萬招飛,李曉莉,王新宏,劉小軍,薛嘉宏,鄭強蓀

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院心血管內科,西安 710004；*通訊作者,E-mail:zhengqiangsun@126.com)

近年來，隨著器械和技術的不斷進步，經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention, PCI)可以迅速解除狹窄或者開通閉塞血管，已成為急性冠脈綜合征患者最有效的治療策略，極大地改善了患者的預后[1]。但是，臨床上仍有相當一部分患者盡管經PCI開通靶血管，冠脈仍表現為無復流或者慢血流。而冠脈無復流不僅可導致急性致死性心血管事件而且影響患者中遠期預后[2,3]。

冠脈無復流的具體機制目前尚不清楚，但潛在的病理機制包括炎癥免疫反應、內皮功能障礙、微血栓栓塞、微小動脈痙攣及氧化應激等，其中炎癥免疫反應在冠脈無復流中的作用逐漸被重視[4-6]。NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain, leucine-rich repeat and pyrin domain-containing 3,NLRP3)炎癥小體由受體蛋白NLRP3、接頭蛋白ASC和效應分子caspase-1構成的多蛋白復合體[7,8]。來自于體內外的許多因子可以激活NLRP3炎癥小體進而釋放炎癥因子IL-1β[9]。近年來發(fā)現，NLRP3炎癥小體不僅參與調節(jié)機體炎癥免疫，而且是糖尿病及動脈粥樣硬化等代謝性疾病發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[10,11]。加之，新近研究顯示，A20可以抑制NLRP3炎癥小體活性減少IL-1β釋放，形成A20/NLRP3炎癥小體信號通路[12,13]。所以，本研究旨在探索A20/NLRP3炎癥小體信號通路與急性冠脈綜合征患者PCI過程中發(fā)生冠脈無復流的相關性，明確A20/NLRP3炎癥小體信號通路在冠脈無復流中的可能作用，為進一步探索防治冠脈無復流的新靶點提供重要實驗依據和理論指導。

1 資料與方法

1.1 研究對象

連續(xù)入選2019年3月至2020年4月行PCI手術并發(fā)生冠脈無復流的100例急性冠脈綜合征患者為研究對象，并選擇同時期冠脈血流正常者200例為對照。該研究經醫(yī)學倫理委員會審核通過，研究流程遵守赫爾辛基宣言原則。研究人員將實驗目的和實驗過程詳細地介紹后，所有入選受試者同意參與本實驗并簽署知情同意書。排除標準：感染、惡性腫瘤、貧血、自身免疫性疾病、甲亢、嚴重慢性疾病等。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 詳細記錄研究對象年齡、性別、體質量指數。記錄患者高血壓史、糖尿病史、吸煙史等。所有入選病例均在入院后次日清晨空腹靜脈取血，在醫(yī)院臨床檢驗科檢測血漿總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇及白細胞總數等。

1.2.2 GRACE積分評估 根據急性冠狀動脈綜合征患者臨床資料進行風險評估，利用全球急性冠脈綜合征注冊(the global registry of acute coronary events, GRACE)積分風險模型(GRACE ACS risk model)軟件進行評分(http://www.outcomes-umassmed.org/grace)。評分指標包括患者年齡、心率、收縮壓、肌酐、Killip分級、入院時是否有心臟驟停、心電圖ST段變化及心肌標志物等。

1.2.3 冠狀動脈造影和冠脈無復流診斷 按照ACC/AHA冠狀動脈造影指南，采用Judkins法取多部位造影。經兩位高年資冠狀動脈介入醫(yī)生評閱分析。冠脈無復流指在PCI術中和或術后血管造影顯示無明顯的機械阻塞，但冠脈心肌梗死溶栓(the thrombolysis in myocardial infarction, TIMI)血流仍為0，1，2級血流[14]。根據PCI術后冠脈TIMI血流情況，將研究對象分為冠脈正常血流組和冠脈無復流組。

1.2.4 外周血單核細胞(PBMC)分離純化 首先將新鮮抗凝全血配平后，2 000 r/min離心5 min，離心后血漿分裝于2個1.5 ml EP管，-80 ℃儲存?zhèn)溆?。底層的血細胞加? ml PBS液，吹打混勻；利用人淋巴細胞分離液5 ml加入15 ml離心管中，使其恢復至室溫備用；將混有PBS液的血液沿管壁緩慢加入PBMCs分離液中，使得血液和PBMCs分離液二者之間形成明顯的界面；室溫2 000 r/min，將離心機離心的升速和降速均調為零，離心25 min；取出離心管，對著光線用一次性吸管將中間的云霧層狀渾濁物吸出，加入含10 ml PBS液的另一個15 ml離心管中，混勻；室溫3 000 r/min離心10 min，棄上清，10 ml PBS液再次懸?。皇覝? 000 r/min離心10 min，棄上清，管底沉淀即為PBMCs，用3 ml PBS液重懸細胞后均分為3管加入1.5 ml EP管，再次離心后棄上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測NLRP3 mRNA表達 使用Trizol裂解液提取受試者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中總RNA，以全波長掃描分光光度計在260 nm(A260)和280 nm(A280)處分別掃描，測定總RNA的OD值，計算A260/A280比值及RNA濃度。利用TaKaRa Mix試劑盒進行逆轉錄，以GAPDH為內參基因，應用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)反應體系檢測A20及NLRP3的表達水平。引物序列如下：A20上游引物:5′-TGGCTGAACAAGTCCTTCCT-3′，下游引物:5′-CTTCAGGGTCACCAAGGGTA-3′。NLRP3上游引物:5′-CTGTAACATTCGGAGATTGTGGTT-3′，下游引物:5′-GACCAAGGAGATGTCGAAGCA-3′。GAPDH上游引物:5′-CGAGAAGATGACCCAGATCATG-3′，下游引物:5′-CAGAGGCGTACAGGGATAGCA-3′。

1.2.6 蛋白質免疫印跡(Western blot)檢測A20和NLRP3蛋白表達 依照pierce公司BCA蛋白定量試劑操作指南進行，具體如下：首先利用RIPA裂解液加入適量蛋白酶抑制劑裂解PBMCs，然后根據BCA法將所得蛋白定量，蛋白變性，SDS-PAGE凝膠配制，蛋白上樣，電泳，轉膜，PVDF膜封閉及抗體孵育，顯色，最后采用Chemi-Doc XRS化學發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，并用Quality One軟件對目標條帶進行灰度分析。

1.2.7 酶聯免疫吸附(EIISA)法檢測血漿IL-1β水平 所有入選對象于入院第2天空腹時采集抗凝全血，收集血液約10 ml，離心3 000g，10 min，收集血漿。分裝后-80 ℃冷凍保存待檢。本實驗使用LEGEND MAXTMHuman IL-1β ELISA Kit(Cat. No. 437007)，實驗遵照說明書進行。

2 結果

2.1 研究對象基線資料比較

由表1所見，冠脈無復流組患者年齡較正常血流組患者高(P<0.001)。而且，冠脈無復流組患者較冠脈血流正常組吸煙人數及合并糖尿病者為多，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.027)。冠脈血流正常組的收縮壓及舒張壓均較冠脈無復流組高，有趣的是，舒張壓在兩組間的差異有統(tǒng)計學意義，而收縮壓差異無統(tǒng)計學意義。

表1 兩組間基線資料比較

2.2 冠脈無復流患者A20和NLRP3蛋白表達

與冠脈血流正常組相比,冠脈無復流組患者PBMC中A20蛋白表達水平降低(P<0.05)，而NLRP3蛋白水平升高(P<0.01，見圖1)。

與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01圖1 兩組患者PBMCs中A20和NLRP3蛋白表達比較Figure 1 Comparison of A20 and NLRP3 protein expression in PBMCs between two groups

2.3 冠脈無復流患者A20 mRNA和NLRP3 mRNA的表達

冠脈無復流組患者PBMC中A20的mRNA表達水平較血流正常組患者降低(P<0.001)，而NLRP3的mRNA表達水平升高(P<0.05，見圖2)。

與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01圖2 兩組患者PBMCs中A20和NLRP3的mRNA水平比較Figure 2 Comparison of A20 and NLRP3 mRNA levels in PBMCs between two groups

2.4 冠脈無復流患者血漿IL-1β水平升高

本實驗發(fā)現，與冠脈血流正常組相比,無復流組患者血漿IL-1β水平升高[(3.78±0.33)pg/mlvs(5.11±0.65)pg/ml,P<0.05，見圖3]。

與正常組比較，*P<0.05圖3 兩組患者血漿IL-1β水平比較Figure 3 Comparison of plasma IL-1β level between two groups

2.5 血漿IL-1β水平與GRACE評分呈顯著正相關

實驗結果顯示所有研究對象血漿IL-1β水平與GRACE評分呈顯著正相關(r=0.415 1,P<0.001，見圖4)。

圖4 血漿IL-1β水平與GRACE評分相關性分析Figure 4 Relationship between plasma IL-1β level and the GRACE score

3 討論

隨著經濟及生活方式的急劇改變，加之人口老齡化的迅速進展，冠心病尤其是ACS是當前中老年人群的主要致死致殘原因，給社會公共衛(wèi)生造成嚴重的負擔。近年來，在抗栓及他汀類等藥物聯合治療的基礎上，給予PCI治療，極大地改善了ACS患者的預后。因為PCI可以直觀迅速地解除狹窄或者開通閉塞血管，已被證實成為治療ACS最有效的策略[1]。但仍值得關注的是，目前臨床上仍有一部分ACS患者即使經PCI治療，預后較差。其中，重要的原因之一就是盡管經PCI開通靶血管，病變血管遠端仍表現為無復流，由此心肌低灌注或者再灌注失敗[2,3]。由此，不僅可導致圍手術期急性致死性心血管事件并與患者中遠期預后密切相關。

到目前為止，PCI相關冠脈無復流的具體機制目前尚不清楚，初步研究發(fā)現，潛在的病理機制涉及炎癥免疫反應、內皮功能障礙、微血栓栓塞、微小動脈痙攣及氧化應激等[5,6]。近年來炎癥免疫反應在冠脈無復流中的作用逐漸被重視并加以深入研究。NLRP3炎癥小體由受體蛋白NLRP3、接頭蛋白ASC和效應分子Caspase-1構成的多蛋白復合體[8]。來自于體內外的許多因子可以激活NLRP3炎癥小體進而釋放炎癥因子IL-1β[9]。NLRP3炎癥小體不僅參與調節(jié)機體炎癥免疫，而且是糖尿病及動脈粥樣硬化等代謝性疾病發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[11]。加之，新近研究顯示，A20可以抑制NLRP3炎癥小體活性減少IL-1β釋放，形成A20/NLRP3炎癥小體信號通路[13]。所以，本研究旨在探索A20/NLRP3炎癥小體信號通路與急性冠脈綜合征患者PCI過程中發(fā)生冠脈無復流的相關性，明確A20/NLRP3炎癥小體信號通路在冠脈無復流中的可能作用，為進一步探索防治冠脈無復流的新靶點提供重要實驗依據和理論指導。

正如預期所示，本研究發(fā)現無復流組患者較正常血流患者年齡明顯增高。而且，無復流組患者吸煙人數及合并糖尿病人數較多，兩組間差異有統(tǒng)計學意義。由此說明，本研究結果與以往研究結果相符，老齡、糖尿病及吸煙是冠脈無復流發(fā)生的危險因素[4,5,15]。值得關注的是，本研究首次發(fā)現，與正常血流組相比,無復流組患者PBMC中A20蛋白和mRNA表達水平降低，而NLRP3蛋白和mRNA水平升高。由此說明，冠脈無復流患者A20表達下降而NLRP3表達升高，二者可能存在著調控關系。而且，我們的前期研究發(fā)現GRACE評分與冠脈無復流顯著相關，所以該研究進一步探索血漿IL-1β水平與GRACE評分是否相關，以初步明確NLRP3炎癥小體活性在冠脈無復流中的作用。研究結果顯示，與正常血流組相比,無復流組患者血漿IL-1β水平升高，而且血漿IL-1β水平與GRACE評分呈顯著正相關。血漿IL-1β是NLRP3炎癥小體活化后剪切釋放的炎癥因子，可以參與機體廣泛的炎癥免疫反應及多種代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展。所以，IL-1β水平在一定程度代表NLRP3炎癥小體活化程度[8]。由此可見，A20/NLRP3炎癥小體信號通路可能參與了冠脈無復流，機體炎癥免疫反應是冠脈無復流發(fā)生發(fā)展的重要機制。

綜上所述，本研究結果顯示A20/NLRP3炎癥小體信號通路與ACS患者PCI無復流密切相關，A20/NLRP3炎癥小體信號通路可能成為ACS患者PCI過程中發(fā)生冠脈無復流的有效防治靶點。