劉志紅,劉 靜,王瑞英

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，石家莊 050000；*通訊作者,E-mail:wry0616@126.com)

胰島素抵抗(insulin resistance, IR)是2型糖尿病至關(guān)重要的致病要素[1]，慢性炎癥侵害并阻礙胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低靶器官胰島素敏感性[2]，脂肪等器官“代謝性炎癥”的發(fā)生加重IR[3]。消退素D1(resolvin D1,RvD1)是一種有效的脂質(zhì)介質(zhì)，具備抗炎和促炎癥衰退的作用[4,5]。核因子-κB(nuclear transcription factor-kappa B,NF-κB)是一種介導(dǎo)炎癥信號(hào)的轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB過(guò)表達(dá)能夠抑制AKT的磷酸化，導(dǎo)致叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(forkhead box transcription factor 1,Foxo1)的表達(dá)增加[6]，促進(jìn)脂肪形成[7]。目前關(guān)于消退素能否通過(guò)減輕2型糖尿病小鼠肝臟炎癥狀態(tài)來(lái)緩解胰島素抵抗及脂肪沉積的研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)給予2型糖尿病小鼠腹腔注射RvD1，探討RvD1是否能下調(diào)肝臟NF-κB的表達(dá)，降低炎癥狀態(tài)，改善IR緩解肝臟脂肪沉積，為臨床發(fā)現(xiàn)醫(yī)治糖尿病新型藥物提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

小鼠超敏胰島素ELISA試劑盒(美國(guó)ALPCO公司，批號(hào)：07511)；TNF-α試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：A21300289)、IL-6 ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：A21800343)；總膽固醇(total cholesterol,TC)(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20180306)、甘油三酯(triglyceride,TG)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20180203)；蘇木素伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；RvD1(美國(guó)Cayman公司)；兔p-AKT(Ser473)單克隆抗體(美國(guó)CST公司)；兔NF-κB p65抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；兔Foxo1抗體(美國(guó)CST公司)；兔p-Foxo1抗體(美國(guó)CST公司)。EBA12R型低溫離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司)；Multiskan FC型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher科技公司)；EG1150型組織包埋機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；DYY-Ⅲ型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(中國(guó)北京六一儀器廠)；GDS8000凝膠成像儀(美國(guó)UVP公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型制備

清潔級(jí)C57BL/6J雄性小鼠，30只，年齡6周，體質(zhì)量21.0～23.0 g[合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0006]，購(gòu)買自北京維通利華公司。將C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為兩組：正常對(duì)照組(Con)10只(普通飼料喂養(yǎng))，糖尿病組(DM)20只(高脂飼料喂養(yǎng))。分籠飼養(yǎng)(5只/籠)，喂養(yǎng)8周后高脂飲食小鼠禁食8 h測(cè)量小鼠體質(zhì)量后按100 mg/kg腹腔注射鏈脲霉素。3 d后斷尾測(cè)空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)≥16.7 mmol/L標(biāo)志模型成功。血糖驗(yàn)證模型成功后隨機(jī)將DM組小鼠分為DM組和DM+RvD1組，每組10只，連續(xù)3周給予DM+RvD1組每只小鼠腹腔注射RvD1(100 ng/d)[8]，其余兩組小鼠給予同體積0.9%氯化鈉注射液。實(shí)驗(yàn)期間除Con組外其他小鼠均繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飲食，自由飲水。

1.3 胰島素抵抗、血脂、炎癥相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

所有小鼠干預(yù)結(jié)束后斷尾，尾靜脈測(cè)定空腹血糖，之后以2%戊巴比妥鈉(45 mg/100 g)麻醉，摘眼球取血于抗凝管中，然后收集所有血液樣品放到提前預(yù)冷到4 ℃的離心機(jī)，離心速度3 000 r/min，10 min，取上層血清保存?？崭挂葝u素(fasting insulin,FINS)水平參照ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=(FBG×FINS)/22.5。應(yīng)用酶標(biāo)儀按照南京建成試劑盒說(shuō)明書操作步驟測(cè)定TG和TC含量。TNF-α、IL-6水平測(cè)定步驟參照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光度值。

1.4 肝臟病理

蘇木素-伊紅染色法：取血后立即剪開(kāi)小鼠腹腔，剔除周圍筋膜，取1 cm2大小肝組織迅速放到4%多聚甲醛中，脫蠟至水，蘇木素染色，之后梯度酒精脫水，伊紅染色，脫水封片，切片機(jī)切片(5 μm)，顯微鏡觀察細(xì)胞分析圖像。

油紅染色：迅速取材的肝組織制作冰凍切片，避光環(huán)境下油紅染色8～10 min，75%酒精分化，水洗，蘇木素染色3～5 min，水洗，分化液分化，返藍(lán)液返藍(lán)后封片，顯微鏡觀察細(xì)胞分析圖像。

1.5 肝臟NF-κB p65和p-AKT蛋白表達(dá)量檢測(cè)

Western blot法檢測(cè)肝臟組織NF-κB p65、p-AKT、Foxo1、p-Foxo1蛋白表達(dá)，肝臟組織加入裂解液勻漿，進(jìn)行蛋白定量。上樣、SDS-聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)電泳、轉(zhuǎn)移至PVDF膜、脫脂奶粉封閉洗膜、加一抗、二抗、發(fā)光，應(yīng)用ImageJ軟件對(duì)灰度進(jìn)行測(cè)量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 消退素D1對(duì)小鼠生化指標(biāo)的影響

三組小鼠FBG、TG、TC經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Con組相比，DM組小鼠FBG、TG、TC水平升高(P<0.05)；與DM組相比，DM+RvD1組三者水平下降(P<0.05)。同時(shí)三組小鼠HOMA-IR經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與Con組相比，DM組小鼠HOMA-IR升高(P<0.05)；與DM組相比，DM+RvD1組HOMA-IR下降(P<0.05，見(jiàn)表1)。

2.2 消退素D1對(duì)小鼠炎癥指標(biāo)的影響

三組小鼠TNF-α、IL-6水平經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Con組比較，DM組TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)；與DM組相比，DM+RvD1組兩指標(biāo)水平下降(P<0.05，見(jiàn)表1)。

表1 各組小鼠糖脂代謝及炎癥指標(biāo)比較

2.3 消退素D1對(duì)小鼠肝臟病理的影響

Con組肝細(xì)胞脂肪沉積較少，脂滴空泡較少，無(wú)明顯的脂肪變性；DM組肝臟脂肪沉積明顯，脂肪變性顯著，肝細(xì)胞脂滴空泡較多；DM+RvD1組與DM組比肝細(xì)胞脂肪變性顯著減輕，脂滴空泡明顯減少(見(jiàn)圖1)。

Con組 DM組 DM+RvD1組白色代表脂滴空泡，紫色代表細(xì)胞核圖1 不同處理后小鼠肝臟組織的HE染色病理結(jié)果 (×40)Figure 1 Pathological changes of liver tissue of mice after different treatment by HE staining (×40)

2.4 消退素D1對(duì)小鼠肝臟脂質(zhì)沉積的影響

Con組可見(jiàn)藍(lán)色的細(xì)胞核，橘紅色脂滴數(shù)量較少；DM組可見(jiàn)大量橘紅色脂滴沉積；與DM組相比，DM+RvD1組的脂滴明顯減少，數(shù)量介于Con組和DM組之間(見(jiàn)圖2)。

Con組 DM組 DM+RvD1組藍(lán)色代表細(xì)胞核，橘紅色代表脂滴圖2 不同處理后小鼠肝臟組織脂質(zhì)沉積 (×40)Figure 2 Lipid deposition in liver tissue of mice after different treatment (×40)

2.5 消退素D1對(duì)小鼠肝臟的NF-κB p65、p-AKT、Foxo1、p-Foxo1蛋白量影響

三組小鼠肝臟NF-κB p65、Foxo1蛋白水平經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P<0.05)；與Con組比較，DM組小鼠NF-κB p65、Foxo1蛋白水平升高；與DM組比較，DM+RvD1組NF-κB p65和Foxo1水平均下降(P<0.05)。三組小鼠肝臟p-AKT、p-Foxo1蛋白水平經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Con組相比，DM組小鼠p-AKT、p-Foxo1蛋白水平下降；與DM組比較，DM+RvD1組p-AKT、p-Foxo1蛋白水平升高(P<0.05，見(jiàn)圖3)。

與Con組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05圖3 各組小鼠肝臟中NF-κB p65、p-AKT、Foxo1、p-Foxo1蛋白水平Figure 3 The levels of NF-κB p65, p-AKT, Foxo1, and p-Foxo1 protein in liver of mice

3 討論

目前世界上糖尿病患者越來(lái)越多，研究者估計(jì)到2040年患病人數(shù)將高達(dá)6.42億[9]。胰島素抵抗是2型糖尿病、肥胖等代謝性疾病的發(fā)病的生理學(xué)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)潛在的炎癥似乎是IR的關(guān)鍵[10]。在超重和肥胖狀態(tài)下脂肪細(xì)胞釋放大量炎癥介質(zhì)如TNF-α、IL-6、抵抗素等[11]，激活NF-κB、MAPK等通路，阻礙胰島素受體底物(insulin receptor substrate,IRS)/磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyl inositol 3 kinase,PI3-K)/AKT胰島素信號(hào)通路。TNF-α、IL-6同時(shí)能夠使c-jun氨基末端激酶和細(xì)胞因子信號(hào)抑制物3活性增加，IRS絲氨酸磷酸化水平升高，酪氨酸磷酸化受阻，使通路下游的PI3K失活，從而導(dǎo)致IR。

研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充魚油能夠有效改善2型糖尿病患者IR，使炎癥介質(zhì)水平下降[12]，可能與魚油中富含多不飽和脂肪酸有關(guān)。消退素是由人類白細(xì)胞轉(zhuǎn)化不飽和脂肪酸生成的物質(zhì)，包括E類消退素、D類消退素，其中對(duì)RvD1的研究較多。RvD1可促進(jìn)炎癥消退，并具有鎮(zhèn)痛功效[13]。同時(shí)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)消退素D1可緩解糖尿病多種并發(fā)癥，通過(guò)抑制NF-κB通路、抗氧化應(yīng)激、升高一氧化氮水平等改善糖尿病腎病[14,15]，并可減少高糖對(duì)原代視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的線粒體損傷[16]。RvD1通過(guò)降低NLRP3炎性小體的激活水平和相關(guān)的細(xì)胞因子產(chǎn)生在STZ誘導(dǎo)的糖尿病性視網(wǎng)膜病變中起保護(hù)作用[14]。RvD1通過(guò)抑制NF-κB/iNOS改善胰島素敏感性[17]。同時(shí)Hellmann等[18]發(fā)現(xiàn)RvD1可以使巨噬細(xì)胞在脂肪的聚集下降，從而降低肥胖糖尿病小鼠HOMA-IR，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)自發(fā)2型糖尿病db/db小鼠應(yīng)用RvD1 8～16 d后空腹血糖顯著降低、胰島素抵抗指數(shù)下降，脂肪組織p-AKT水平升高，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符合。

研究證明消退素D1可減少體內(nèi)TNF-α含量，抑制中性粒細(xì)胞性能，阻止炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)白細(xì)胞的積累和多形核中性粒細(xì)胞在炎癥部位的浸潤(rùn)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用RvD1干預(yù)后，HOMA-IR指數(shù)及炎癥因子TNF-α、IL-6水平均較糖尿病組下降，肝臟NF-κB p65蛋白下降，p-AKT程度升高，IR改善，同時(shí)p-AKT可以抑制Foxo1從肝細(xì)胞核的激活和易位，導(dǎo)致肝糖異生減少，減少脂肪合成原料[20]，病理上肝臟脂肪變性減少，血脂水平下降。說(shuō)明RvD1可能通過(guò)抑制NF-κB p65/p-AKT/Foxo1通路提高肝臟胰島素敏感性改善脂肪變性。

本實(shí)驗(yàn)也有一定的局限性，研究發(fā)現(xiàn)[21]提高p-AKT水平可促使下游哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)磷酸化抑制脂聯(lián)素的合成，從而導(dǎo)致固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)降低，抑制脂肪酸的從頭合成，RvD1是否可影響該通路來(lái)改善肝臟脂肪沉積以及RvD1對(duì)NF-κB通路影響的具體機(jī)制及作用靶分子未進(jìn)一步研究，需要后續(xù)進(jìn)行大量動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討。