魏 星,馬 莉,李維妙,周雅卿,趙永林*

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710004;2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科;*通訊作者,E-mail:zhaoyonglinlin@163.com)

神經(jīng)毒性是紫杉類藥物的主要?jiǎng)┝肯拗菩愿弊饔?常見有外周感覺性的痛覺過敏、灼痛、刺痛和麻木等不適癥狀。白蛋白結(jié)合型紫杉醇是紫杉醇與人血白蛋白結(jié)合制成的納米微粒，與傳統(tǒng)劑型紫杉醇相比，白蛋白結(jié)合型紫杉醇的使用劑量更大，提高了療效，但同時(shí)也加重了紫杉醇藥物的不良反應(yīng)[1]。部分患者因無法耐受神經(jīng)毒性而選擇減量或者更換藥物，治療效果下降，因此闡明紫杉醇誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制顯得尤為重要。

高遷移率族蛋白B1(high-mobility group protein B1，HMGB1)是主要存在于細(xì)胞核的內(nèi)源性危險(xiǎn)性信號(hào)分子。Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)是一種參與非特異性免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)分子[2]。HMGB1是TLR4的內(nèi)源性配體之一，以HMGB1/TLR4通路為靶點(diǎn)可減輕脊神經(jīng)損傷所致的神經(jīng)性疼痛，HMGB1/TLR4通路也與紫杉醇所致的神經(jīng)性疼痛有關(guān)，但是其機(jī)制尚不清楚，且HMGB1/TLR4通路在白蛋白結(jié)合型紫杉醇所致的神經(jīng)毒性中的作用也不明確[3]。本研究通過建立白蛋白結(jié)合型紫杉醇所致的神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型，研究HMGB1/TLR4通路相關(guān)蛋白及下游炎性因子的表達(dá)變化，為揭示紫杉醇所致的神經(jīng)性病理痛的病理生理機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組

8～10周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(陜西)2006-001。大鼠于25 ℃的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，被隨機(jī)分為對(duì)照組和紫杉醇組，每組18只，每組6只用于形態(tài)學(xué)及免疫組化檢測(cè)，6只用于Western blot檢測(cè)，6只用于ELISA檢測(cè)炎性因子水平。

1.2 主要儀器與試劑

白蛋白結(jié)合型紫杉醇(粉劑，規(guī)格：100 mg，純度：99%，生產(chǎn)批號(hào)：B04190425)購(gòu)自石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，Von Frey細(xì)絲購(gòu)自美國(guó)Stoelting公司，熱痛刺激儀BME2410A購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司，內(nèi)參抗體β-actin、MyD88、TRIF、IRF3、GFAP抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，Iba-1抗體購(gòu)自日本W(wǎng)ako公司，HMGB1、TLR4抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，山羊抗兔SP試劑盒(IgG抗體)、DAB顯色盒購(gòu)自北京中杉金橋公司，RIPA裂解液、蛋白含量檢測(cè)試劑盒、Western blot相關(guān)試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 動(dòng)物模型制備

本研究中，白蛋白結(jié)合型紫杉醇經(jīng)生理鹽水溶解(0.5 mg/ml)后，以2.47 mg/kg的劑量隔日腹腔給藥，共進(jìn)行4次注射(第1，3，5，7天)，最終累積劑量為9.9 mg/kg，經(jīng)白蛋白結(jié)合型紫杉醇處理的大鼠為紫杉醇組[4]。對(duì)照組腹腔注射同劑量的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第8天水合氯醛麻醉大鼠，暴露胸腔，生理鹽水和多聚甲醛灌注固定脊髓。

1.4 行為學(xué)測(cè)定

采用Von Frey細(xì)絲和熱痛刺激儀分別測(cè)定大鼠實(shí)驗(yàn)前(day 0)、白蛋白結(jié)合型紫杉醇或生理鹽水注射后第4天(day 4)和第8天(day 8)的機(jī)械刺激縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和熱刺激縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)作為痛閾觀察指標(biāo)。

熱刺激縮足反射潛伏期測(cè)定：用左后足TWL作為反映大鼠熱痛閾的指標(biāo)。將大鼠置于透明的有機(jī)玻璃箱中，待其處于安靜狀態(tài)時(shí)，將紅外輻射熱刺激發(fā)生器的加熱中心對(duì)準(zhǔn)大鼠后足跖面進(jìn)行連續(xù)輻射，待大鼠出現(xiàn)抬腿動(dòng)作時(shí)，儀器可以自動(dòng)記錄此時(shí)間點(diǎn)(s)，即為大鼠的TWL。每只大鼠試驗(yàn)5次，每次間隔5 min。

機(jī)械刺激縮足反射閾值測(cè)定：將大鼠置于底部為鐵絲網(wǎng)的塑料籠中，適應(yīng)30 min，用代表不同壓力(最小0.4 g，最大26.0 g)的Von Frey探針刺激大鼠右后足10次，每次持續(xù)3～5 s，每次刺激間隔大于2 min。觀察大鼠的縮足反應(yīng)次數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算大鼠的MWT(g)，作為反映大鼠機(jī)械痛閾指標(biāo)。

1.5 Western blot檢測(cè)TLR4通路相關(guān)蛋白MyD88、TRIF、IRF3的表達(dá)

腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠。心臟灌注4 ℃生理鹽水后，快速取出L4-6脊髓組織，液氮速凍，-80 ℃保存。取凍存脊髓組織加入蛋白裂解液，15 000 r/min離心10 min，收集上清，即為細(xì)胞總蛋白。BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)樣品濃度。按照每孔30 μg加樣，蛋白質(zhì)樣品通過凝膠電泳分離，電泳結(jié)束后利用濕轉(zhuǎn)法使蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗：β-actin(1 ∶1 000)、髓樣分化初反應(yīng)蛋白88(myeloid differentiation primary response protein 88，MyD88)(1 ∶500)、含有TIR結(jié)構(gòu)能誘導(dǎo)干擾素β的接頭分子(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β，TRIF)(1 ∶500)、干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)(1 ∶500)，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗，加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，拍照，Image J軟件定量分析。

1.6 HE染色觀察脊髓病理改變

10%的水合氯醛溶液麻醉大鼠，經(jīng)左心室灌注生理鹽水，并繼續(xù)快速推注4%多聚甲醛約150 ml，最后4%多聚甲醛緩慢滴注15 min，大鼠肢體僵硬后，快速取出L4-6脊髓組織。常規(guī)石蠟包埋脊髓組織，5 μm厚度切片。HE染色，常規(guī)脫蠟、水化、染色、沖洗、中性樹膠封片，光鏡觀察脊髓組織細(xì)胞形態(tài)。

1.7 免疫組化染色檢測(cè)脊髓組織中GFAP、Iba-1、HMGB1及TLR4的表達(dá)

取石蠟切片，脫蠟、水化如前，過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶，高壓抗原修復(fù)，血清室溫封閉30 min，分別加HMGB1抗體(1 ∶300)、TLR4抗體(1 ∶200)、Iba-1抗體(1 ∶400)或、GFAP抗體(1 ∶200)，4 ℃過夜。生物素化二抗37 ℃孵育30 min，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素37 ℃孵育30 min。DAB顯色、蘇木素溶液復(fù)染，常規(guī)脫水、封片。光鏡觀察，顯微鏡成像系統(tǒng)采集圖片，生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。GFAP為星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物，Iba-1為小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物，GFAP及Iba-1表達(dá)升高提示膠質(zhì)細(xì)胞活化增強(qiáng)。

免疫組化結(jié)果判定[5]：每張切片隨機(jī)選取3個(gè)有代表性的高倍視野，免疫組化評(píng)分采用染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相結(jié)合的綜合評(píng)價(jià)，二者評(píng)分乘積為最終結(jié)果。染色強(qiáng)度評(píng)分：無染色0分，輕度黃染1分，中度黃染2分，重度黃染3分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比評(píng)分：無染色0分，1%～10%細(xì)胞染色1分，11%～50%為2分；51%～80%為3分，81%～100%為4分。

1.8 ELISA檢測(cè)脊髓組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的水平

稱取各組大鼠脊髓組織，加入生理鹽水后用電動(dòng)勻漿器勻漿成勻漿液。采用ELISA試劑盒按照說明書步驟檢測(cè)各組大鼠脊髓勻漿液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，二抗?jié)舛? ∶5 000，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品濃度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 白蛋白結(jié)合型紫杉醇成功構(gòu)建大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型

在開始給藥后第4天及第8天，紫杉醇組MWT、TWL較對(duì)照組均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1)，提示白蛋白結(jié)合型紫杉醇致神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型成功建立。

與對(duì)照組相比，*P<0.05圖1 白蛋白結(jié)合型紫杉醇對(duì)大鼠MWT、TWL的影響Figure 1 Effects of nab-paclitaxel on MWT and TWL of rats

2.2 大鼠脊髓的病理學(xué)改變及HMGB1、TLR4的表達(dá)變化

HE染色結(jié)果表明：對(duì)照組大鼠L4-6脊髓組織中，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，核膜結(jié)構(gòu)清晰，核仁明顯，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞無水腫；而紫杉醇組大鼠L4-6脊髓組織中，神經(jīng)細(xì)胞層次排列紊亂，神經(jīng)元固縮、扭曲，細(xì)胞體變形，部分細(xì)胞可見水腫(見圖2)。免疫組化結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，紫杉醇組大鼠L4-6脊髓組織中HMGB1及TLR4的表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖3)。

圖2 HE染色觀察大鼠脊髓的病理學(xué)改變Figure 2 Pathological changes of spinal cord in rats by HE staining

與對(duì)照組相比，*P<0.05圖3 免疫組化檢測(cè)大鼠脊髓HMGB1、TLR4的表達(dá)變化Figure 3 The expression of HMGB1 and TLR4 in the rat spinal cord by immumohistochemical staining

2.3 白蛋白結(jié)合型紫杉醇對(duì)大鼠L4-6脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

免疫組化結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，紫杉醇組大鼠L4-6脊髓組織中GFAP及Iba-1的表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖4)，提示白蛋白結(jié)合型紫杉醇可介導(dǎo)大鼠脊髓組織中的膠質(zhì)細(xì)胞活化。

與對(duì)照組相比，*P<0.05圖4 白蛋白結(jié)合型紫杉醇誘導(dǎo)大鼠L4-6脊髓中膠質(zhì)細(xì)胞活化Figure 4 Nab-paclitaxel promotes glial cell activation in L4-6 rat spinal cord by immumohistochemical staining

2.4 白蛋白結(jié)合型紫杉醇可激活大鼠脊髓組織中的TLR4通路

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，紫杉醇組TLR4通路相關(guān)蛋白MyD88、TRIF、IRF3的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖5)，提示TLR4通路可能參與白蛋白結(jié)合型紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛。

與對(duì)照組相比，*P<0.05圖5 Western blot檢測(cè)白蛋白結(jié)合型紫杉醇對(duì)大鼠脊髓組織中的TLR4通路的影響Figure 5 Effect of nab-paclitaxel on the TLR4 pathway in rat spinal cord by Western blot

2.5 白蛋白結(jié)合型紫杉醇升高大鼠脊髓組織中的炎性因子水平

ELISA結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，紫杉醇組大鼠L4-6脊髓組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量明顯升高(P<0.05，見圖6)，結(jié)果提示白蛋白結(jié)合型紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛可能與炎性因子水平升高有關(guān)。

與對(duì)照組相比，*P<0.05圖6 ELISA檢測(cè)白蛋白結(jié)合型紫杉醇對(duì)大鼠脊髓組織中的炎性因子水平的影響Figure 6 Effect of nab-paclitaxel on the levels of inflammatory factors in the spinal cord of rats by ELISA

3 討論

由于白蛋白結(jié)合型紫杉醇避免了有毒溶劑產(chǎn)生的不良反應(yīng)，增加了紫杉醇的安全使用劑量，大幅提高了治療的有效率，且中性粒細(xì)胞減少等不良反應(yīng)更輕，但是神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生率略有增加，而采用抗炎藥、阿片類藥物、抗抑郁藥等并不能明顯緩解此類型的疼痛。既往文獻(xiàn)表明紫杉醇導(dǎo)致的病理性疼痛可能與脊髓及背根神經(jīng)節(jié)的免疫調(diào)節(jié)、線粒體功能障礙、離子通道表達(dá)異常等有關(guān)，但具體機(jī)制仍不明確[6]。

生理狀況下HMGB1主要存在于細(xì)胞核，釋放到胞外則具有促炎癥作用。在應(yīng)激狀態(tài)、機(jī)體損傷、炎癥等過程中都可以引起HMGB1的釋放[7]。既往研究發(fā)現(xiàn)HMGB1及其受體在脊髓背角及背根神經(jīng)節(jié)中都有表達(dá)，在脊神經(jīng)結(jié)扎所致的外周神經(jīng)損傷模型中，脊髓背根神經(jīng)節(jié)中的HMGB1主要表達(dá)于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞[8]。HMGB1與病理性疼痛的發(fā)生密切相關(guān)，在大鼠的坐骨神經(jīng)或脊髓注射外源性的HMGB1可以誘導(dǎo)機(jī)械性痛覺超敏；給神經(jīng)痛的大鼠注射HMGB1特異性中和抗體，則能減輕大鼠的機(jī)械性痛覺超敏[9,10]。本研究結(jié)果提示白蛋白結(jié)合型紫杉醇作用大鼠后可成功誘導(dǎo)大鼠的痛覺過敏，同時(shí)L4-6脊髓中HMGB1的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，提示HMGB1可能也參與紫杉醇導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生。

HMGB1被釋放到細(xì)胞外后可以激活相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，比如Toll樣受體家族、RAGE受體家族、JNK受體家族等。TLR4可通過MyD88依賴及MyD88非依賴途徑激活下游通路，TLR4的激活還依賴于一些接頭蛋白TRIF、IRF3等的參與。研究表明TLR4是HMGB1的下游信號(hào)，上調(diào)HMGB1可促進(jìn)TLR4表達(dá)[2]。TLR4能夠引發(fā)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)流，激活NF-κB、PI3K等信號(hào)通路，最終導(dǎo)致炎癥因子TNF-α、IL-6等的釋放[11]。此外，炎性因子TNF-α和IL-6也能引起HMGB1的釋放，血漿中或者神經(jīng)組織中的HMGB1又可調(diào)節(jié)致敏性損傷、誘導(dǎo)炎性因子的釋放，進(jìn)而形成正反饋循環(huán)[12,13]。在術(shù)后慢性疼痛模型、脊髓損傷導(dǎo)致的慢性疼痛模型及普通劑型紫杉醇導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛模型中，TLR4通路均被激活，而抑制TLR4通路能一定程度緩解疼痛[14-16]。本研究也表明白蛋白結(jié)合型紫杉醇可導(dǎo)致大鼠L4-6脊髓TLR4的表達(dá)明顯升高，且TLR4通路的相關(guān)蛋白MyD88、TRIF、IRF3的表達(dá)及下游炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6的水平也升高，表明TLR4信號(hào)通路可能與神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)，且HMGB1是TLR4的重要配體之一，白蛋白結(jié)合型紫杉醇可能通過釋放HMGB1，激活TLR4通路介導(dǎo)疼痛的發(fā)生。

膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓中分布廣泛，在疼痛等病理?xiàng)l件下，膠質(zhì)細(xì)胞被激活，膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、Iba-1的表達(dá)增強(qiáng)，炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6等大量釋放[17]。本實(shí)驗(yàn)研究表明白蛋白結(jié)合型紫杉醇使大鼠脊髓內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物GFAP及Iba-1的表達(dá)升高，提示兩種膠質(zhì)細(xì)胞均被激活。既往研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)病理性疼痛的形成過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，并激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，而星形膠質(zhì)細(xì)胞可能在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持中起著重要的作用[18,19]。

綜上，白蛋白結(jié)合型紫杉醇可導(dǎo)致大鼠脊髓HMGB1/TLR4通路相關(guān)蛋白及下游炎性因子的表達(dá)增加，并促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞活化，HMGB1/TLR4通路可能與白蛋白結(jié)合型紫杉醇導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)。