-2的表達(dá)量增強(qiáng)(均P<0.001，見圖3)。提示高糖組的細(xì)胞凋亡最強(qiáng)，細(xì)胞經(jīng)APN預(yù)處理后凋亡減弱。

與對照組比較,*P<0.001；與高糖組比較,#P<0.001圖3 Western blot檢測各組HRMECs蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)Figure 3 Expression of Caspase-3, Bcl-2 and Bax in HRMECs cells in various groups

2.3 APN預(yù)處理提高高糖誘導(dǎo)下HRMECs細(xì)胞增殖率

CCK-8檢測結(jié)果顯示，高糖組細(xì)胞增殖率為71.81%±0.65%，較對照組(100%±0%)明顯降低，APN預(yù)處理后細(xì)胞增殖率明顯回升，為89.50%±1.33%。三組數(shù)據(jù)總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=848.06，P<0.001，見圖4)。組間兩兩比較，細(xì)胞增殖率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，見圖4)。

與對照組比較,*P<0.001；與高糖組比較,#P<0.001圖4 各組HRMECs增殖率的比較Figure 4 Comparison of proliferation rate of HRMECs among three groups

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病導(dǎo)致的視網(wǎng)膜微血管損害，影響患者視力甚至致盲，是工作年齡人群視力障礙的首要原因之一。目前關(guān)于DR的發(fā)病機(jī)制包括以下假說：炎癥免疫機(jī)制、氧化應(yīng)激學(xué)說、生物化學(xué)分子生物學(xué)機(jī)制、神經(jīng)退行性改變和基因多態(tài)性。幾種機(jī)制相互包含，互為因果從而共同構(gòu)成復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制[11]。早期，血糖升高即可使視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷，細(xì)胞大量凋亡，損傷不可逆[12]，且這種損傷是DR發(fā)生的基礎(chǔ)[13]。視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞是DR的主要參與者[14]，故為研究DR病變過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡及增殖等狀態(tài)以及細(xì)胞狀態(tài)的影響因素，本實驗選擇HRMECs作為體外培養(yǎng)觀察的細(xì)胞。

細(xì)胞凋亡是一種程序化選擇性細(xì)胞死亡，受到嚴(yán)格調(diào)控，需要多種因子、蛋白的參與并協(xié)調(diào)，和生物化學(xué)與形態(tài)表達(dá)關(guān)系密切[15]。很多常見眼病都伴有視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡如：視網(wǎng)膜脫離、年齡相關(guān)性黃斑變性、缺血性視網(wǎng)膜損傷、視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性變、青光眼等。高糖環(huán)境可以使視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、視網(wǎng)膜內(nèi)核層細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮層細(xì)胞以及視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加。糖尿病早期就見到視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡和血管細(xì)胞凋亡[16]。體外研究表明，人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞在高糖培養(yǎng)下凋亡升高，以培養(yǎng)24 h細(xì)胞凋亡率升高較明顯[17]。Bcl-2抑制凋亡，Bax促進(jìn)凋亡，而Caspase-3為凋亡執(zhí)行蛋白酶，占據(jù)凋亡過程中的核心地位[18]，Caspase激活是凋亡過程中具有標(biāo)志性的反應(yīng)。凋亡過程的信號傳導(dǎo)中，Bax、Bcl-2不僅是蛋白酶caspase-3的上游調(diào)控蛋白，也是蛋白酶caspase-3的直接作用底物，二者既相互聯(lián)系又相互制約。本實驗采用流式細(xì)胞儀檢測了凋亡率；采用免疫印跡法檢測了凋亡過程中相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達(dá)水平。實驗結(jié)果顯示，相比對照組，高糖組細(xì)胞凋亡率及Caspase-3、Bax的表達(dá)量明顯升高，Bcl-2的表達(dá)量明顯降低，表明高糖刺激可以明顯增加HRMECs細(xì)胞凋亡。另外本實驗還檢測HRMECs增殖率，結(jié)果顯示高糖組的細(xì)胞增殖率較對照組明顯下降，表明細(xì)胞凋亡增加是高糖導(dǎo)致細(xì)胞增殖活力下降的一個原因。

APN是一種具有生物活性的內(nèi)源性多肽，由脂肪細(xì)胞分泌，可降低肝糖輸出、促進(jìn)糖轉(zhuǎn)運(yùn)、加速脂肪酸氧化[19,20]，在正常人其血漿濃度為3～30 μg/ml[21]。有研究表明，APN是通過對一氧化氮和ET-1分泌的影響以及對內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶活性的影響來維持正常內(nèi)皮細(xì)胞的功能，并對腫瘤壞死因子α所致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷起保護(hù)作用[19,20]。APN是視網(wǎng)膜病理性微血管形成的負(fù)向調(diào)控者[6]，在缺血性視網(wǎng)膜病變進(jìn)程中發(fā)揮視網(wǎng)膜血管的保護(hù)作用[22]。本實驗研究了APN對高糖下HRMECs的作用，研究結(jié)果顯示，高糖下細(xì)胞凋亡明顯增加，細(xì)胞增殖明顯下降，但高糖培養(yǎng)前加入APN干預(yù)2 h后細(xì)胞凋亡明顯受抑制，增殖率明顯好轉(zhuǎn)，表明細(xì)胞凋亡增加是高糖導(dǎo)致細(xì)胞增殖活力下降的原因之一，且APN可以抑制高糖下HRMECs細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活及增殖，從而起到保護(hù)作用。

本研究團(tuán)隊前期通過體外培養(yǎng)細(xì)胞RF/6A，發(fā)現(xiàn)APN可以促進(jìn)高糖條件下細(xì)胞的存活與增殖，抑制細(xì)胞的凋亡[7]。本次研究是前期研究的延伸。本次使用HRMECs作為培養(yǎng)細(xì)胞，沒有了物種基因差異，更能貼近DR病變發(fā)生發(fā)展的本質(zhì)，更有說服力；不同于前期實驗APN是加入高糖培養(yǎng)基對細(xì)胞作用48 h，本次實驗使用同樣濃度的APN只在細(xì)胞高糖培養(yǎng)前干預(yù)2 h，結(jié)果依然顯示APN有明顯作用效果，提示APN的起效較快，作用時間可以縮短到2 h；另外本次實驗較前期實驗增加了凋亡執(zhí)行蛋白酶caspase-3的檢測，caspase-3可促進(jìn)染色質(zhì)濃縮，大范圍降解細(xì)胞內(nèi)蛋白，促進(jìn)形成凋亡小體[23]，最終使細(xì)胞走向不可逆死亡，故Caspase-3的水平更能直接反應(yīng)細(xì)胞凋亡狀態(tài)。

綜上所述，高糖誘導(dǎo)下HRMECs凋亡增加，增殖下降，凋亡增加是高糖導(dǎo)致細(xì)胞增殖活力下降的原因之一，但APN預(yù)處理可以抑制高糖條件下細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的存活及增殖，從而起到保護(hù)作用。APN是否還通過其他途徑發(fā)揮其保護(hù)作用，需要進(jìn)一步研究。