王 力,馬 莉,賈麗君,周雅卿,趙永林

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:zhaoyonglinlin@163.com)

較之于傳統(tǒng)的溶劑型紫杉醇，白蛋白結(jié)合型紫杉醇劑量使用更高，過敏反應(yīng)更少，用藥前無需預(yù)處理。白蛋白結(jié)合型紫杉醇常見的不良反應(yīng)是劑量限制性的神經(jīng)毒性，表現(xiàn)為局部有灼熱感、刺痛或肌肉痛等，也稱為神經(jīng)病理性疼痛，對患者的生活質(zhì)量造成嚴重影響[1]。臨床常用的止疼藥物不能有效緩解紫杉醇導致的神經(jīng)病理性疼痛，紫杉醇導致神經(jīng)病理性疼痛的機制仍需進一步探討。

高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)主要參與DNA的修復(fù)、轉(zhuǎn)錄和基因組穩(wěn)定，具有促進炎癥、免疫、凋亡等作用[2]。既往發(fā)現(xiàn)HMGB1參與多種疼痛的發(fā)生、發(fā)展，在慢性炎性疼痛、慢性縮窄性損傷、糖尿病神經(jīng)性疼痛等動物模型中，HMGB1的表達升高，而抑制HMGB1可以使疼痛緩解[3-5]。此外，HMGB1及其受體Toll樣受體-4(Toll-like receptor 4，TLR4)也參與紫杉醇導致的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生，但HMGB1及其抑制劑Glycyrrhizin在白蛋白結(jié)合型紫杉醇導致的神經(jīng)病理性疼痛的作用及機制尚不明確[6]。本研究通過建立白蛋白結(jié)合型紫杉醇所致的神經(jīng)病理性疼痛模型，探究HMGB1抑制劑Glycyrrhizin是否可緩解白蛋白結(jié)合型紫杉醇導致的神經(jīng)病理性疼痛，并探討其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組

8～10周齡SPF級雄性SD大鼠54只，體質(zhì)量為250～300 g，購自西安交通大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號:SCXK(陜西)2006-001，大鼠飼養(yǎng)于24 ℃的恒溫環(huán)境中，自由飲水。將大鼠隨機分為對照組、紫杉醇組和紫杉醇+Glycyrrhizin(Gly)組，每組18只。

1.2 主要試劑與儀器

白蛋白結(jié)合型紫杉醇(粉劑，規(guī)格：100 mg，純度：99%，生產(chǎn)批號：B04190425)購自石藥集團歐意藥業(yè)有限公司，Glycyrrhizin購自美國Sigma-Aldrich公司，HMGB1、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、神經(jīng)微絲輕鏈蛋白(neurofilament light，NF-L)、神經(jīng)微絲中鏈蛋白(neurofilament medium，NF-M)抗體、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)購自美國Cell Signaling Technology公司，離子鈣接頭蛋白(ionized calcium bindingadaptor molecule-1，Iba-1)抗體購自日本W(wǎng)ako公司，TLR4抗體購自英國Abcam公司，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司。免疫組化SP試劑盒、DAB顯色盒購自北京中杉金橋公司，RIPA裂解液、蛋白含量檢測試劑盒、Western blot相關(guān)試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。電子Von-Frey測痛儀購自美國IITC公司。

1.3 神經(jīng)病理性疼痛模型制備

生理鹽水溶解白蛋白結(jié)合型紫杉醇，紫杉醇組大鼠實驗開始第1，3，5，7天腹腔注射，單次給藥劑量為2.47 mg/kg，共注射4次，紫杉醇最終累積劑量為9.9 mg/kg[7]。紫杉醇+Gly組：除了腹腔注射白蛋白結(jié)合型紫杉醇外(第1，3，5，7天腹腔注射，每次2.47 mg/kg)，實驗開始后每天腹腔注射Glycyrrhizin 50 mg/kg，連續(xù)7 d[8]。對照組第1，3，5，7天腹腔注射同劑量的生理鹽水。實驗第8天處死大鼠，取L4-6組脊髓。

1.4 大鼠神經(jīng)痛的行為學檢測

采用von Frey細絲和熱刺激儀于實驗開始前(day 0)、實驗開始后第4天(day 4)和第8天(day 8)對大鼠進行行為學測試。將von Frey細絲實驗測定的機械刺激縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和熱刺激實驗測定的熱刺激縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)作為行為學評價指標。

熱刺激縮足反射潛伏期測定：將單只大鼠置于透明的玻璃箱中，使其在安靜的環(huán)境中適應(yīng)30 min，采用熱痛刺激儀分別照射大鼠左后足底部，當大鼠出現(xiàn)特征性舔爪或提爪時為陽性反應(yīng)，停止照射，記錄大鼠響應(yīng)熱刺激的潛伏時間(s)即為TWL。每只大鼠測試5次，每次間隔5 min。

機械刺激縮足反射閾值測定：大鼠于塑料盒中適應(yīng)30 min，用代表不同壓力(最小0.4 g，最大26.0 g)的Von Frey探針刺激大鼠右后足，每次持續(xù)5 s，當大鼠出現(xiàn)快速縮足定義為陽性反應(yīng)，記錄此時刺激壓力，計算大鼠的MWT(g)，每只大鼠測試5次，每次刺激間隔大于2 min，取平均值。

1.5 Western blot檢測TLR4及NF-κB的表達

取大鼠脊髓，勻漿后加入適量蛋白裂解液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)煮沸變性，用10% SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜。用5%脫脂奶粉在室溫封閉1 h，加入相應(yīng)一抗：β-actin(1 ∶1 000)、TLR4(1 ∶1 000)、NF-κB(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗，用相應(yīng)的二抗在室溫孵育PVDF膜1 h?；瘜W發(fā)光成像系統(tǒng)顯影、成像。采用Image J圖像分析軟件分析各條帶。以TLR4、NF-κB蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值表示TLR4、NF-κB蛋白的相對表達量。

1.6 免疫組化染色檢測GFAP、Iba-1、NF-L、NF-M及HMGB1在脊髓組織中的表達

大鼠L4-6脊髓組織經(jīng)常規(guī)石蠟包埋后切片，常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，用過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶，高壓修復(fù)抗原，室溫封閉30 min，分別加入HMGB1抗體(1 ∶200)、NF-L抗體(1 ∶200)、NF-M抗體(1 ∶200)、Iba-1抗體(1 ∶400)、GFAP抗體(1 ∶200)，4℃過夜。切片漂洗后二抗37 ℃孵育30 min，辣根酶標記鏈霉卵白素37 ℃孵育30 min。DAB顯色、蘇木素溶液復(fù)染，梯度乙醇脫水、封片。每張切片隨機選取6個視野，Leica-Q550CW圖像分析系統(tǒng)采集圖像。結(jié)果用免疫組化評分表示，評分為染色強度與陽性細胞數(shù)的乘積。染色分為無染色、輕度、中度、重度，分值分別為0，1，2，3分。陽性細胞數(shù)百分比評分：無染色，0分；1%～10%細胞染色，1分；11%～50%，2分；51%～80%，3分，81%～100%，4分。故免疫組化評分最高為12分，最低0分。

1.7 ELISA檢測炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的水平

取-80 ℃保存的各組大鼠脊髓組織上清液，使用自動分光光度計，采用ELISA試劑盒按照說明書步驟檢測脊髓組織上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，二抗?jié)舛? ∶5 000，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，計算樣品濃度。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 抑制HMGB1對白蛋白結(jié)合型紫杉醇導致的神經(jīng)病理性疼痛的影響

實驗開始后第4，8天，與對照組相比，紫杉醇組MWT和TWL的值均明顯降低(P<0.05)，提示神經(jīng)病理性疼痛模型構(gòu)建成功；與紫杉醇組相比，紫杉醇+Gly組MWT、TWL的值均升高(P<0.05，見圖1)。

與對照組相比，*P<0.05；與紫杉醇組相比，#P<0.05圖1 Glycyrrhizin減輕大鼠的神經(jīng)病理性疼痛FIgure 1 Glycyrrhizin alleviates neuropathic pain of rats

2.2 Glycyrrhizin對神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓神經(jīng)微絲蛋白表達的影響

對照組脊髓NF-L、NF-M幾乎不表達，HMGB1的表達較少；與對照組相比，紫杉醇組HMGB1及神經(jīng)微絲蛋白NF-L、NF-M的表達均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與紫杉醇組相比，紫杉醇+Gly組HMGB1、NF-L、NF-M的表達均減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖2)。

HMGB1主要陽性表達于神經(jīng)細胞的細胞核，少量在細胞質(zhì)；NF-M及NF-L主要陽性表達于神經(jīng)細胞軸突與對照組相比，*P<0.05；與紫杉醇組相比，#P<0.05圖2 大鼠脊髓組織中HMGB1及神經(jīng)微絲蛋白的表達變化FIgure 2 Expression of HMGB1 and neurofilament protein in spinal cord of rats

2.3 Glycyrrhizin對神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓中膠質(zhì)細胞活化的影響

對照組大鼠脊髓GFAP及Iba-1的表達較少；與對照組相比，紫杉醇組大鼠脊髓組織中GFAP及Iba-1的表達明顯升高；與紫杉醇組相比，紫杉醇+Gly組GFAP及Iba-1的表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖3)，提示HMGB1抑制劑可抑制白蛋白結(jié)合型紫杉醇介導的膠質(zhì)細胞活化。

GFAP主要陽性表達于星形膠質(zhì)細胞胞質(zhì)，Iba-1主要陽性表達于小膠質(zhì)細胞胞質(zhì)與對照組相比，*P<0.05；與紫杉醇組相比，#P<0.05圖3 Glycyrrhizin抑制神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓中的膠質(zhì)細胞活化FIgure 3 Glycyrrhizin inhibits glial response in the spinal cord of rat with neuropathic pain

2.4 Glycyrrhizin對神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓中TLR4/NF-κB通路的影響

與對照組相比，紫杉醇組大鼠L4-6脊髓組織中TLR4及NF-κB的表達明顯升高；與紫杉醇組相比，紫杉醇+Gly組TLR4及NF-κB的表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖4)，提示HMGB1可能通過TLR4/NF-κB通路參與白蛋白結(jié)合型紫杉醇介導的神經(jīng)病理性疼痛。

與對照組相比，*P<0.05；與紫杉醇組相比，#P<0.05圖4 大鼠脊髓TLR4及NF-κB的表達水平FIgure 4 The expression levels of TLR4 and NF-κB in the rat spinal cord

2.5 Glycyrrhizin對神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓組織中炎性因子水平的影響

ELISA結(jié)果顯示，對照組中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均較低；與對照組相比，紫杉醇組大鼠L4-6脊髓組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量升高(P<0.05)；而與紫杉醇組相比，紫杉醇+Gly組炎性因子的水平則降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖5)。

與對照組相比，*P<0.05;與紫杉醇組相比，#P<0.05圖5 神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平FIgure 5 Levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in the spinal cord of rats with neuropathic pain

3 討論

神經(jīng)毒性是紫杉醇藥物常見的不良反應(yīng)之一，尤其是白蛋白結(jié)合型紫杉醇的神經(jīng)毒性發(fā)生率更高，且尚無有效的緩解方法，因此闡明紫杉醇所致神經(jīng)毒性的潛在機制顯得尤其重要。HMGB1是具有促炎作用的核蛋白，可與TLR4結(jié)合，激活下游的NF-κB等信號通路，促進炎性細胞因子釋放，本研究探究了HMGB1/TLR4通路在白蛋白結(jié)合型紫杉醇導致的神經(jīng)病理性疼痛中的作用。

本研究中給予大鼠腹腔注射白蛋白結(jié)合型紫杉醇后，能成功誘導神經(jīng)病理性疼痛，L4-6脊髓組織中HMGB1的表達明顯升高，而給予HMGB1的抑制劑后，HMGB1的表達減少，大鼠MWT、TWL等行為學改善，提示白蛋白結(jié)合型紫杉醇誘導的脊髓組織中HMGB1的升高可能與神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)。既往研究也發(fā)現(xiàn)HMGB1與多種類型的神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)[3-5,9-11]。在慢性炎性疼痛模型及慢性縮窄性損傷模型中，大鼠脊髓HMGB1被激活、釋放，HMGB1被抑制后可以緩解疼痛[3,4,9]。在纖維肌痛及糖尿病神經(jīng)性疼痛的模型中，HMGB1的表達也升高，且與疼痛的發(fā)生有關(guān)[5,10]。此外，在紫杉醇、奧沙利鉑或長春新堿處理的嚙齒動物中，抑制或降低HMGB1的水平可以減輕化療導致的周圍神經(jīng)病變，HMGB1似乎是疼痛發(fā)生的共同啟動因子[11]。

本研究中HMGB導致的神經(jīng)病理性疼痛可能與其介導的脊髓神經(jīng)微絲蛋白紊亂有關(guān)。神經(jīng)微絲蛋白是特異性表達于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元及其軸突中的細胞骨架主要結(jié)構(gòu)單位。神經(jīng)微絲蛋白由輕型(NF-L)、中型(NF-M)、重型(NF-H)蛋白和α-介連蛋白組成。神經(jīng)微絲蛋白在神經(jīng)元胞體或軸突的異常堆積是運動神經(jīng)元疾病的標志，也被認為是神經(jīng)元軸突降解的標志物。而本研究結(jié)果提示紫杉醇作用大鼠后，脊髓組織中NF-L、NF-M的表達明顯升高，提示紫杉醇導致的軸突損傷可能與疼痛的發(fā)生有關(guān)，而抑制HMGB1的表達可降低NF-L、NF-M的表達，并緩解紫杉醇導致的神經(jīng)病理性疼痛。最新研究也表明：在新型冠狀病毒性肺炎康復(fù)后伴有慢性疼痛的患者血清中，NF-L的水平明顯升高，NF-L可能作為COVID-19持續(xù)性神經(jīng)性疼痛的潛在生物標志物[12]。在大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎構(gòu)建的疼痛模型中，NF-L多肽的水平升高，而miR-7a可通過抑制NF-L多肽，阻斷轉(zhuǎn)錄信號通路激活因子，改善神經(jīng)性疼痛[13]。神經(jīng)微絲蛋白在疼痛發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明確，其參與疼痛發(fā)生的機制仍需進一步研究。

HMGB1是TLR4的配體之一，二者結(jié)合后可激活Toll-IL-1受體同源區(qū)，激活下游NF-κB相關(guān)信號通路，誘導多種炎癥因子的表達及釋放，導致熱痛覺過敏，最終引起神經(jīng)性疼痛[14]。既往研究也表明TLR4/NF-κB參與多種疼痛的病理過程，在術(shù)后疼痛、慢性收縮性損傷導致的疼痛、糖尿病神經(jīng)性疼痛及化療藥物導致的神經(jīng)病理性疼痛模型中，TLR4/NF-κB通路均過度激活，本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果一致[15-18]。且本研究中減少HMGB1的表達則可通過抑制TLR4/NF-κB通路減輕白蛋白結(jié)合型紫杉醇導致的病理性疼痛。炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6可導致神經(jīng)病理性疼痛，TNF-α、IL-1β和IL-6受體拮抗劑可有效緩解神經(jīng)病理性疼痛動物模型的痛覺過敏[19,20]，但是炎性因子導致疼痛發(fā)生的作用機制尚不明確，需進一步研究。

綜上，白蛋白結(jié)合型紫杉醇作用大鼠后，可誘導脊髓HMGB1表達升高，HMGB1抑制劑可通過抑制TLR4/NF-κB通路、減少炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放，減輕細胞骨架紊亂，緩解神經(jīng)病理性疼痛。