肖 強(qiáng)，郭子龍，楊曉宏

（1.張家口市第一醫(yī)院，河北 張家口 075000；2.張家口市萬全區(qū)中醫(yī)院，河北 張家口 076250）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是以膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)不同程度腫脹、疼痛、活動(dòng)受限等為臨床表現(xiàn)的一種退行性病變[1]，改善臨床癥狀、延緩軟骨退變是治療KOA的原則。研究顯示W(wǎng)nt/β-catenin通路在KOA的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，該通路可調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解及骨贅形成的動(dòng)態(tài)平衡，一旦該通路被過度激活則上述穩(wěn)態(tài)被破壞，軟骨細(xì)胞病理性凋亡被放大，細(xì)胞外基質(zhì)降解進(jìn)程加速，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞退化，最終加速KOA的惡化[2-3]。因此，抑制Wnt/βcatenin通路，可最終實(shí)現(xiàn)延緩膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的目的。

近年來，中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)病的優(yōu)勢逐漸凸顯，川芎嗪（2,3,5,6-四甲基吡嗪，Ligustrazine）是從活血化瘀類中藥川芎中提取出來的一種有效活性生物堿，能有效治療KOA[4-5]，但其作用機(jī)制尚處于探索階段。本研究以KOA模型大鼠為觀察對象，利用不同的分子生物學(xué)手段進(jìn)行研究，以期進(jìn)一步探討川芎嗪延緩膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級雄性SD大鼠100只，體質(zhì)量（230±20）g，鼠齡（55±2）d，由徐州醫(yī)科大學(xué)提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2015-0009。于徐州醫(yī)科大學(xué)SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（23±1）℃，相對濕度（70±5）%，晝夜12 h/12 h交替。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程動(dòng)物均可自由飲食及飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理制度和使用委員會(huì)批準(zhǔn)而進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的操作和處理均嚴(yán)格按照《徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理指南》進(jìn)行，倫理批件號：2930233-A1。

1.2 藥物與試劑磷酸川芎嗪片（北京市燕京藥業(yè)有限公司，批號：522453，國藥準(zhǔn)字H11021964，規(guī)格：50 mg/片）；塞來昔布膠囊（輝瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字J20140072，規(guī)格：200 mg/粒）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司；貨號：C0105）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒（武漢純度生物技術(shù)有限公司，貨號：CD-13503-ML）；Trizol試劑（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，貨號：283912）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司，貨號：23227）；番紅-固綠染色試劑盒（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，貨號：293342）；Wnt-3a一抗（貨號：ab15251）、MMP-13一抗（貨號：ab36121）、β-catenin一抗（貨號：ab16051）均購自美國Abcam公司；β-actin一抗（美國CST公司，貨號：4970s）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（石四藥翰林生物技術(shù)有限公司，貨號：HSGR-HRP-500）；超敏ECL發(fā)光液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號：P1030-100）；抑制劑Dickkopf-1（美國StemRD公司，貨號：DKK-100）。

1.3 主要儀器Optima MAX-XP型高速離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特有限公司）；BioTek-26262059型多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek伯騰有限公司）；HT-1000TBT型蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限公司）；ZD-9560型脫色搖床（江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司）。

1.4 造模與分組將100只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、川芎嗪組、塞來昔布組及抑制劑組，每組20只。除空白組外，其余各組大鼠用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，待大鼠充分麻醉后參考文獻(xiàn)[6]中改良Hulth法進(jìn)行模型制備，方法具體如下：取左側(cè)膝關(guān)節(jié)為術(shù)側(cè)，從左膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路，將膝關(guān)節(jié)充分暴露于術(shù)野，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶后將內(nèi)側(cè)半月板摘除，隨后將前交叉韌帶切除，再用可吸收外科縫合線將創(chuàng)口縫合，術(shù)后青霉素腹腔注射預(yù)防感染，20萬U/d，連續(xù)注射3 d。造模次日進(jìn)行干預(yù)。抑制劑組大鼠造模術(shù)前腹腔注射Wnt/β-catenin信號通路抑制劑Dickkopf-1。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥川芎嗪組及抑制劑組大鼠給予磷酸川芎嗪溶液灌胃，將臨床上人服用的常規(guī)劑量按照大鼠與人體間等效劑量換算，再根據(jù)文獻(xiàn)[7]將干預(yù)劑量設(shè)置為100 mg/kg，1次/d；塞來昔布組大鼠給予塞來昔布溶液灌胃，劑量換算同川芎嗪組，參考文獻(xiàn)[7]將其劑量定為24 mg/kg，1次/d；空白組、模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃；連續(xù)給藥28 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 一般情況 觀察各組大鼠皮毛光亮程度、飲食情況、有無跛行、活動(dòng)頻次、后肢著地時(shí)間等。

1.6.2 關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)評分 采用改良Mankin關(guān)節(jié)軟骨病理評分標(biāo)準(zhǔn)對各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨的病理學(xué)改變進(jìn)行評分，具體分級如下，正常：0～1分；輕度改變：2～5分；中度改變：6～9分；重度改變：10～14分。具體見表1。

表1 改良Mankin關(guān)節(jié)軟骨病理評分標(biāo)準(zhǔn)

1.6.3 機(jī)械痛閾檢測 造模前，以及造模后1、7、14、28 d對各組大鼠進(jìn)行機(jī)械刺激縮爪閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）檢測。實(shí)驗(yàn)前3 d對所有大鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，將大鼠置于長寬高均為30 cm的透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)觀察，1次/d，30 min/次。MWT：將觀察箱置于金屬架上，架子置一帶有小孔的鐵絲網(wǎng)，大鼠置于觀察箱內(nèi)，待其完全適應(yīng)后測試者將Von Frey纖維絲穿過鐵絲網(wǎng)格刺激大鼠后肢足底正中足掌部，使Von Frey纖維絲稍彎成“S”形，持續(xù)6 s。大鼠出現(xiàn)肢體收縮、舔足、抬足等動(dòng)作，為陽性反應(yīng)（+），大鼠出現(xiàn)陽性反應(yīng)（+）后更換刻度較小的Von Frey纖維絲進(jìn)行再刺激，如果為陰性表現(xiàn)則更換刻度更大的Von Frey纖維絲進(jìn)行刺激，中間間隔不少于10 s。記錄連續(xù)刺激5次時(shí)纖維絲的力度值。

1.6.4 膝關(guān)節(jié)影像學(xué)變化 采用X-ray對各組大鼠左側(cè)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行掃描，各組隨機(jī)選取6只大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后固定于小動(dòng)物成像儀中掃描成像，操作過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，觀察各組大鼠膝關(guān)節(jié)影像學(xué)改變。

1.6.5 動(dòng)物取材 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后處死，用鋒利手術(shù)刀于冰上快速取下股骨下1/3部分，將樣本快速置于10%中性甲醛的固定液中，室溫下靜置48 h，固定后取出樣本置于10%EDTA脫鈣劑中充分脫鈣8周，脫鈣過程中每2 d更換1次脫鈣液，待組織完全脫鈣后摒棄脫鈣液，用流動(dòng)水漂洗樣本120 min，隨后用鋒利手術(shù)刀將關(guān)節(jié)軟骨切下后修切成2 mm×3 mm×4 mm塊狀，隨后用梯度酒精進(jìn)行脫水，二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋，置于-20℃冰箱備用。

1.6.6 軟骨組織HE染色 每組隨機(jī)選取6只大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后處死，用鋒利手術(shù)刀于冰上快速取下股骨下1/3部分，樣本制作過程同“1.6.5”，切片程序性脫蠟后放入蘇木精溶液中染色3 min，分別放入酸水及氨水中數(shù)秒以分色，流水沖洗1 h時(shí)；先后放入70%、90%乙醇溶液，每種溶液10 min進(jìn)行脫水；放入酒精伊紅溶液染色3 min；采用光學(xué)顯微鏡（×400）觀察每張關(guān)節(jié)軟骨切片的形態(tài)學(xué)特征。

1.6.7 軟骨組織番紅O染色 取“1.6.6”樣本程序性脫蠟后蒸餾水沖洗后入Safranin O stain內(nèi)浸染，蒸餾水沖洗；用Safranin分化液洗滌切片，蒸餾水沖洗；分別用95%乙醇、無水乙醇脫水；二甲苯透明，用中性樹膠封片、光鏡下顯色拍照記錄。

1.6.8 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡情況 每組隨機(jī)選取6只大鼠，大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后處死，用鋒利手術(shù)刀于冰山快速取下關(guān)節(jié)軟骨，樣本制作過程同“1.6.5”，按照TUNEL試劑盒說明書對切片凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測，激光共聚焦下正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)綠色，5個(gè)高倍視野/切片，凋亡率（%）=綠色細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6.9 關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a mRNA、β-catenin mRNA及MMP-13 mRNA水平變化 取材同“1.6.5”，根據(jù)NCBI中Genebank基因庫對Wnt-1、LRP-5、β-catenin基因引物序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，將其擴(kuò)增片段長度設(shè)為100～300 bp。取約300 mg樣本加入4.5 mL Trizol提取RNA，檢測RNA濃度。根據(jù)Fermatas試劑盒操作說明將所提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用SYBR Green real-time PCR法 和stem-loop real-time PCR進(jìn) 行Wnt-3a mRNA、β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA表達(dá)檢測。將GAPDH設(shè)置為內(nèi)參，將其拷貝數(shù)視為校正基數(shù)，利用ABI 7500軟件計(jì)算出Ct（cycle threshold）值，減去GAPDH的Ct值，獲得該樣本相應(yīng)指標(biāo)的ΔCt值。本研究將空白組大鼠的ΔCt值作為校正，根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算出樣本中不同指標(biāo)的基因表達(dá)數(shù)值。

1.6.10 關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a、β-catenin、MMP-13蛋白水平變化取“1.6.9”樣本100 mg，加入1 mL RIPA蛋白裂解液，充分勻漿置于4℃5 000 r/min條件下離心20 min，取上清液后用BCA法進(jìn)行總蛋白定量。將樣本加入事先配制好的凝膠（5%上層膠/12%下層膠）內(nèi)，經(jīng)電泳（20 V 10 min，50 V 40 min）后將蛋白充分分離后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入Wnt-3a（1∶1 000）、β-catenin（1∶1 000）、MMP-13（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）一抗，4℃，孵育過夜，用TBST漂洗條帶后加入羊抗兔二抗（1∶2 000），室溫下孵育2 h后將高敏ECL反應(yīng)液滴加在條帶上進(jìn)行顯影反應(yīng)，曝光成像，再用ImageJ軟件分析蛋白相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，對各組進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)與方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，重復(fù)測量計(jì)量資料采用重復(fù)測量資料方差分析。P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況空白組大鼠活動(dòng)正常，與空白組比較，模型組大鼠活動(dòng)靈活性下降，活動(dòng)頻次減少，出現(xiàn)不同程度的跛行，右膝著地時(shí)間明顯縮短，頻繁出現(xiàn)舔足等表現(xiàn)；與模型組比較，川芎嗪組、塞來昔布組大鼠活動(dòng)能力改善，活動(dòng)頻次增多，右膝著地時(shí)間延長，舔足時(shí)間縮短，其中川芎嗪組改善優(yōu)于塞來昔布組，而川芎嗪的作用被抑制劑阻斷。

2.2 各組大鼠MWT比較5組大鼠造模前MWT比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）?？瞻捉M和模型組大鼠在不同治療時(shí)間點(diǎn)（造模后1 d、造模后7 d、造模后14 d、造模后28 d）間MWT比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05），不存在時(shí)間效應(yīng)。川芎嗪組、塞來昔布組、抑制劑組大鼠在不同治療時(shí)間點(diǎn)（造模后1 d、造模后7 d、造模后14 d、造模后28 d）MWT逐漸升高，均在造模后28 d達(dá)到高峰，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.05），存在時(shí)間效應(yīng)。5組大鼠MWT總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.05），即存在分組效應(yīng)；模型組大鼠在不同治療時(shí)間（造模后1 d、造模后7 d、造模后14 d、造模后28 d）MWT均低于空白組（P〈0.05）；川芎嗪組、塞來昔布組大鼠在造模后17 d、造模后14 d、造模后28 d MWT均高于模型組（P〈0.05）；抑制劑組大鼠造模后28 d MWT高于模型組（P〈0.05）；川芎嗪組大鼠造模后14 d、造模后28 d MWT高于塞來昔布組和抑制劑組（P〈0.05）；塞來昔布組大鼠造模后28 d MWT高于抑制劑組（P〈0.05）。時(shí)間因素與分組因素間存在交互效應(yīng)（P〈0.05）。（見表2、圖1）

表2 各組大鼠MWT比較（±s）

表2 各組大鼠MWT比較（±s）

注：F時(shí)間主效應(yīng)=3.234，P時(shí)間主效應(yīng)=0.011；F分組主效應(yīng)=4.526，P分組主效應(yīng)=0.021；F交互效應(yīng)=6.443，P交互效應(yīng)=0.018；與空白組比較，aP〈0.05；與模型組比較，bP〈0.05；與抑制組比較，cP〈0.05；與塞來昔布組比較，dP〈0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg） 造模前（g）造模后1 d（g）造模后7 d（g）造模后14 d（g）造模后28 d（g） F P空白組 20 - 11.35±2.51 11.64±2.68 11.28±2.63 12.01±1.67 11.53±2.01 25.383 1.093模型組 20 - 12.38±1.98 1.12±0.34a 2.01±0.48a 2.18±0.37a 2.02±0.79a 41.762 0.002川芎嗪組 20 100 11.32±2.06 1.09±0.54a 3.28±0.76ab 5.92±0.84abcd 7.82±0.88abcd 25.384 0.034塞來昔布組20 24 12.01±2.11 1.12±0.37a 3.19±0.79ab 4.11±0.38ab 6.01±0.64abc 30.328 0.023抑制劑組 20 100 11.98±2.04 1.02±0.47a 2.01±0.24a 3.24±0.48a 4.11±0.39ab 32.243 0.012 F 69.657 98.284 71.457 85.223 104.232 P 2.123 0.028 0.043 0.032 0.011

圖1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)MWT交互效應(yīng)輪廓圖

2.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)影像學(xué)改變情況空白組大鼠膝關(guān)節(jié)面平整光滑，關(guān)節(jié)間隙大小正常，關(guān)節(jié)軟骨未見骨贅、關(guān)節(jié)鼠征象；模型組大鼠膝關(guān)節(jié)面出現(xiàn)明顯硬化改變，關(guān)節(jié)間隙變窄，關(guān)節(jié)軟骨厚度變薄，甚至消失，可見部分骨刺及骨贅生成，部分大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)輕度脫位；川芎嗪組及塞來昔布組大鼠影像學(xué)征象較模型組改善，關(guān)節(jié)面輕度硬化，關(guān)節(jié)間隙未見明顯狹窄，關(guān)節(jié)軟骨變薄不明顯，出現(xiàn)少量骨贅或骨刺，其中川芎嗪組改善較塞來昔布組明顯；抑制劑組大鼠膝關(guān)節(jié)面存在一定程度硬化，部分關(guān)節(jié)腔間隙存在狹窄，關(guān)節(jié)軟骨明顯變薄，可見部分骨贅或骨刺。（見圖2）

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)影像學(xué)改變

2.4 各組大鼠Mankin病理學(xué)評分比較空白組大鼠Mankin病理學(xué)評分為0；與空白組比較，模型組大鼠Mankin評分明顯升高（P〈0.05）；與模型組比較，川芎嗪組、塞來昔布組及抑制劑組大鼠Mankin評分均明顯降低（P〈0.05）；與抑制劑組比較，川芎嗪組、塞來昔布組大鼠Mankin評分均明顯降低（P〈0.05），其中川芎嗪組低于塞來昔布組（P〈0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠Mankin病理學(xué)評分比較（±s）

表3 各組大鼠Mankin病理學(xué)評分比較（±s）

注：與空白組比較，aP〈0.05；與模型組比較，bP〈0.05；與抑制組比較，cP〈0.05；與塞來昔布組比較，dP〈0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 給藥劑量（mg/kg） 評分（分）空白組 6 - 0模型組 6 - 12.27±0.78a川芎嗪組 6 100 3.56±1.16a b c d塞來昔布組6 24 5.28±1.23a b c抑制劑組 6 100 8.69±2.32a b F 29.343 P 0.017

2.5 各組大鼠軟骨組織HE染色結(jié)果空白組大鼠關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)清晰，表面完整無缺損，細(xì)胞排列致密整齊，潮線連續(xù)完整，各層均未見失染；模型組大鼠軟骨表層出現(xiàn)明顯纖維化現(xiàn)象，軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，排列紊亂，可見“細(xì)胞簇聚”征象，潮線中斷或消失，染色不均勻甚至失染；川芎嗪組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞出現(xiàn)部分增殖現(xiàn)象，排列較模型組整齊，極少數(shù)部位出現(xiàn)“細(xì)胞簇聚”征象，部分出現(xiàn)輕微裂隙，潮線不齊，部分出現(xiàn)中斷現(xiàn)象，有出現(xiàn)輕染征象；塞來昔布組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞數(shù)量較川芎嗪組增加，部分存在“細(xì)胞簇聚”征象，潮線不齊，有深染現(xiàn)象；抑制劑組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞排列紊亂，表層不平整，細(xì)胞數(shù)量較空白組大鼠明顯減少，部分可見裂隙，潮線中斷，出現(xiàn)大量失染現(xiàn)象。（見圖3）

圖3 各組大鼠軟骨HE染色圖（×200）

2.6 各組大鼠軟骨組織番紅O染色結(jié)果空白組大鼠軟骨表面膠原纖維層被異染成綠色，大量蛋白多糖被異染成鮮紅色，軟骨與軟骨下界邊界清晰，潮線完整連續(xù)，軟骨下骨皮質(zhì)及骨被染成綠色。模型組大鼠軟骨番紅染色的范圍明顯縮小，被固染成綠色的纖維蛋白原從表層延伸經(jīng)放射層至中間，潮線多處斷裂，軟骨表面結(jié)構(gòu)缺損。塞來昔布組及川芎嗪組大鼠軟骨表層基質(zhì)被紅染，顏色均較模型組鮮紅，膠原纖維亦被固染成綠色，顏色深于模型組，兩組番紅染色均較空白組淺且范圍小，其中川芎嗪組大鼠軟骨潮線較塞來昔布組規(guī)整，軟骨表面缺損程度低于塞來昔布組。抑制劑組大鼠軟骨組織番紅染色范圍小，顏色淡，綠色固然的范圍大，軟骨潮線明顯不規(guī)整，表面破壞明顯，但較模型組稍微改善。（見圖4）

圖4 各組大鼠軟骨番紅O染色圖（×200）

2.7 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡情況綠色熒光細(xì)胞代表凋亡細(xì)胞，藍(lán)色熒光細(xì)胞代表正常細(xì)胞?？瞻捉M大鼠僅有少量的綠色熒光細(xì)胞；與空白組比較，模型組可見大量綠色熒光細(xì)胞表達(dá)；與模型組比較，川芎嗪組、塞來昔布組大鼠綠色熒光細(xì)胞表達(dá)減少，其中川芎嗪組大鼠綠色熒光細(xì)胞表達(dá)少于塞來昔布組。（見圖5）與空白組比較，模型組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡率明顯升高（P〈0.05）；與模型組比較，川芎嗪組、塞來昔布組和抑制劑組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡率均明顯降低（P〈0.05）；與抑制劑組比較，川芎嗪組和塞來昔布組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡率均明顯降低（P〈0.05），其中川芎嗪組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡率低于塞來昔布組（P〈0.05）。（見表4）

圖5 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡比較

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡情況比較（±s）

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡情況比較（±s）

注：與空白組比較，aP〈0.05；與模型組比較，bP〈0.05；與抑制組比較，cP〈0.05；與塞來昔布組比較，dP〈0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg） 凋亡率（%）空白組 6 - 0.09±0.01模型組 6 - 8.17±0.21a川芎嗪組 6 100 2.19±0.18a b c d塞來昔布組 6 24 4.52±0.32a b c抑制劑組 6 100 6.12±0.45a b F 63.733 P 0.021

2.8 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a mRNA、β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA水平變化與空白組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a mRNA、β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA相對表達(dá)量均明顯升高（P〈0.05）；與模型組比較，川芎嗪組、塞來昔布組和抑制劑組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a mRNA、β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA相對表達(dá)量均明顯降低（P〈0.05），其中川芎嗪組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a mRNA、β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA相對表達(dá)量低于塞來昔布組（P〈0.05）；與抑制劑組比較，川芎嗪組和塞來昔布組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a mRNA、β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA相對表達(dá)量均明顯降低（P〈0.05）。（見表5）

表5 各組大鼠軟骨Wnt-3a mRNA、β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA相對表達(dá)量比較（±s）

表5 各組大鼠軟骨Wnt-3a mRNA、β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA相對表達(dá)量比較（±s）

注：與空白組比較，aP〈0.05；與模型組比較，bP〈0.05；與抑制組比較，cP〈0.05；與塞來昔布組比較，dP〈0.05

組別 動(dòng)物數(shù)(只)給藥劑量（mg/kg）Wnt-3a mRNA β-catenin mRNA MMP-13 mRNA空白組 6 - 0.02±0.34 1.01±0.29 1.14±0.32模型組 6 - 8.83±0.16a 9.72±0.18a 11.23±0.08a川芎嗪組 6 100 2.89±0.37abcd 2.29±0.29abcd 3.29±0.42abcd塞來昔布組6 24 4.59±0.28abc 4.42±0.21abc 4.54±0.27abc抑制劑組 6 100 6.12±0.21ab 6.22±0.21ab 6.01±0.16ab F 21.285 19.287 13.223 P 0.012 0.023 0.019

2.9 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a、β-catenin、MMP-13蛋白水平變化與空白組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a、β-catenin、MMP-13蛋白相對表達(dá)量均明顯升高（P〈0.05）；與模型組比較，川芎嗪組、塞來昔布組和抑制劑組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a、β-catenin、MMP-13蛋白相對表達(dá)量均明顯降低（P〈0.05），其中川芎嗪組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a、β-catenin、MMP-13蛋白相對表達(dá)量低于塞來昔布組（P〈0.05）；與抑制劑組比較，川芎嗪組和塞來昔布組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a、β-catenin、MMP-13蛋白相對表達(dá)量均明顯降低（P〈0.05）。（見圖6、表6）

圖6 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a、β-catenin、MMP-13蛋白表達(dá)Western blotting圖

表6 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a、β-catenin、MMP-13蛋白相對表達(dá)量比較（±s）

注：與空白組比較，aP〈0.05；與模型組比較，bP〈0.05；與抑制組比較，cP〈0.05；與塞來昔布組比較，dP〈0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）Wnt-3a/β-actin β-catenin/β-actin MMP-13/β-actin空白組 6 - 2.98±0.13 3.01±0.32 2.77±0.28模型組 6 - 5.17±0.06a 7.44±0.05a 6.26±0.16a川芎嗪組 6 100 1.37±0.12a b c d 1.79±0.21a b c d 1.45±0.17a b c d塞來昔布組6 24 2.97±0.08a b c 3.03±0.13a b c 3.17±0.12a b c抑制劑組 6 100 4.43±0.05a b 5.66±0.11a b 5.08±0.09a b F 24.563 19.234 27.217 P 0.023 0.018 0.025

3 討 論

KOA以膝關(guān)節(jié)軟骨變性壞死及關(guān)節(jié)周圍骨贅形成為病理表現(xiàn)，以關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限、腫脹等為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重者可出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形甚至導(dǎo)致殘疾[8]。KOA好發(fā)于中老年人，隨著老齡化進(jìn)程的日趨嚴(yán)峻，如何防治KOA成為目前研究的熱點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為KOA屬于“骨痹”“膝痹病”“痹證”等范疇，唐代《理傷續(xù)斷方》認(rèn)為瘀血可致痹證，葉天士亦認(rèn)為久病入絡(luò)，對痹證久者應(yīng)以活血化瘀藥治之。瘀是痹證的病理產(chǎn)物，在KOA的不同病理階段，雖涉及肝脾腎等，但瘀血始終存在，只是程度輕重差異而已，故活血化瘀應(yīng)貫穿治療始終[9-11]。本研究采用塞來昔布作為陽性對照藥物對模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，有文獻(xiàn)顯示塞來昔布能有效抑制機(jī)體IL-1及TNF-α的表達(dá)水平，從而減少KOA機(jī)體的炎癥水平，緩解患者的疼痛。塞來昔布是目前公認(rèn)的治療KOA安全有效的藥物之一，因此將塞來昔布作為陽性對照藥物具有可行性。

川芎具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效。川芎嗪是從川芎中提取的酰胺類活性生物堿，2,3,5,6-四甲基吡嗪是川芎嗪的化學(xué)結(jié)構(gòu)。大量臨床研究[12-14]顯示川芎嗪可有效改善KOA患者的臨床癥狀。本研究利用KOA模型大鼠作為觀察對象，發(fā)現(xiàn)川芎嗪可明顯改善KOA模型鼠的行為學(xué)，通過膝關(guān)節(jié)X-ray、HE染色、番紅O染色方法證實(shí)川芎嗪可明顯降低Mankin評分，改善KOA關(guān)節(jié)軟骨組織病理改變，延緩KOA軟骨退變程度。

Wnt信號通路的啟動(dòng)因子是Wnt家族蛋白，Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a和Wnt10a等均是Wnt家族的重要成員，其中Wnt3a已被證實(shí)是激活β-catenin重要上游靶基因，β-catenin是Wnt信號通路的重要因子，β-catenin被激活后可參與調(diào)控KOA的病理過程[15]。有學(xué)者[16]研究發(fā)現(xiàn)，退變的軟骨細(xì)胞中β-catenin呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，Wnt-β-catenin信號通路的激活與軟骨的丟失關(guān)系密切。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路可調(diào)控下游基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，其中MMP-13與KOA發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，是目前公認(rèn)的Ⅱ型膠原降解酶。該因子的過度表達(dá)將引起關(guān)節(jié)軟骨的破壞。李翠葳等[17]研究發(fā)現(xiàn)Wnt/βcatenin信號通路被激活后小鼠膝關(guān)節(jié)呈現(xiàn)出明顯的KOA征像，且軟骨細(xì)胞中的MMP-13亦出現(xiàn)過表達(dá)，而MMP-13在成熟的軟骨細(xì)胞中因Wnt/β-catenin信號通路被激活而進(jìn)一步刺激軟骨細(xì)胞，促使其肥大化、基質(zhì)礦化，誘導(dǎo)膝關(guān)節(jié)產(chǎn)生KOA病理改變。有研究人員在特異性激活Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)MMP-13高表達(dá)，由此引發(fā)骨贅生成/軟骨退變等類KOA表現(xiàn)，因此軟骨的退變/丟失與Wnt/βcatenin信號通路激活后誘發(fā)MMP-13過表達(dá)相關(guān)[18]。本研究利用Western blotting及Real-time PCR法檢測發(fā)現(xiàn)KOA模型大鼠軟骨組織中Wnt3a、β-catenin、MMP-13水平均出現(xiàn)高表達(dá)，而在使用該通路抑制劑后大鼠的KOA病理改善，軟骨細(xì)胞的凋亡情況明顯緩解，這說明Wnt/β-catenin信號通路通過橋接MMP-13參與了KOA的發(fā)生發(fā)展。在進(jìn)一步研究中我們發(fā)現(xiàn)使用川芎嗪后大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt3a、β-catenin、MMP-13表達(dá)降低，一定程度上可減輕關(guān)節(jié)軟骨退變、修復(fù)軟骨損傷。

綜上所述，川芎嗪可延緩膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變，其作用機(jī)制可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，抑制軟骨細(xì)胞凋亡。