陳小英,姚明龍,林燕云,鄭關(guān)毅

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科，福州 350001；*通訊作者,E-mail:xycpt21@sina.com)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性炎癥疾病，可引起血管內(nèi)皮障礙、血脂代謝紊亂、炎癥因子激活等，是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，可導(dǎo)致心肌梗死、冠心病等疾病的發(fā)生，因此防治AS顯得尤為重要[1,2]。RhoA/ROCK信號(hào)通路與AS的形成密切相關(guān)，研究顯示，抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路可抑制血管鈣化、炎癥反應(yīng)、血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移等多種過(guò)程，進(jìn)而抑制AS的形成[3]。RhoA/ROCK通過(guò)調(diào)控NF-κB的活化，抑制RhoA/ROCK/NF-κB通路可抑制炎癥反應(yīng)，減輕心肌缺血-再灌注損傷[4]。益腎活血化痰方主要由熟地、枸杞、山茱萸等中藥組成，臨床顯示，益腎活血化痰方可改善2型糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化患者中醫(yī)證候及頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度、斑塊數(shù)目、血流速度、血流阻力等[5]。本研究在臨床應(yīng)用基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從RhoA/ROCK/NF-κB信號(hào)通路途徑探討益腎活血化痰方對(duì)AS的抗炎作用機(jī)制，為臨床治療AS提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性ApoE-/-小鼠，體質(zhì)量19～26 g，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2018-0044]。

1.1.2 藥物和試劑 益腎活血化痰方(熟地20 g，枸杞15 g，山茱萸12 g，菟絲子12 g，山藥12 g，赤芍15 g，牛膝15 g，丹皮9 g，陳皮6 g，半夏9 g等)購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院中藥房，中藥預(yù)先浸泡30 min后水煎2次，再合并水煎液，于水浴鍋中濃縮成含生藥量2 g/ml，分裝凍存?zhèn)溆谩０⑼蟹ニ♀}片(國(guó)藥準(zhǔn)字H20163270，20 mg)購(gòu)自樂(lè)普制藥科技有限公司；通用SP檢測(cè)試劑盒(SP0041)購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；油紅O(O0625)、Y-27632(Y0503，純度≥98%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0011)、RIPA裂解液(P0033)購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；RhoA(ab86297)、ROCK(ab134181)、p-NF-κB p65(ab239882)、NF-κB p65(ab207297)抗體、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab6721)、TNF-α(ab208348)、IL-1β(ab197742)、IL-6(ab222503)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，制備AS模型，將小鼠分為對(duì)照組與AS模型組，AS模型組小鼠給予高脂飼料(含脂肪21%，膽固醇0.15%)喂養(yǎng)12周，對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，造模后，隨機(jī)取5只小鼠處死，在光鏡下觀察小鼠心臟主動(dòng)脈根部有AS斑塊形成，即為造模成功[6]。

將小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、藥物組(益腎活血化痰方)、抑制劑組和陽(yáng)性藥物組，每組10只，小鼠給藥量根據(jù)公式=9.1×成人臨床藥量[g/(kg·d)]換算，藥物組小鼠造模后使用303 mg/kg益腎活血化痰方灌胃給藥，陽(yáng)性藥物組小鼠造模后使用3.03 mg/kg的阿托伐他汀[7]給藥，藥物使用蒸餾水溶解后灌胃給藥，對(duì)照組與模型組給予灌胃等量的蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥兩周，抑制劑組小鼠造模后僅腹腔注射ROCK抑制劑Y-27632(5 mg/kg)，連續(xù)給藥3 d。

1.2.2 主動(dòng)脈油紅O染色 給藥后小鼠眼眶取血，3 000 r/min離心10 min，收集血清，-80 ℃保存，用于血清炎癥因子與血脂檢測(cè)。脫頸處死10只小鼠，取胸主動(dòng)脈，其中5只使用4%甲醛固定過(guò)夜，分別使用10%，20%和30%蔗糖溶液脫水，切片后使用油紅O染色，封片晾干后，顯微鏡(型號(hào)：Ⅸ71，日本Olympus公司)觀察并拍照，Image J圖像分析軟件分析斑塊面積比，斑塊面積比=斑塊面積/管腔面積×100%。

1.2.3 血清炎癥因子與血脂檢測(cè) 將各組小鼠眼眶取血的血清按2倍稀釋后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)血清炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)水平，自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血脂(TG、TC、LDL-C、HDL-C)水平。

1.2.4 免疫組化染色 取另外5只小鼠的主動(dòng)脈組織，其中一部分保存用于Western blot檢測(cè)，另一部分石蠟包埋切片，使用SP試劑盒進(jìn)行染色，切片經(jīng)二甲苯脫蠟乙醇梯度脫水后封閉，分別加入IL-1β一抗和二抗進(jìn)行孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，顯微鏡觀察，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕色至棕褐色著色，Image Pro Plus軟件檢測(cè)圖片平均光密度值。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)主動(dòng)脈組織RhoA、ROCK、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白 取小鼠主動(dòng)脈組織50 mg，研磨后加入蛋白裂解液，冰上裂解1 h后離心取上清液，BCA對(duì)蛋白進(jìn)行定量，取30 μg蛋白煮沸變性后，電泳分離并轉(zhuǎn)膜，10%脫脂奶粉封閉2 h，加入RhoA(1 ∶1 000稀釋)、ROCK(1 ∶1 000稀釋)、p-NF-κB p65(1 ∶1 500稀釋)、NF-κB p65(1 ∶1 500稀釋)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗孵育并顯色放大，凝膠成像儀(型號(hào)JP-2880，上海金鵬分析儀器有限公司)成像，Image J圖像分析軟件分析蛋白，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)水平，以p-NF-κB p65/NF-κB p65表示NF-κB p65磷酸化水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 益腎活血化痰方對(duì)AS小鼠血脂水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清TG、TC、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，藥物組、抑制劑組、陽(yáng)性藥物組小鼠清TG、TC、LDL-C水平顯著降低，HDL-C水平顯著升高(P<0.05)，藥物組與陽(yáng)性藥物組、藥物組與抑制劑組之間各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表1)。結(jié)果表明，益腎活血化痰方與陽(yáng)性藥物、抑制劑的藥效一樣，具有降低AS小鼠血脂水平的作用。

表1 益腎活血化痰方對(duì)AS小鼠血脂水平的影響

2.2 益腎活血化痰方對(duì)AS小鼠主動(dòng)脈斑塊面積的影響

油紅O染色顯示脂肪斑塊呈橘紅色或紅色，對(duì)照組未見(jiàn)明顯斑塊，模型組小鼠斑塊明顯，斑塊面積百分比較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，藥物組、抑制劑組、陽(yáng)性藥物組斑塊面積顯著降低(P<0.05)，藥物組與陽(yáng)性藥物組、藥物組與抑制劑組斑塊面積差異不顯著(P>0.05，見(jiàn)圖1和表2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明益腎活血化痰方與陽(yáng)性藥物、ROCK抑制劑作用一樣，均有降低AS小鼠主動(dòng)脈斑塊面積的作用。

圖1 益腎活血化痰方對(duì)AS小鼠主動(dòng)脈斑塊面積的影響 (油紅O染色，×100)Figure 1 The effect of Yishen Huoxue Huatan formula on the aortic plaque area of AS mice (oil red O staining, ×100)

表2 益腎活血化痰方對(duì)AS小鼠主動(dòng)脈斑塊面積的影響

2.3 益腎活血化痰方對(duì)AS小鼠血清炎癥因子的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，藥物組、抑制劑組、陽(yáng)性藥物組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P<0.05)，藥物組與陽(yáng)性藥物組、藥物組與抑制劑組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表3)，表明益腎活血化痰方和陽(yáng)性藥物、ROCK抑制劑均有抑制血清炎癥因子釋放的作用。

表3 益腎活血化痰方對(duì)AS小鼠血清炎癥因子的影響

2.4 各組AS小鼠主動(dòng)脈組織IL-1β免疫組化染色結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠主動(dòng)脈組織褐色著色加深，IL-1β陽(yáng)性表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，藥物組、抑制劑組、陽(yáng)性藥物組小鼠主動(dòng)脈組織褐色著色減輕，IL-1β陽(yáng)性表達(dá)減少(P<0.05)，藥物組與陽(yáng)性藥物組、藥物組與抑制劑組IL-1β陽(yáng)性表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖2與表4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示益腎活血化痰方和陽(yáng)性藥物、ROCK抑制劑均有抑制炎癥因子表達(dá)的作用。

褐色為IL-1β陽(yáng)性表達(dá)，藍(lán)色為細(xì)胞核圖2 各組小鼠主動(dòng)脈組織IL-1β免疫組化染色結(jié)果 (SP，×200)Figure 2 Immunohistochemical staining of IL-1β in aorta tissue of mice in each group (SP,×200)

表4 各組小鼠主動(dòng)脈組織IL-1β免疫組化染色結(jié)果比較

2.5 益腎活血化痰方對(duì)AS小鼠主動(dòng)脈組織RhoA、ROCK、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠主動(dòng)脈組織RhoA、ROCK、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，藥物組、抑制劑組、陽(yáng)性藥物組小鼠主動(dòng)脈組織RhoA、ROCK蛋白表達(dá)水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65顯著減少(P<0.05)，藥物組與抑制組各蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05，見(jiàn)圖3與表5)。此結(jié)果提示益腎活血化痰方與ROCK抑制劑均有抑制RhoA/ROCK/NF-κB信號(hào)通路激活的作用。

圖3 各組小鼠主動(dòng)脈組織RhoA、ROCK、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)Figure 3 Expression of RhoA, ROCK, p-NF-κB p65 protein in aortic tissue of mice in each group by Western blot

表5 小鼠主動(dòng)脈組織RhoA、ROCK、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)比較

3 討論

AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程與脂質(zhì)代謝異常、炎癥因子釋放、血管內(nèi)皮損傷等有密切關(guān)系，因此緩解炎癥反應(yīng)、改善脂質(zhì)代謝對(duì)于治療AS有重要意義[8]。ApoE-/-小鼠通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)建立AS模型是常用的動(dòng)物模型，本研究顯示建模后，AS小鼠血清炎癥因子水平與血脂水平升高，主動(dòng)脈斑塊面積增大，與以往報(bào)道結(jié)果類似[9]。

中醫(yī)上AS應(yīng)屬于中醫(yī)“血瘀證”、“痰證”等范疇，造成AS形成的因素來(lái)自“虛”和“損”兩個(gè)方面，其中“虛”以腎虛為主，“損”以痰阻血瘀為主，腎虛影響腎之精氣，而致血瘀、痰阻，痰、瘀等損傷性因素可侵入脈絡(luò)，導(dǎo)致AS的發(fā)生[10]。使用活血祛痰法、活血法防治AS已得到研究證實(shí)[11,12]。根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)使用益腎活血化痰方的AS病人癥狀及頸動(dòng)脈斑塊等均有改善，此方主要使用左歸丸加活血化痰中藥，主要包括山藥、熟地、枸杞、山茱萸等多味中藥，方中熟地、枸杞、山茱萸、菟絲子、山藥滋補(bǔ)腎陰，赤芍、牛膝、丹皮涼血活血化淤，陳皮、半夏燥濕化痰，防涼血不利氣機(jī)暢通之弊，諸藥合用具有益腎活血化痰之效。本研究給予小鼠益腎活血化痰方治療后，可顯著降低小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，改善小鼠的血脂異常，降低小鼠主動(dòng)脈病變斑塊的面積，與阿托伐他汀治療的效果類似，提示益腎活血化痰方對(duì)改善AS有一定效果。研究顯示，炎癥是AS發(fā)生的基礎(chǔ)，在AS的發(fā)展過(guò)程中多種促炎因子如TNF-α、IL-6顯著升高[13]。過(guò)量的脂質(zhì)攝入會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，激活NF-κB等信號(hào)通路，促進(jìn)促炎因子IL-6、IL-1β等釋放，促進(jìn)AS的形成[14]。

RhoA/ROCK信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可以引起血管內(nèi)皮損傷，在AS、高血壓、糖尿病、腦血管疾病等疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，研究顯示，AS的形成與RhoA/ROCK信號(hào)通路的激活密切相關(guān)[15,16]。RhoA/ROCK通路通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞功能，誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，導(dǎo)致AS形成[17]。NF-κB是炎性因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的主要因子，NF-κB可放大炎癥信號(hào)、激活凋亡因子、誘導(dǎo)AS的形成，NF-κB p65通路的激活以磷酸化形式存在(p-NF-κB p65)，研究顯示，丹酚酸B可減輕AS小鼠肝臟炎癥反應(yīng)，可能與抑制MAPKs/NF-κB信號(hào)通路、下調(diào)炎癥因子水平有關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示，益腎活血化痰方治療后，AS模型小鼠主動(dòng)脈組織RhoA、ROCK蛋白表達(dá)及p-NF-κB p65/NF-κB p65顯著降低，表明RhoA/ROCK信號(hào)通路及NF-κB p65通路激活受到到抑制。研究顯示，RhoA/ROCK可調(diào)控NF-κB參與炎癥反應(yīng)，抑制RhoA/ROCK/NF-κB信號(hào)通路可減輕晚期糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷[19]。本研究結(jié)果顯示，抑制劑組RhoA、ROCK蛋白表達(dá)水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65也顯著減少，提示益腎活血化痰方可能抑制RhoA/ROCK/NF-κB信號(hào)通路的激活，且本研究還顯示，益腎活血化痰方與ROCK信號(hào)通路抑制劑治療小鼠的效果類似，證實(shí)益腎活血化痰方具有抑制RhoA/ROCK/NF-κB通路的作用。

綜上所述，益腎活血化痰方可能通過(guò)抑制RhoA/ROCK/NF-κB信號(hào)通路激活，改善AS小鼠血脂代謝，減輕AS小鼠炎癥反應(yīng)。但本研究尚存在不足之處，后續(xù)將通過(guò)使用通路抑制劑進(jìn)一步驗(yàn)證益腎活血化痰方對(duì)該通路的具體機(jī)制。