李澤霖，紀(jì)兆樂，周海佳，劉鵬云，趙 佩

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，西安 710038；*通訊作者,E-mail:zhao-peigy@163.com)

在糖尿病患者中，觀察到多種心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)，如心室擴(kuò)張、顯著間質(zhì)纖維化、心臟舒張及收縮功能不全和左心室肥厚[1]。這種疾病過程被稱為糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)，它是一種心肌特異性疾病，也是導(dǎo)致糖尿病患者高病死率的重要并發(fā)癥之一，目前迫切需要對(duì)糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制有一個(gè)全面的認(rèn)識(shí)[2]。近年來，許多研究已經(jīng)明確了自噬在糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展中的作用[3]。據(jù)報(bào)道，凋亡和自噬水平的穩(wěn)定都是細(xì)胞存活所必需的，在Ⅰ型糖尿病動(dòng)物模型中，其心臟自噬受到抑制，同時(shí)心肌細(xì)胞凋亡明顯增加，繼而出現(xiàn)顯著的心功能不全[4,5]。然而在2型糖尿病心肌病心肌損傷中自噬發(fā)揮的作用仍有待探究。

紫檀芪(pterostilbene,PTE)是一種天然的白藜蘆醇類似物，具有多種藥理活性，包括抗癌、抗炎、抗氧化和抗糖尿病等[6]。大量研究表明紫檀芪在心血管相關(guān)疾病中發(fā)揮了顯著的保護(hù)效應(yīng)[7-9]。并且有研究報(bào)道紫檀芪可以刺激細(xì)胞保護(hù)性自噬，從而幫助清除人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中積累的毒性氧化低密度脂蛋白，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[10]。然而，紫檀芪能否同樣減輕糖尿病心肌病心肌損傷及自噬在其中的作用尚不清楚。因此，本研究采用2型糖尿病心肌病模型，以探討紫檀芪對(duì)模型小鼠心肌損傷的保護(hù)作用，并進(jìn)一步明確其對(duì)心肌自噬及自噬通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠60只，體質(zhì)量20～25 g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK(陜)2019-001。紫檀芪和鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)購自美國Sigma-Aldrich公司；末端脫氧核苷酸末端標(biāo)記(TUNEL)檢測(cè)試劑盒購自瑞士Roche公司；乳酸鹽脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)和肌酸激脢(creatine kinase-MB,CK-MB)ELISA試劑盒購自美國R&D公司；肌球蛋白樣BCL2結(jié)合蛋白1(Beclin1)、單磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、p-AMPK、膠原蛋白1(Collagen Ⅰ)、自噬受體蛋白(p62)、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)(mammalian target of rapamycin,mTOR)、p-mTOR、裂解半胱天冬酶3(cleaved Caspase-3)抗體購自美國Cell Signalling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立及分組處理 2型糖尿病心肌病小鼠模型建立方法如下：小鼠正常飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，給予高脂飼料喂養(yǎng)1個(gè)月?？崭?2 h后，腹腔注射50 mg/kg新配置的STZ(避光溶于0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液)，連續(xù)注射3 d。自STZ第一次注射1周后，經(jīng)尾靜脈采血測(cè)定隨機(jī)血糖，血糖濃度≥16.7 mmol/L被視為造模成功并納入后續(xù)研究。對(duì)照組小鼠腹腔注射等量的檸檬酸鈉緩沖液處理。模型組小鼠后續(xù)實(shí)驗(yàn)繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)4個(gè)月，而對(duì)照組小鼠則繼續(xù)給予正常飼料喂養(yǎng)4個(gè)月。

將60只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Con)、藥物對(duì)照組(Con+PTE)、模型組(DCM)和紫檀芪組(DCM+PTE)，每組15只。紫檀芪組小鼠在2型糖尿病心肌病造模成功后給予紫檀芪[10 mg/(kg·d)]灌胃給藥處理，藥物對(duì)照組小鼠則在紫檀芪組小鼠同時(shí)間點(diǎn)灌胃給藥處理，正常對(duì)照組和模型組小鼠僅給予正常飲用水處理。所有處理在造模成功后4個(gè)月停止實(shí)驗(yàn)并行心臟超聲及后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2 心臟功能檢測(cè) 小鼠用異氟醚混合純氧吸入麻醉，持續(xù)維持至超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)束。胸骨旁短軸視圖采用13～24 MHz線性陣列換能器系統(tǒng)，以獲取乳頭肌水平的短軸視圖。記錄3個(gè)具有代表性的心臟周期，并對(duì)每次測(cè)量取平均值。使用測(cè)量值計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左心室短軸縮短率(LVFS)以代表心臟收縮功能。利用多普勒頻譜技術(shù)測(cè)定二尖瓣舒張?jiān)缙谘魉俣确逯?E)、二尖瓣舒張晚期血流速度峰值(A)，并計(jì)算出E/A比值以代表心臟舒張功能。

1.2.3 血清生化檢測(cè) 小鼠頸動(dòng)脈取血，靜置離心后獲取上層血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清中的LDH和CK-MB的水平。

1.2.4 心肌組織病理及免疫組化染色 取小鼠心臟標(biāo)本，經(jīng)4%的多聚甲醛固定48 h后進(jìn)行石蠟包埋。使用顯微切片機(jī)切割成5 μm厚的切片。切片常規(guī)Masson染色以顯示組織中膠原纖維。心臟切片用3%過氧化氫阻斷，洗滌后用抗Collagen Ⅰ抗體(1 ∶500)和LC3B抗體(1 ∶500)孵育過夜。沖洗后，切片與二抗孵育，顯微鏡觀察并拍照，用Image J軟件分析Collagen Ⅰ膠原沉著及LC3B熒光表達(dá)程度。

1.2.5 心肌組織TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用TUNEL方法檢測(cè)心肌凋亡細(xì)胞。將心臟組織切片脫蠟，然后用蛋白酶K(30 mg/ml)在37 ℃下孵育30 min。用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌3次后，與TUNEL反應(yīng)混合物在37 ℃黑暗環(huán)境下孵育1 h。為鑒定心肌細(xì)胞核，將DAPI染液滴在切片上，室溫孵育5 min，熒光顯微鏡觀察。在給定的觀察范圍內(nèi)，通過TUNEL染色的心肌細(xì)胞數(shù)量與DAPI染色的心肌細(xì)胞總數(shù)的比值計(jì)算出凋亡的心肌細(xì)胞百分比或凋亡指數(shù)。

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 將心臟組織勻漿，置于裂解緩沖液中冰上裂解30 min，收集上清液，采用Bradford蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。相同樣品(總蛋白40 μg)上樣，用SDS-PAGE分離。蛋白質(zhì)通過電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。用5%的脫脂奶粉在室溫下封閉膜1 h，然后與一抗(包括Beclin1、AMPK、p-AMPK、p62、LC3、mTOR、p-mTOR、cleaved Caspase-3和β-actin)(稀釋比例均為1 ∶1 000)在4 ℃下孵育一夜。用TBST洗滌3次(每次15 min)后，將膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育2 h。用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶，用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行掃描和密度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 紫檀芪明顯改善2型糖尿病小鼠心臟功能障礙

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠的心臟收縮功能指標(biāo)LVEF、LVFS和心臟舒張功能指標(biāo)E/A值均顯著降低(P<0.01)，表明小鼠心臟功能嚴(yán)重障礙；紫檀芪干預(yù)治療后，與模型組相比，紫檀芪組小鼠的LVEF、LVFS和E/A值均顯著升高(P<0.01)，表明小鼠心臟功能得到明顯改善；而與正常對(duì)照組相比，藥物對(duì)照組小鼠上述指標(biāo)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖1)。

與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01圖1 心臟超聲檢測(cè)的各組小鼠心臟功能相關(guān)指標(biāo)的比較Figure 1 Comparison of myocardial function detected by echocardiography between groups

2.2 紫檀芪明顯減輕2型糖尿病小鼠心肌損傷

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中LDH和CK-MB濃度顯著升高(P<0.01)，表明小鼠心肌細(xì)胞明顯損傷；紫檀芪干預(yù)治療后，與模型組相比，紫檀芪組小鼠血清中LDH和CK-MB濃度顯著降低(P<0.01)，表明小鼠心肌細(xì)胞損傷得到明顯減輕；而與正常對(duì)照組相比，藥物對(duì)照組小鼠上述指標(biāo)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖2)。

與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01圖2 各組小鼠心肌損傷標(biāo)志物表達(dá)比較Figure 2 Comparison of expression of myocardial injury markers between groups

2.3 紫檀芪明顯抑制2型糖尿病小鼠心肌組織纖維化

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠心肌組織Masson染色藍(lán)紫色著色及Collagen Ⅰ膠原沉著顯著加重(P<0.01)，表明小鼠心肌組織發(fā)生明顯纖維化；紫檀芪干預(yù)治療后，與模型組相比，紫檀芪組小鼠心肌組織Masson染色藍(lán)紫色著色及Collagen Ⅰ膠原沉著顯著減輕(P<0.01)，表明小鼠心肌組織纖維化程度明顯減輕；而與正常對(duì)照組相比，藥物對(duì)照組小鼠上述指標(biāo)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖3)。

藍(lán)紫色染色代表膠原纖維染色；棕褐色染色代表Collagen Ⅰ染色;與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01圖3 各組小鼠心肌組織纖維化程度比較Figure 3 Comparison of the degree of myocardial fibrosis between groups

2.4 紫檀芪明顯抑制2型糖尿病小鼠心肌細(xì)胞凋亡

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠綠色熒光顯示的凋亡心肌細(xì)胞顯著增加，凋亡蛋白cleaved Caspase-3表達(dá)顯著升高(P<0.01)，表明小鼠心肌組織發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡；紫檀芪干預(yù)治療后，與模型組相比，紫檀芪組小鼠綠色熒光顯示的凋亡心肌細(xì)胞顯著減少，凋亡蛋白cleaved Caspase-3表達(dá)顯著降低(P<0.01)，表明小鼠心肌組織細(xì)胞凋亡得到明顯抑制；而與正常對(duì)照組相比，藥物對(duì)照組小鼠上述指標(biāo)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖4，5)。

綠色熒光代表凋亡細(xì)胞核染色，藍(lán)色熒光代表所有細(xì)胞核染色與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01圖4 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較Figure 4 Comparison of the apoptosis rate of myocardial cells between groups

與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01圖5 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)比較Figure 5 Comparison of apoptotic protein expression in myocardial cells between groups

2.5 紫檀芪明顯增強(qiáng)2型糖尿病小鼠心肌組織自噬水平

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠心肌組織Beclin1及LC3B蛋白紅色熒光表達(dá)顯著降低，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例顯著下降，p62蛋白表達(dá)明顯增加(均P<0.01)，表明小鼠心肌組織自噬明顯減低；紫檀芪干預(yù)治療后，與模型組相比，紫檀芪組小鼠心肌組織Beclin1及LC3B蛋白紅色熒光表達(dá)顯著增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例顯著上升，p62蛋白表達(dá)明顯減低(均P<0.01)，表明小鼠心肌組織自噬得到明顯增強(qiáng)；而與正常對(duì)照組相比，藥物對(duì)照組小鼠上述指標(biāo)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖6，7)。

與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01圖6 各組小鼠心肌組織自噬蛋白表達(dá)比較Figure 6 Comparison of autophagy protein expression in myocardial tissue between groups

紅色熒光代表LC3B熒光染色，藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核染色與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01圖7 各組小鼠心肌組織自噬蛋白LC3B熒光表達(dá)比較Figure 7 Comparison of fluorescence expression of autophagy protein LC3B in myocardial tissue between groups

2.6 紫檀芪明顯促進(jìn)2型糖尿病小鼠心肌組織AMPK/mTOR通路表達(dá)

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠心肌組織p-AMPK/AMPK比值明顯降低，p-mTOR/mTOR比例顯著升高(P<0.01)，表明小鼠心肌組織AMPK/mTOR通路表達(dá)明顯抑制；紫檀芪干預(yù)治療后，與模型組相比，紫檀芪組小鼠心肌組織p-AMPK/AMPK比值明顯上升，p-mTOR/mTOR比例顯著減低(P<0.01)，表明小鼠心肌組織AMPK/mTOR通路表達(dá)得到明顯促進(jìn)；而與正常對(duì)照組相比，藥物對(duì)照組小鼠上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖8)。

與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01圖8 各組小鼠心肌組織AMPK/mTOR通路表達(dá)比較Figure 8 Comparison of the expression of AMPK/mTOR between groups

3 討論

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝紊亂，可引起不同器官的長(zhǎng)期損害和功能障礙。糖尿病心肌病是糖尿病的常見并發(fā)癥，也是糖尿病患者的最大死亡風(fēng)險(xiǎn)之一[11]。然而，在無癥狀糖尿病階段，盡管有病理進(jìn)展，糖尿病心肌病在很大程度上仍未被識(shí)別。糖尿病心臟中高血糖介導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡的增加，可以解釋糖尿病中心臟相關(guān)發(fā)病率和死亡率的增加[12]。盡管對(duì)糖尿病心肌病病理生理學(xué)的認(rèn)識(shí)有了重大進(jìn)展，但治療選擇仍然非常有限[13]。

紫檀芪作為一種白藜蘆醇的衍生物，不僅具有多種生物活性，且生物利用度比白藜蘆醇更高、更穩(wěn)定[6]。近年來其在心肌梗死[7]、心肌缺血再灌注損傷[14]、心力衰竭[9]、膿毒癥心肌損傷[15]等許多心血管相關(guān)疾病中發(fā)揮的治療效應(yīng)得到了廣泛的驗(yàn)證。在本研究中，我們首先證明了2型糖尿病小鼠表現(xiàn)出明顯的心功能障礙及心肌損傷。繼而給予紫檀芪治療后觀察到，糖尿病小鼠心臟收縮和舒張功能得到明顯改善，且血清中LDH及CK-MB水平顯著降低，表明紫檀芪同樣可作為一種新的治療選擇用以減輕長(zhǎng)期高血糖誘導(dǎo)的心臟損傷。

心肌細(xì)胞肥大、凋亡和纖維化被認(rèn)為是糖尿病心肌病最終發(fā)展為心力衰竭的3個(gè)主要特征[16]。在人類和動(dòng)物糖尿病模型中，高血糖引起的上述心肌病理改變也是導(dǎo)致糖尿病心肌病及其繼發(fā)心功能障礙的主要機(jī)制[17,18]。本研究同樣觀察到，2型糖尿病小鼠心肌組織纖維化程度顯著，凋亡的心肌細(xì)胞明顯增加。而給予紫檀芪治療后其心肌組織纖維化及Collagen Ⅰ膠原沉著得到明顯緩解，且心肌細(xì)胞凋亡也被顯著抑制，以上結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了紫檀芪在減輕糖尿病心肌損傷中的保護(hù)作用。

隨著對(duì)糖尿病研究的進(jìn)展，自噬被認(rèn)為是糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制之一[3,19]。自噬是一種進(jìn)化保守的分解代謝過程，用于降解和循環(huán)長(zhǎng)壽蛋白和受損的細(xì)胞器。生理?xiàng)l件下低水平的自噬發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)和質(zhì)量控制過程[20]。糖尿病心肌病在1型和2型糖尿病患者中均有發(fā)生，1型和2型糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制和臨床特征可能部分不同[21]。Xu等[22]報(bào)道自噬減少是一種適應(yīng)性反應(yīng)，可限制1型糖尿病患者的心功能不全。而對(duì)胰島素抵抗的2型糖尿病模型，自噬調(diào)控對(duì)2型糖尿病心臟的作用有待進(jìn)一步明確。此外，zhang等[10]報(bào)道紫檀芪可以刺激細(xì)胞保護(hù)性自噬，從而幫助清除人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中積累的毒性氧化低密度脂蛋白，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，然而其在2型糖尿病中對(duì)心肌細(xì)胞自噬的作用也仍待確定。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠心肌自噬蛋白Beclin1的表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例顯著下調(diào)，LC3B熒光表達(dá)明顯減低。而給予紫檀芪治療后其心肌組織自噬流明顯增強(qiáng)，表明提高自噬水平對(duì)改善2型糖尿病心肌損傷具有顯著作用。

到目前為止，有幾種細(xì)胞信號(hào)通路被推測(cè)在高糖下開啟自噬[3]。單磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMPK)是心臟能量代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和自噬等過程的調(diào)節(jié)，對(duì)維持心血管正常功能發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[23]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)也是一種細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的重要調(diào)節(jié)因子，在維持基礎(chǔ)自噬水平上同樣發(fā)揮關(guān)鍵作用[24]。此外，AMPK的激活會(huì)抑制自噬負(fù)調(diào)控因子mTOR，進(jìn)而刺激自噬的發(fā)生[25]。近年來，人們?cè)絹碓蕉嗟仃P(guān)注AMPK/mTOR通路在糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制中的潛在作用，以及AMPK刺激劑用于治療此種疾病可能性[26]。然而該通路在介導(dǎo)紫檀芪調(diào)節(jié)自噬進(jìn)而發(fā)揮抗糖尿病心肌損傷中的作用尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病心肌組織AMPK/mTOR通路明顯被抑制，心肌自噬顯著減低。而給予紫檀芪治療后其心肌組織AMPK/mTOR通路明顯被激活，心肌自噬顯著增強(qiáng)。我們的發(fā)現(xiàn)支持了這樣一種觀點(diǎn)，即通過外源性補(bǔ)充紫檀芪藥理激活A(yù)MPK/mTOR通路來增強(qiáng)心肌細(xì)胞的自噬可能是治療2型糖尿病的一種新策略。

綜上所述，本研究通過評(píng)價(jià)高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠的心功能、組織病理變化和分子生物學(xué)改變，證實(shí)了2型糖尿病心肌病的發(fā)生，并論證了自噬可能在紫檀芪減輕2型糖尿病心肌病心肌損傷中起著重要作用。紫檀芪激活的AMPK/mTOR通路可能是其誘導(dǎo)自噬繼而發(fā)揮保護(hù)作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究為紫檀芪的治療性應(yīng)用或自噬激活可能為2型糖尿病心肌病的治療方式提供了新的思路。