寇 博，石玉晗，劉 偉

(1西安交通大學醫(yī)學部第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，西安 710061；2汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院甲乳外科；3西安交通大學醫(yī)學部第一附屬醫(yī)院血管外科；*通訊作者,E-mail:lizhang1988617@163.com)

甲狀腺癌是世界上最為常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤之一，2021年美國新增甲狀腺癌人數(shù)約44 280人，新增死亡人數(shù)約2 200人。而在發(fā)展中國家，該病的發(fā)病率和死亡率亦呈顯著上升趨勢[1]。部分學者認為新型的生物靶向可能為甲狀腺癌患者的治療提供新的思路。肝激酶B1(liver kinase B1，LKB1)，又稱絲氨酸/蘇氨酸激酶11，是一種細胞內(nèi)廣泛分布的蛋白激酶，最早在黑斑息肉綜合征中被發(fā)現(xiàn)[2]。研究顯示，LKB1參與細胞自我更新、代謝、極性等一系列生物學行為[3-5]。也有文獻報道LKB1在肺癌、胃癌等多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[6,7]。而在甲狀腺癌中，黃志強等[8]學者研究顯示LKB1能夠抑制甲狀腺癌K1細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。但LKB1對甲狀腺癌血管生成的影響尚未見報道。本研究利用免疫組化實驗比較p-LKB1在甲狀腺癌組織和癌旁正常組織中的表達情況，以及甲狀腺癌患者臨床病理指標不同亞型間p-LKB1的表達差異；并構(gòu)建過表達LKB1的甲狀腺癌細胞模型，探究LKB1過表達對甲狀腺癌K1細胞血管生成的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗標本

收集2020年1月至2021年6月西安交通大學第一附屬醫(yī)院病理科確診為甲狀腺乳頭狀癌患者的甲狀腺癌組織及癌旁正常組織標本各50例。其中男性12例，女性38例；年齡28～73歲，平均(44.48±13.46)歲。除年齡、性別外，還收集了甲狀腺癌患者的腫瘤大小、腫瘤包膜侵犯與否、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、臨床分期以及腫物多中心性5個臨床病理指標信息。本研究經(jīng)西安交通大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準(文號G-209)，患者簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標準

納入標準：①均為首次甲狀腺手術患者，并同期行中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃或頸部淋巴結(jié)清掃術；②術中快速冰凍切片及術后病理HE染色確診為甲狀腺癌；③術前無化療、放療及免疫治療史；④年齡為18～80歲。

排除標準：①復發(fā)性甲狀腺癌；②合并其他惡性腫瘤疾??；③妊娠期或者哺乳期孕婦。

1.3 主要試劑與細胞培養(yǎng)

DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清、0.25%胰酶購自美國Gibco公司，BCA蛋白檢測試劑盒購自上海Beyotime公司，磷酸化LKB1(p-LKB1)、VEGFA和β-actin單克隆抗體購自武漢三鷹生物公司，過表達質(zhì)粒、ELISA檢測試劑盒以及免疫組化試劑盒購自北京擎科生物公司，Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑購自美國Biosystems公司，PCR Master Mix購自美國Roche公司。

甲狀腺乳頭狀癌K1細胞株以及人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)均來自西安交通大學第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心實驗室。上述細胞均用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素，細胞置于37 ℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 免疫組化檢測p-LKB1在甲狀腺組織中的蛋白表達

采用免疫組化SP法染色檢測p-LKB1在甲狀腺癌組織中的蛋白表達：所有標本均經(jīng)甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋后連續(xù)切片，切片厚度為4 μm，具體步驟參照試劑盒說明書操作。其中一抗為鼠抗人p-LKB1單克隆抗體(工作液稀釋為1 ∶50)。高倍顯微鏡下p-LKB1陽性表達定位于細胞漿和細胞核，陰性表達定位于細胞核內(nèi)。單個標本隨機選取10個視野，于倒置顯微鏡下觀察，鏡下判斷標準[9]：①顯色程度，按細胞著色強度計分：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，紫褐色為3分；②顯色細胞數(shù)，按p-LKB1定位于胞漿的細胞著色面積計分：無著色為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，大于50%為3分；③表達陽性以著色強度與著色面積積分之和進行判斷：0～1分判定為陰性，≥2分判定為陽性(2分為弱陽性，3～4分為中陽性，5～6分為強陽性)。

1.5 過表達LKB1的甲狀腺細胞系構(gòu)建

取生長狀態(tài)良好的甲狀腺癌K1細胞進行實驗。于兩個無RNA酶的EP管內(nèi)，各加入100 μl不含血清的培養(yǎng)基。于其中一個EP管內(nèi)加入2 μg過表達LKB1質(zhì)?；騈C質(zhì)粒，于另一個EP管內(nèi)加入8 μl X-tremeGENE DNA轉(zhuǎn)染試劑，各靜置5 min。隨后將兩管混液進一步混合并靜置15 min，后加入甲狀腺癌K1細胞內(nèi)繼續(xù)孵育48 h，從而構(gòu)建過表達LKB1的甲狀腺癌K1/OE-LKB1以及對照組K1/NC細胞系。最后提取上述兩組細胞系的蛋白或RNA為后續(xù)的Western blot和實時定量PCR等細胞學實驗做前期準備；并以這兩種細胞系為基礎，利用ELISA實驗、小管形成實驗和HUVEC遷移實驗探究LKB1對甲狀腺癌血管生成的影響。

1.6 Western blot檢測p-LKB1在甲狀腺癌細胞內(nèi)的蛋白表達

細胞培養(yǎng)皿內(nèi)的甲狀腺癌K1/OE-LKB1和K1/NC細胞，經(jīng)PBS緩沖液清洗后，用RIPA蛋白裂解液裂解10 min，離心后提取上清液。隨后利用BCA蛋白檢測試劑盒進行蛋白定量，即通過酶標儀器測量570 nm處吸光度值(OD值)，繪制標準曲線，利用標準曲線計算各組蛋白濃度。然后配制10%SDS-PAGE分離膠、5%SDS-PAGE濃縮膠，每個泳道取25 μg變性蛋白作聚丙烯酰胺凝膠電泳。用PVDF膜轉(zhuǎn)膜2 h，條帶用10%脫脂牛奶封閉1 h，加入p-LKB1、β-actin抗體(稀釋度均為1 ∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜。PBST洗膜后加入HRP標記的相應二抗(稀釋度為1 ∶1 000)，室溫孵育約1 h，PBST再次洗膜。后用化學發(fā)光儀進行發(fā)光顯影。

1.7 實時定量PCR檢測LKB1在甲狀腺癌細胞內(nèi)的mRNA表達

1.8 ELISA實驗檢測甲狀腺K1細胞內(nèi)VEGFA含量

甲狀腺癌對照組及過表達LKB1組的細胞株(K1/NC組和K1/OE-LKB1組)置于75 cm2的培養(yǎng)瓶，長滿至瓶底面積80%～90%，PBS洗滌2次，無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸取細胞培養(yǎng)液至無菌離心管，離心后取上清液，即條件培養(yǎng)基，置于EP管中保存?zhèn)溆?。對于ELISA實驗，則通過ELISA檢測試劑盒檢測上述條件培養(yǎng)基內(nèi)VEGFA的含量。

取出VEGFA ELISA試劑盒，室溫下放置30 min。取出96孔板，分別設置標準品組(6個濃度)、空白孔、待測樣品組。依照標準品的順序分別加入100 μl的標準品溶液于96孔板內(nèi)；空白對照孔加入100 μl水；其余微孔中加入100 μl待測樣本。隨后在標準品組、待測樣本組各孔中加入50 μl酶標溶液，空白孔除外。37 ℃溫育1 h，棄液甩干，用稀釋后的洗滌液注滿各孔，靜置30 s，用吸水紙徹底拍干，重復清洗5次。各孔加入顯色劑A液50 μl，再加入顯色劑B液50 μl。37 ℃避光顯色15 min，隨后各孔加入50 μl終止液。最后在450 nm波長下讀取各孔吸光度值(OD值)。

1.9 小管形成實驗檢測過表達LKB1對甲狀腺癌K1細胞血管形成的影響

預先在冰上將基質(zhì)膠鋪于96孔板，每孔50 μl，置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱孵育4 h。將消化離心的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞HUVEC分別用上述甲狀腺癌K1/NC和K1/OE-LKB1細胞獲取的條件培養(yǎng)基重懸，混勻的HUVEC細胞和條件培養(yǎng)基均勻鋪于基質(zhì)膠上，于細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，鏡下觀察小管形成情況。

1.10 HUVEC遷移實驗檢測過表達LKB1對HUVEC細胞遷移能力的影響

在96孔板內(nèi)，HUVEC細胞以每孔200 μl無血清培養(yǎng)基，含2×104細胞數(shù)的細胞密度接種于Transwell小室的上室，隨后在96孔板內(nèi)每孔接種800 μl條件培養(yǎng)基。96孔板置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，用棉簽去除Transwell上室的細胞，并將Transwell小室下表面用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡計數(shù)Transwell小室表面的細胞數(shù)，觀察HUVEC細胞的遷移情況。

1.11 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 LKB1在甲狀腺癌及癌旁正常組織中的表達

免疫組化結(jié)果顯示，p-LKB1蛋白陽性表達主要定位于細胞漿和細胞核，陰性表達定位于細胞核內(nèi)，為棕色顆粒(見圖1)。甲狀腺癌組織p-LKB1蛋白的陽性表達率低于其在癌旁正常組織內(nèi)的陽性表達率，差異有統(tǒng)計學意義(26.0%vs78.0%,P<0.05，見圖1和表1)。

圖1 p-LKB1在甲狀腺癌組織及癌旁正常組織中的表達Figure 1 The expression of p-LKB1 in thyroid carcinoma and adjacent normal tissues

表1 甲狀腺癌和癌旁正常組織中p-LKB1的表達

2.2 甲狀腺癌組織中p-LKB1的表達與臨床病理特征的關系

通過納入年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期以及腫物多中心性7個不同指標，探究甲狀腺癌組織中p-LKB1的表達與其臨床病理指標不同亞型間的關系。結(jié)果顯示，p-LKB1的表達與甲狀腺癌的腫瘤大小、包膜侵犯與否、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而與甲狀腺癌患者的年齡、性別、臨床分期及腫瘤是否多中心性無關(P>0.05，見表2)。

表2 甲狀腺癌組織中p-LKB1表達與臨床病理特征間的關系 (例)

2.3 LKB1過表達細胞系的成功構(gòu)建

為開展后續(xù)實驗，首先構(gòu)建過表達LKB1的甲狀腺癌細胞體系，即K1/NC(K1/negative control)和K1/OE-LKB1(K1/LKB1 overexpression)。Western blot結(jié)果顯示，過表達LKB1的甲狀腺癌細胞內(nèi)p-LKB1蛋白表達顯著高于其在NC組的表達(見圖2A)；且隨后的PCR實驗也驗證了LKB1在甲狀腺癌K1/OE-LKB1組內(nèi)的高表達(見圖2B)。這些提示成功構(gòu)建LKB1過表達的甲狀腺癌細胞模型。

與NC組比較，****P<0.000 1圖2 過表達LKB1甲狀腺癌細胞系的構(gòu)建及驗證Figure 2 Construction and validation of thyroid carcinoma cells with LKB1 overexpression

2.4 LKB1在甲狀腺癌中對VEGFA的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示，過表達LKB1可以下調(diào)甲狀腺癌K1細胞內(nèi)VEGFA的蛋白表達水平(見圖3A)。隨后的ELISA結(jié)果顯示過表達LKB1能夠抑制K1細胞內(nèi)VEGFA的分泌(見圖3B)。這些結(jié)果提示LKB1抑制甲狀腺癌K1細胞內(nèi)VEGFA的表達。

與NC組比較，****P<0.000 1圖3 LKB1對甲狀腺癌細胞內(nèi)VEGFA的影響Figure 3 Effects of LKB1 on VEGFA in thyroid carcinoma cells

2.5 LKB1對甲狀腺癌細胞血管形成和HUVEC招募的影響

為了明確LKB1對甲狀腺癌新生血管形成的影響，小管形成實驗結(jié)果顯示，過表達LKB1細胞系的條件培養(yǎng)基能夠抑制甲狀腺癌細胞內(nèi)小管的生成(見圖4A)。隨后的HUVEC細胞遷移實驗顯示，甲狀腺癌K1細胞內(nèi)LKB1的過表達能夠抑制HUVEC細胞的遷移(見圖4B)。這說明LKB1的過表達能夠在體外抑制甲狀腺癌的血管生成。

與NC組比較，**P<0.01，****P<0.000 1圖4 LKB1過表達對甲狀腺癌血管生成和HUVEC招募的影響 (×100)Figure 4 Effects of LKB1 overexpression on angiogenesis and HUVEC recruitment in thyroid carcinoma (×100)

3 討論

LKB1基因位于人類染色體19p13.3，主要編碼一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。研究顯示LKB1的失活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[10]。但關于LKB1在甲狀腺組織中的表達僅有初步報道[11]。鑒于此現(xiàn)狀，本研究以甲狀腺癌組織中LKB1的表達作為切入點，結(jié)果顯示甲狀腺癌組織中p-LKB1的陽性表達率顯著低于癌旁正常組織。臨床病理特征能夠從多個不同方面、較為客觀地反映患者的病情嚴重與否，因此分析蛋白表達與患者臨床病理特征的關系可以間接地說明該蛋白對病情的影響[12]。本研究比較了甲狀腺癌7個臨床病理指標的不同亞型間LKB1蛋白的表達差異，結(jié)果顯示癌組織LKB1在腫瘤大于1 cm、有包膜侵犯以及合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者中呈低表達，說明低表達的LKB1可視作甲狀腺癌惡性程度高的標志之一，這與既往研究所述LKB1在腫瘤進程中的作用相符[13,14]。

文獻報道LKB1的過表達對甲狀腺癌K1細胞增殖與遷移能力有顯著的抑制作用[8]。另有研究顯示(V600E)BRAF的抑制能夠通過LKB1-AMPK信號通路誘導甲狀腺癌保護性自噬過程[15]。但目前LKB1對腫瘤血管生成的研究相對較少。早期的文獻報道，LKB1的過表達可減緩乳腺癌的血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移能力[16]。本研究通過細胞生物學實驗揭示過表達LKB1不僅能夠抑制甲狀腺癌K1細胞內(nèi)VEGFA的表達及分泌，而且可以抑制K1細胞的血管新生及對HUVEC細胞的遷移。

綜上所述，甲狀腺癌組織中LKB1表達陽性率低于癌旁組織，且腫瘤大于1 cm有包膜侵犯以及合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺患者LKB1陽性表達率較低。此外LKB1的過表達可以抑制甲狀腺癌K1細胞的血管生成。這些提示LKB1可能是影響甲狀腺癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的重要指標，且LKB1有可能為臨床抗甲狀腺癌治療提供新的潛在靶點。