周雅卿,魏 星,馬 莉,李維妙,單昌友,劉偉東,張淑群,趙永林*

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科,西安 710004;2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科;3西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨二科;*通訊作者,E-mail:zhaoyonglinlin@163.com)

化療引起的周?chē)窠?jīng)病變(chemotherapy-induced peripheral neuropathy，CIPN)是癌癥患者化療期間的一種常見(jiàn)不良反應(yīng)，其癥狀通常有四肢末端的感覺(jué)異常、麻木及疼痛等，部分病人常因不能耐受CIPN而導(dǎo)致化療劑量減少，化療延遲，甚至化療中止，患者的治療效果以及生活質(zhì)量都受到了一定程度的影響[1]。紫杉類(lèi)化療藥物是引起CIPN的常見(jiàn)藥物之一，相關(guān)研究表明這可能與紫杉醇及其溶劑(聚氯乙基-35-蓖麻油)有關(guān)[2]，故基于消除溶劑型紫杉醇(sb-PTX)的用藥安全缺陷及更大的臨床獲益，白蛋白結(jié)合型紫杉醇(nab-PTX)由此誕生。由于其EPR效應(yīng)(腫瘤高滲透高滯留效應(yīng))以及白蛋白可與腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的SPARC蛋白受體(富含半胱氨酸的酸性蛋白受體)結(jié)合，使紫杉醇在腫瘤組織中濃度更高，減少其他組織系統(tǒng)的毒副作用，且其為水溶性，避免了紫杉醇注射液中聚氯乙基-35-蓖麻油可能導(dǎo)致的CIPN[3]。然而，有研究表明相較于溶劑型紫杉醇及多西他賽，nab-PTX所導(dǎo)致的CIPN的發(fā)生率及嚴(yán)重程度更高[4]。目前，臨床常應(yīng)用維生素B、維生素E預(yù)防CIPN，以及使用非甾體類(lèi)抗炎藥緩解疼痛，但往往收效甚微。

對(duì)于紫杉類(lèi)藥物相關(guān)CIPN機(jī)制尚不完全清楚，一些研究認(rèn)為其與神經(jīng)細(xì)胞微管損傷或線粒體損傷導(dǎo)致神經(jīng)軸突運(yùn)輸功能障礙有關(guān)[5]。現(xiàn)今蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已常用于探索疾病機(jī)制或轉(zhuǎn)歸，其中串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽法(tandem mass tags，TMT)可進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定及定量對(duì)比。本研究擬通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽法探究nab-PTX所致CIPN可能的作用機(jī)制，為CIPN的預(yù)防及治療提供一定的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供6只6～8周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～270 g，許可證號(hào)：SCXK(陜)08-018，本實(shí)驗(yàn)符合西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理指南。

1.2 主要試劑

注射用紫杉醇(白蛋白結(jié)合型)(每瓶含100 mg紫杉醇及約900 mg人血白蛋白，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20183044，石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，TMT試劑、乙腈購(gòu)于賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，十二烷基磺酸鈉購(gòu)于卡邁舒(上海)生物科技有限公司，測(cè)序級(jí)胰蛋白酶購(gòu)于上海普洛麥格生物制品有限公司，蛋白抑制劑、尿素、三氯乙酸(TCA)、四乙基溴化銨(TEAB)、二硫蘇糖醇(DL-Dithiothreitol,DTT)及碘乙酰胺(iodoacetamide,IAM)購(gòu)于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司,丙酮購(gòu)于杭州漢諾化工有限公司。

1.3 CIPN大鼠模型制備

6～8周齡性SD大鼠(清潔級(jí))共6只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組，每組3只。參考既往紫杉醇致大鼠周?chē)窠?jīng)病變模型構(gòu)建方法[6]，實(shí)驗(yàn)組大鼠分別于第1，3，5，7天，腹腔注射白蛋白結(jié)合型紫杉醇(25 mg nab-PTX溶解于10 ml生理鹽水)10 mg/kg，建立nab-PTX致周?chē)窠?jīng)病變大鼠模型；對(duì)照組大鼠不進(jìn)行特殊干預(yù)繼續(xù)正常培養(yǎng)。期間每日觀察兩組大鼠狀態(tài)、飲食及糞便情況，并隔日稱(chēng)量體質(zhì)量。

1.4 取材及樣品制備

末次給藥48 h后，腹腔麻醉兩組大鼠后快速開(kāi)胸，經(jīng)左心室插管至主動(dòng)脈后開(kāi)始灌注生理鹽水，待流出液清亮后解剖分離L4-6脊髓，置于無(wú)菌凍存管后，于干冰中凍存。

1.5 蛋白提取及肽段標(biāo)記

稱(chēng)取適量大鼠脊髓于預(yù)冷研缽中，加液氮充分研磨至粉末后加入裂解緩沖液(8 mol/L尿素，1%蛋白酶抑制劑)超聲裂解,離心(4 ℃，12 000g)10 min，取上清液，蛋白濃度由BCA試劑盒測(cè)定。各取等量樣品蛋白酶解后加適量標(biāo)準(zhǔn)蛋白。沿管壁加入終濃度20%三氯乙酸(TCA)渦旋混勻后低溫沉淀2 h后離心(4 500g)5 min，沉淀用預(yù)冷丙酮洗滌2～3次，干燥后加200 mmol/L四乙基溴化銨(TEAB)，超聲打散沉淀后酶解過(guò)夜。加入二硫蘇糖醇(DTT)至終濃度為5 mmol/L，56 ℃還原30 min后加入碘乙酰胺(IAM)至終濃度為11 mmol/L，孵育15 min(室溫避光)。酶解肽段除鹽干燥后用0.5 mmol/L TEAB溶解后與TMT標(biāo)記試劑混合，室溫孵育2 h后除鹽干燥。標(biāo)記后的肽段可進(jìn)行高效液相色譜分級(jí)及液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)分析。

1.6 生物信息學(xué)分析

利用MaxQuant軟件Rattus_norvegicus_10116_PR_20210721.fasta(29 934條序列)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行蛋白鑒定及差異顯著性判斷，將其相對(duì)定量值在比較組中進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P值作為顯著性指標(biāo)，當(dāng)P<0.05，且差異表達(dá)量變化超過(guò)1.3為顯著上調(diào)的差異蛋白，小于1/1.3則為顯著下調(diào)的差異蛋白。用費(fèi)希爾精確檢驗(yàn)方法進(jìn)行差異蛋白GO分析及KEGG富集通路分析，P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

兩組大鼠期間均未出現(xiàn)死亡，給藥前48 h對(duì)6只大鼠進(jìn)行稱(chēng)量，體質(zhì)量250～270 g，實(shí)驗(yàn)期間對(duì)照組大鼠飲食正常，狀態(tài)活躍，糞便為黑色顆粒狀，體質(zhì)量穩(wěn)定增加。實(shí)驗(yàn)組大鼠食量減少，精神萎靡，活動(dòng)減少，糞便為暗黃色水樣便，體質(zhì)量逐漸下降(見(jiàn)圖1)。

圖1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)期間體質(zhì)量變化Figure 1 Changes of rat body weight after administration in experimental group and control group

2.2 蛋白質(zhì)鑒定與差異蛋白統(tǒng)計(jì)結(jié)果

利用MaxQuant軟件Rattus_norvegicus_10116_PR_20210721.fasta(29 934條序列)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行蛋白鑒定及分析,共鑒定出5 519種蛋白。對(duì)4 730種蛋白進(jìn)行定量分析，計(jì)算各種蛋白在兩組樣本間表達(dá)量的差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)。共鑒定出370種差異蛋白，當(dāng)P<0.05，F(xiàn)C>1.3作為顯著上調(diào)的變化閾值，F(xiàn)C<1/1.3作為顯著下調(diào)的變化閾值。由此得到：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照相比，差異蛋白中下調(diào)蛋白207種，上調(diào)蛋白163種(見(jiàn)圖2)。部分差異倍數(shù)大的蛋白(見(jiàn)表1)。

圖2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異蛋白火山圖Figure 2 Volcano plot of differential protein between experimental group and control group

表1 部分變化倍數(shù)大的差異蛋白

2.3 差異蛋白GO(gene ontology)分類(lèi)富集分析結(jié)果

依據(jù)相關(guān)細(xì)胞組成(cellular component,CC)、生物學(xué)過(guò)程(biological process,BP)及分子功能(molecular function,MF)進(jìn)行分類(lèi)分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異蛋白富集于細(xì)胞胞內(nèi)，主要參與細(xì)胞過(guò)程、生物調(diào)節(jié)及刺激反應(yīng)等生物過(guò)程，多數(shù)具有結(jié)合、催化活性等分子功能(見(jiàn)圖2)。

圖3 實(shí)驗(yàn)組對(duì)比對(duì)照組的差異蛋白GO分析Figure 3 GO analysis of differential proteins between experimental group and control group

2.4 差異表達(dá)蛋白KEGG通路富集分析結(jié)果

對(duì)兩組差異蛋白(上調(diào)：78個(gè)，下調(diào)：250個(gè))分別進(jìn)行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，差異蛋白主要富集于哮喘(asthma)、類(lèi)固醇生物合成(steroid biosynthesis)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus)、Notch信號(hào)通路(Notch signaling pathway)等通路(見(jiàn)圖3)。

3 討論

CIPN是腫瘤患者化療過(guò)程中一種常見(jiàn)的劑量相關(guān)性不良反應(yīng)，特別是紫杉烷類(lèi)化療藥物中。nab-PTX作為一種安全性更高的紫杉烷類(lèi)藥物，自2005年FDA批準(zhǔn)nab-PTX上市后，相關(guān)研究隨之進(jìn)行，部分學(xué)者認(rèn)為其相對(duì)更高的藥物濃度可能會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的CIPN。在Guo等[4]進(jìn)行的一項(xiàng)薈萃分析中，nab-PTX所致的CIPN的發(fā)生率和嚴(yán)重程度均高于溶劑型紫杉醇。

紫杉烷類(lèi)相關(guān)性CIPN常表現(xiàn)為四肢對(duì)稱(chēng)性的感覺(jué)異常、麻木或神經(jīng)性疼痛，運(yùn)動(dòng)障礙少見(jiàn)，嚴(yán)重影響了腫瘤患者的治療及生活質(zhì)量，部分研究表明CIPN具有成為永久性副作用的可能[5]。除了美國(guó)臨床腫瘤推薦使用度洛西汀治療CIPN，目前對(duì)于CIPN的預(yù)防及治療仍缺乏有效的方法。

圖4 實(shí)驗(yàn)組對(duì)比對(duì)照組差異蛋白KEGG通路富集氣泡圖Figure 4 Enriched bubble chart of KEGG pathway between experimental group and control group

據(jù)報(bào)道，CIPN的相關(guān)危險(xiǎn)因素有：1)既往接受神經(jīng)毒性藥物治療；2)糖尿??；3)缺乏葉酸/維生素B12；4)非洲人種；5)高齡等[7]。其中，患有糖尿病有可能導(dǎo)致CIPN恢復(fù)延遲[8]。目前對(duì)于紫杉烷類(lèi)相關(guān)CIPN的機(jī)制尚不完全清楚，部分研究稱(chēng)其與氧化應(yīng)激和鞘脂異常有關(guān)[9-11]。氧化應(yīng)激的產(chǎn)生主要來(lái)源于線粒體呼吸鏈[12]，線粒體異常是CIPN發(fā)生的主要機(jī)制。在紫杉醇致CIPN動(dòng)物模型中，紫杉醇可致使線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，導(dǎo)致線粒體膜去極化和Ca2+釋放，導(dǎo)致感覺(jué)神經(jīng)軸突內(nèi)線粒體腫脹及空泡化[6]。顯著上調(diào)的激肽原1(KNG1)是一種緩激肽，在炎癥和氧化應(yīng)激中起重要作用，在小鼠心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的KNG1可以加重阿霉素引起的線粒體氧化應(yīng)激損傷[13]。鞘脂構(gòu)成了多種脂質(zhì)，在膜生物學(xué)和細(xì)胞功能中有重要作用，并且其在神經(jīng)組織中含量很高，有研究表明鞘脂代謝異常與神經(jīng)管畸形、遺傳性感覺(jué)和自主神經(jīng)病1型等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)[14]，在實(shí)驗(yàn)中觀察到在鞘脂代謝通路(sphingolipid metabolism)中，絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(serine palmitoyl transferase，SPT)顯著下調(diào)，SPT是真核細(xì)胞中鞘脂從頭合成的第一個(gè)限速酶。但在另一項(xiàng)研究中顯示，紫杉醇可使SPT表達(dá)上調(diào)[9]，故紫杉醇對(duì)鞘脂代謝的影響仍需進(jìn)一步研究。 在本研究結(jié)果中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差異蛋白KEGG通路富集分析顯示，nab-PTX可通過(guò)類(lèi)固醇生物合成(steroid biosynthesis)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)、Notch信號(hào)通路(Notch signaling pathway)及葉酸生物合成(folate biosynthesis)等通路發(fā)揮作用。Notch信號(hào)通路在血管發(fā)生、細(xì)胞增殖和遷移、免疫應(yīng)答和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等許多生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道，前扣帶回皮層在周?chē)窠?jīng)損傷引起的疼痛超敏反應(yīng)中有重要作用，在神經(jīng)性疼痛誘導(dǎo)的痛覺(jué)傳遞過(guò)程中前扣帶回皮層中的神經(jīng)元的Notch信號(hào)通路中，腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)化酶(TACE/ADAM17)在實(shí)驗(yàn)組中顯著上調(diào)，在經(jīng)典N(xiāo)otch信號(hào)通路中，TACE作用于其第2個(gè)裂解點(diǎn)，裂解為2個(gè)片段，被配體表達(dá)的胞外區(qū)裂解產(chǎn)物被細(xì)胞吞噬，經(jīng)γ-分泌酶作用裂解，C端裂解產(chǎn)物在跨膜區(qū)的第3個(gè)裂解點(diǎn)釋放為NICD(Notch蛋白的活化形式)[15-18]。顯著上調(diào)的TACE使神經(jīng)元中NICD水平升高，促進(jìn)其下游效應(yīng)因子Hes1和Hes5轉(zhuǎn)錄，Hes1表達(dá)的調(diào)節(jié)對(duì)神經(jīng)性疼痛有顯著影響[19]?？傊?，Notch/Hes1通路的激活可能使興奮性突觸傳遞增強(qiáng)，從而導(dǎo)致了周?chē)窠?jīng)損傷后的持續(xù)性疼痛。另外，在軸突再生(axon regeneration)參考通路圖中觀察到顯著上調(diào)的Notch1抑制了軸突再生，但目前尚未有明確研究說(shuō)明Notch1對(duì)軸突的影響。

在細(xì)胞組成中，顯著上調(diào)的差異蛋白主要富集于軸突，相較于其他組織，紫衫醇主要濃集于背根神經(jīng)節(jié)[20]。載脂蛋白E(ApoE)是細(xì)胞外顯著上調(diào)的差異蛋白，有報(bào)道稱(chēng)ApoE與外周神經(jīng)損傷后再生有關(guān)，ApoE在神經(jīng)元中高度合成和分泌，以促進(jìn)自身軸突生長(zhǎng)，抑制或敲除其結(jié)合受體后軸突生長(zhǎng)受到影響[21]。Zhou等[22]研究發(fā)現(xiàn)在幼齡小鼠中，短期高脂飲食可使ApoE表達(dá)趨于正常，減輕周?chē)窠?jīng)病變并促進(jìn)髓鞘形成。

綜上所述，此次研究采用TMT定量蛋白組學(xué)法分析了nab-PTX引起CIPN的可能機(jī)制，對(duì)篩選出的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析后顯示，KNG1、ApoE、SPT、TACE等可能是nab-PTX作用的重要靶點(diǎn)，nab-PTX可能通過(guò)鞘脂代謝通路(sphingolipid metabolism)、Notch信號(hào)通路(Notch signaling pathway)及葉酸生物合成(folate biosynthesis)等通路引起CIPN。后續(xù)研究需明確這些蛋白及通路在nab-PTX相關(guān)CIPN中的作用。