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        基于Wnt/β-catenin信號通路探討川芎嗪延緩膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的機(jī)制*

        2022-11-08 04:14:36郭子龍楊曉宏
        中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2022年2期
        關(guān)鍵詞:塞來川芎嗪造模

        肖 強(qiáng),郭子龍,楊曉宏

        (1.張家口市第一醫(yī)院,河北 張家口 075000;2.張家口市萬全區(qū)中醫(yī)院,河北 張家口 076250)

        膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是以膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)不同程度腫脹、疼痛、活動(dòng)受限等為臨床表現(xiàn)的一種退行性病變[1],改善臨床癥狀、延緩軟骨退變是治療KOA的原則。研究顯示W(wǎng)nt/β-catenin通路在KOA的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用,該通路可調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解及骨贅形成的動(dòng)態(tài)平衡,一旦該通路被過度激活則上述穩(wěn)態(tài)被破壞,軟骨細(xì)胞病理性凋亡被放大,細(xì)胞外基質(zhì)降解進(jìn)程加速,導(dǎo)致軟骨細(xì)胞退化,最終加速KOA的惡化[2-3]。因此,抑制Wnt/βcatenin通路,可最終實(shí)現(xiàn)延緩膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的目的。

        近年來,中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)病的優(yōu)勢逐漸凸顯,川芎嗪(2,3,5,6-四甲基吡嗪,Ligustrazine)是從活血化瘀類中藥川芎中提取出來的一種有效活性生物堿,能有效治療KOA[4-5],但其作用機(jī)制尚處于探索階段。本研究以KOA模型大鼠為觀察對象,利用不同的分子生物學(xué)手段進(jìn)行研究,以期進(jìn)一步探討川芎嗪延緩膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的可能機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級雄性SD大鼠100只,體質(zhì)量(230±20)g,鼠齡(55±2)d,由徐州醫(yī)科大學(xué)提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2015-0009。于徐州醫(yī)科大學(xué)SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d,飼養(yǎng)環(huán)境:溫度(23±1)℃,相對濕度(70±5)%,晝夜12 h/12 h交替。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程動(dòng)物均可自由飲食及飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理制度和使用委員會(huì)批準(zhǔn)而進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的操作和處理均嚴(yán)格按照《徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理指南》進(jìn)行,倫理批件號:2930233-A1。

        1.2 藥物與試劑磷酸川芎嗪片(北京市燕京藥業(yè)有限公司,批號:522453,國藥準(zhǔn)字H11021964,規(guī)格:50 mg/片);塞來昔布膠囊(輝瑞制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字J20140072,規(guī)格:200 mg/粒);蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司;貨號:C0105);實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒(武漢純度生物技術(shù)有限公司,貨號:CD-13503-ML);Trizol試劑(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司,貨號:283912);BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司,貨號:23227);番紅-固綠染色試劑盒(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司,貨號:293342);Wnt-3a一抗(貨號:ab15251)、MMP-13一抗(貨號:ab36121)、β-catenin一抗(貨號:ab16051)均購自美國Abcam公司;β-actin一抗(美國CST公司,貨號:4970s);辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(石四藥翰林生物技術(shù)有限公司,貨號:HSGR-HRP-500);超敏ECL發(fā)光液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司,貨號:P1030-100);抑制劑Dickkopf-1(美國StemRD公司,貨號:DKK-100)。

        1.3 主要儀器Optima MAX-XP型高速離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特有限公司);BioTek-26262059型多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek伯騰有限公司);HT-1000TBT型蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限公司);ZD-9560型脫色搖床(江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司)。

        1.4 造模與分組將100只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、川芎嗪組、塞來昔布組及抑制劑組,每組20只。除空白組外,其余各組大鼠用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉,待大鼠充分麻醉后參考文獻(xiàn)[6]中改良Hulth法進(jìn)行模型制備,方法具體如下:取左側(cè)膝關(guān)節(jié)為術(shù)側(cè),從左膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路,將膝關(guān)節(jié)充分暴露于術(shù)野,切斷內(nèi)側(cè)副韌帶后將內(nèi)側(cè)半月板摘除,隨后將前交叉韌帶切除,再用可吸收外科縫合線將創(chuàng)口縫合,術(shù)后青霉素腹腔注射預(yù)防感染,20萬U/d,連續(xù)注射3 d。造模次日進(jìn)行干預(yù)。抑制劑組大鼠造模術(shù)前腹腔注射Wnt/β-catenin信號通路抑制劑Dickkopf-1。

        1.5 實(shí)驗(yàn)給藥川芎嗪組及抑制劑組大鼠給予磷酸川芎嗪溶液灌胃,將臨床上人服用的常規(guī)劑量按照大鼠與人體間等效劑量換算,再根據(jù)文獻(xiàn)[7]將干預(yù)劑量設(shè)置為100 mg/kg,1次/d;塞來昔布組大鼠給予塞來昔布溶液灌胃,劑量換算同川芎嗪組,參考文獻(xiàn)[7]將其劑量定為24 mg/kg,1次/d;空白組、模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃;連續(xù)給藥28 d。

        1.6 觀察指標(biāo)

        1.6.1 一般情況 觀察各組大鼠皮毛光亮程度、飲食情況、有無跛行、活動(dòng)頻次、后肢著地時(shí)間等。

        1.6.2 關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)評分 采用改良Mankin關(guān)節(jié)軟骨病理評分標(biāo)準(zhǔn)對各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨的病理學(xué)改變進(jìn)行評分,具體分級如下,正常:0~1分;輕度改變:2~5分;中度改變:6~9分;重度改變:10~14分。具體見表1。

        表1 改良Mankin關(guān)節(jié)軟骨病理評分標(biāo)準(zhǔn)

        1.6.3 機(jī)械痛閾檢測 造模前,以及造模后1、7、14、28 d對各組大鼠進(jìn)行機(jī)械刺激縮爪閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT)檢測。實(shí)驗(yàn)前3 d對所有大鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練,將大鼠置于長寬高均為30 cm的透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)觀察,1次/d,30 min/次。MWT:將觀察箱置于金屬架上,架子置一帶有小孔的鐵絲網(wǎng),大鼠置于觀察箱內(nèi),待其完全適應(yīng)后測試者將Von Frey纖維絲穿過鐵絲網(wǎng)格刺激大鼠后肢足底正中足掌部,使Von Frey纖維絲稍彎成“S”形,持續(xù)6 s。大鼠出現(xiàn)肢體收縮、舔足、抬足等動(dòng)作,為陽性反應(yīng)(+),大鼠出現(xiàn)陽性反應(yīng)(+)后更換刻度較小的Von Frey纖維絲進(jìn)行再刺激,如果為陰性表現(xiàn)則更換刻度更大的Von Frey纖維絲進(jìn)行刺激,中間間隔不少于10 s。記錄連續(xù)刺激5次時(shí)纖維絲的力度值。

        1.6.4 膝關(guān)節(jié)影像學(xué)變化 采用X-ray對各組大鼠左側(cè)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行掃描,各組隨機(jī)選取6只大鼠,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后固定于小動(dòng)物成像儀中掃描成像,操作過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,觀察各組大鼠膝關(guān)節(jié)影像學(xué)改變。

        1.6.5 動(dòng)物取材 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后處死,用鋒利手術(shù)刀于冰上快速取下股骨下1/3部分,將樣本快速置于10%中性甲醛的固定液中,室溫下靜置48 h,固定后取出樣本置于10%EDTA脫鈣劑中充分脫鈣8周,脫鈣過程中每2 d更換1次脫鈣液,待組織完全脫鈣后摒棄脫鈣液,用流動(dòng)水漂洗樣本120 min,隨后用鋒利手術(shù)刀將關(guān)節(jié)軟骨切下后修切成2 mm×3 mm×4 mm塊狀,隨后用梯度酒精進(jìn)行脫水,二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋,置于-20℃冰箱備用。

        1.6.6 軟骨組織HE染色 每組隨機(jī)選取6只大鼠,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后處死,用鋒利手術(shù)刀于冰上快速取下股骨下1/3部分,樣本制作過程同“1.6.5”,切片程序性脫蠟后放入蘇木精溶液中染色3 min,分別放入酸水及氨水中數(shù)秒以分色,流水沖洗1 h時(shí);先后放入70%、90%乙醇溶液,每種溶液10 min進(jìn)行脫水;放入酒精伊紅溶液染色3 min;采用光學(xué)顯微鏡(×400)觀察每張關(guān)節(jié)軟骨切片的形態(tài)學(xué)特征。

        1.6.7 軟骨組織番紅O染色 取“1.6.6”樣本程序性脫蠟后蒸餾水沖洗后入Safranin O stain內(nèi)浸染,蒸餾水沖洗;用Safranin分化液洗滌切片,蒸餾水沖洗;分別用95%乙醇、無水乙醇脫水;二甲苯透明,用中性樹膠封片、光鏡下顯色拍照記錄。

        1.6.8 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡情況 每組隨機(jī)選取6只大鼠,大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后處死,用鋒利手術(shù)刀于冰山快速取下關(guān)節(jié)軟骨,樣本制作過程同“1.6.5”,按照TUNEL試劑盒說明書對切片凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測,激光共聚焦下正常細(xì)胞核呈藍(lán)色,凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)綠色,5個(gè)高倍視野/切片,凋亡率(%)=綠色細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

        1.6.9 關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a mRNA、β-catenin mRNA及MMP-13 mRNA水平變化 取材同“1.6.5”,根據(jù)NCBI中Genebank基因庫對Wnt-1、LRP-5、β-catenin基因引物序列進(jìn)行設(shè)計(jì),將其擴(kuò)增片段長度設(shè)為100~300 bp。取約300 mg樣本加入4.5 mL Trizol提取RNA,檢測RNA濃度。根據(jù)Fermatas試劑盒操作說明將所提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,應(yīng)用SYBR Green real-time PCR法 和stem-loop real-time PCR進(jìn) 行Wnt-3a mRNA、β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA表達(dá)檢測。將GAPDH設(shè)置為內(nèi)參,將其拷貝數(shù)視為校正基數(shù),利用ABI 7500軟件計(jì)算出Ct(cycle threshold)值,減去GAPDH的Ct值,獲得該樣本相應(yīng)指標(biāo)的ΔCt值。本研究將空白組大鼠的ΔCt值作為校正,根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算出樣本中不同指標(biāo)的基因表達(dá)數(shù)值。

        1.6.10 關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a、β-catenin、MMP-13蛋白水平變化取“1.6.9”樣本100 mg,加入1 mL RIPA蛋白裂解液,充分勻漿置于4℃5 000 r/min條件下離心20 min,取上清液后用BCA法進(jìn)行總蛋白定量。將樣本加入事先配制好的凝膠(5%上層膠/12%下層膠)內(nèi),經(jīng)電泳(20 V 10 min,50 V 40 min)后將蛋白充分分離后轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,加入Wnt-3a(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)、MMP-13(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)一抗,4℃,孵育過夜,用TBST漂洗條帶后加入羊抗兔二抗(1∶2 000),室溫下孵育2 h后將高敏ECL反應(yīng)液滴加在條帶上進(jìn)行顯影反應(yīng),曝光成像,再用ImageJ軟件分析蛋白相對表達(dá)量。

        1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”(±s)表示,對各組進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)與方差齊性檢驗(yàn),采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),重復(fù)測量計(jì)量資料采用重復(fù)測量資料方差分析。P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 大鼠一般情況空白組大鼠活動(dòng)正常,與空白組比較,模型組大鼠活動(dòng)靈活性下降,活動(dòng)頻次減少,出現(xiàn)不同程度的跛行,右膝著地時(shí)間明顯縮短,頻繁出現(xiàn)舔足等表現(xiàn);與模型組比較,川芎嗪組、塞來昔布組大鼠活動(dòng)能力改善,活動(dòng)頻次增多,右膝著地時(shí)間延長,舔足時(shí)間縮短,其中川芎嗪組改善優(yōu)于塞來昔布組,而川芎嗪的作用被抑制劑阻斷。

        2.2 各組大鼠MWT比較5組大鼠造模前MWT比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〉0.05)??瞻捉M和模型組大鼠在不同治療時(shí)間點(diǎn)(造模后1 d、造模后7 d、造模后14 d、造模后28 d)間MWT比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〉0.05),不存在時(shí)間效應(yīng)。川芎嗪組、塞來昔布組、抑制劑組大鼠在不同治療時(shí)間點(diǎn)(造模后1 d、造模后7 d、造模后14 d、造模后28 d)MWT逐漸升高,均在造模后28 d達(dá)到高峰,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05),存在時(shí)間效應(yīng)。5組大鼠MWT總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05),即存在分組效應(yīng);模型組大鼠在不同治療時(shí)間(造模后1 d、造模后7 d、造模后14 d、造模后28 d)MWT均低于空白組(P〈0.05);川芎嗪組、塞來昔布組大鼠在造模后17 d、造模后14 d、造模后28 d MWT均高于模型組(P〈0.05);抑制劑組大鼠造模后28 d MWT高于模型組(P〈0.05);川芎嗪組大鼠造模后14 d、造模后28 d MWT高于塞來昔布組和抑制劑組(P〈0.05);塞來昔布組大鼠造模后28 d MWT高于抑制劑組(P〈0.05)。時(shí)間因素與分組因素間存在交互效應(yīng)(P〈0.05)。(見表2、圖1)

        表2 各組大鼠MWT比較(±s)

        表2 各組大鼠MWT比較(±s)

        注:F時(shí)間主效應(yīng)=3.234,P時(shí)間主效應(yīng)=0.011;F分組主效應(yīng)=4.526,P分組主效應(yīng)=0.021;F交互效應(yīng)=6.443,P交互效應(yīng)=0.018;與空白組比較,aP〈0.05;與模型組比較,bP〈0.05;與抑制組比較,cP〈0.05;與塞來昔布組比較,dP〈0.05

        組別 動(dòng)物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg) 造模前(g)造模后1 d(g)造模后7 d(g)造模后14 d(g)造模后28 d(g) F P空白組 20 - 11.35±2.51 11.64±2.68 11.28±2.63 12.01±1.67 11.53±2.01 25.383 1.093模型組 20 - 12.38±1.98 1.12±0.34a 2.01±0.48a 2.18±0.37a 2.02±0.79a 41.762 0.002川芎嗪組 20 100 11.32±2.06 1.09±0.54a 3.28±0.76ab 5.92±0.84abcd 7.82±0.88abcd 25.384 0.034塞來昔布組20 24 12.01±2.11 1.12±0.37a 3.19±0.79ab 4.11±0.38ab 6.01±0.64abc 30.328 0.023抑制劑組 20 100 11.98±2.04 1.02±0.47a 2.01±0.24a 3.24±0.48a 4.11±0.39ab 32.243 0.012 F 69.657 98.284 71.457 85.223 104.232 P 2.123 0.028 0.043 0.032 0.011

        圖1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)MWT交互效應(yīng)輪廓圖

        2.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)影像學(xué)改變情況空白組大鼠膝關(guān)節(jié)面平整光滑,關(guān)節(jié)間隙大小正常,關(guān)節(jié)軟骨未見骨贅、關(guān)節(jié)鼠征象;模型組大鼠膝關(guān)節(jié)面出現(xiàn)明顯硬化改變,關(guān)節(jié)間隙變窄,關(guān)節(jié)軟骨厚度變薄,甚至消失,可見部分骨刺及骨贅生成,部分大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)輕度脫位;川芎嗪組及塞來昔布組大鼠影像學(xué)征象較模型組改善,關(guān)節(jié)面輕度硬化,關(guān)節(jié)間隙未見明顯狹窄,關(guān)節(jié)軟骨變薄不明顯,出現(xiàn)少量骨贅或骨刺,其中川芎嗪組改善較塞來昔布組明顯;抑制劑組大鼠膝關(guān)節(jié)面存在一定程度硬化,部分關(guān)節(jié)腔間隙存在狹窄,關(guān)節(jié)軟骨明顯變薄,可見部分骨贅或骨刺。(見圖2)

        圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)影像學(xué)改變

        2.4 各組大鼠Mankin病理學(xué)評分比較空白組大鼠Mankin病理學(xué)評分為0;與空白組比較,模型組大鼠Mankin評分明顯升高(P〈0.05);與模型組比較,川芎嗪組、塞來昔布組及抑制劑組大鼠Mankin評分均明顯降低(P〈0.05);與抑制劑組比較,川芎嗪組、塞來昔布組大鼠Mankin評分均明顯降低(P〈0.05),其中川芎嗪組低于塞來昔布組(P〈0.05)。(見表3)

        表3 各組大鼠Mankin病理學(xué)評分比較(±s)

        表3 各組大鼠Mankin病理學(xué)評分比較(±s)

        注:與空白組比較,aP〈0.05;與模型組比較,bP〈0.05;與抑制組比較,cP〈0.05;與塞來昔布組比較,dP〈0.05

        組別 動(dòng)物數(shù)(只) 給藥劑量(mg/kg) 評分(分)空白組 6 - 0模型組 6 - 12.27±0.78a川芎嗪組 6 100 3.56±1.16a b c d塞來昔布組6 24 5.28±1.23a b c抑制劑組 6 100 8.69±2.32a b F 29.343 P 0.017

        2.5 各組大鼠軟骨組織HE染色結(jié)果空白組大鼠關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)清晰,表面完整無缺損,細(xì)胞排列致密整齊,潮線連續(xù)完整,各層均未見失染;模型組大鼠軟骨表層出現(xiàn)明顯纖維化現(xiàn)象,軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少,排列紊亂,可見“細(xì)胞簇聚”征象,潮線中斷或消失,染色不均勻甚至失染;川芎嗪組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞出現(xiàn)部分增殖現(xiàn)象,排列較模型組整齊,極少數(shù)部位出現(xiàn)“細(xì)胞簇聚”征象,部分出現(xiàn)輕微裂隙,潮線不齊,部分出現(xiàn)中斷現(xiàn)象,有出現(xiàn)輕染征象;塞來昔布組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞數(shù)量較川芎嗪組增加,部分存在“細(xì)胞簇聚”征象,潮線不齊,有深染現(xiàn)象;抑制劑組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞排列紊亂,表層不平整,細(xì)胞數(shù)量較空白組大鼠明顯減少,部分可見裂隙,潮線中斷,出現(xiàn)大量失染現(xiàn)象。(見圖3)

        圖3 各組大鼠軟骨HE染色圖(×200)

        2.6 各組大鼠軟骨組織番紅O染色結(jié)果空白組大鼠軟骨表面膠原纖維層被異染成綠色,大量蛋白多糖被異染成鮮紅色,軟骨與軟骨下界邊界清晰,潮線完整連續(xù),軟骨下骨皮質(zhì)及骨被染成綠色。模型組大鼠軟骨番紅染色的范圍明顯縮小,被固染成綠色的纖維蛋白原從表層延伸經(jīng)放射層至中間,潮線多處斷裂,軟骨表面結(jié)構(gòu)缺損。塞來昔布組及川芎嗪組大鼠軟骨表層基質(zhì)被紅染,顏色均較模型組鮮紅,膠原纖維亦被固染成綠色,顏色深于模型組,兩組番紅染色均較空白組淺且范圍小,其中川芎嗪組大鼠軟骨潮線較塞來昔布組規(guī)整,軟骨表面缺損程度低于塞來昔布組。抑制劑組大鼠軟骨組織番紅染色范圍小,顏色淡,綠色固然的范圍大,軟骨潮線明顯不規(guī)整,表面破壞明顯,但較模型組稍微改善。(見圖4)

        圖4 各組大鼠軟骨番紅O染色圖(×200)

        2.7 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡情況綠色熒光細(xì)胞代表凋亡細(xì)胞,藍(lán)色熒光細(xì)胞代表正常細(xì)胞??瞻捉M大鼠僅有少量的綠色熒光細(xì)胞;與空白組比較,模型組可見大量綠色熒光細(xì)胞表達(dá);與模型組比較,川芎嗪組、塞來昔布組大鼠綠色熒光細(xì)胞表達(dá)減少,其中川芎嗪組大鼠綠色熒光細(xì)胞表達(dá)少于塞來昔布組。(見圖5)與空白組比較,模型組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡率明顯升高(P〈0.05);與模型組比較,川芎嗪組、塞來昔布組和抑制劑組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡率均明顯降低(P〈0.05);與抑制劑組比較,川芎嗪組和塞來昔布組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡率均明顯降低(P〈0.05),其中川芎嗪組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡率低于塞來昔布組(P〈0.05)。(見表4)

        圖5 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡比較

        表4 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡情況比較(±s)

        表4 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡情況比較(±s)

        注:與空白組比較,aP〈0.05;與模型組比較,bP〈0.05;與抑制組比較,cP〈0.05;與塞來昔布組比較,dP〈0.05

        組別 動(dòng)物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg) 凋亡率(%)空白組 6 - 0.09±0.01模型組 6 - 8.17±0.21a川芎嗪組 6 100 2.19±0.18a b c d塞來昔布組 6 24 4.52±0.32a b c抑制劑組 6 100 6.12±0.45a b F 63.733 P 0.021

        2.8 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a mRNA、β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA水平變化與空白組比較,模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a mRNA、β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA相對表達(dá)量均明顯升高(P〈0.05);與模型組比較,川芎嗪組、塞來昔布組和抑制劑組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a mRNA、β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA相對表達(dá)量均明顯降低(P〈0.05),其中川芎嗪組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a mRNA、β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA相對表達(dá)量低于塞來昔布組(P〈0.05);與抑制劑組比較,川芎嗪組和塞來昔布組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a mRNA、β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA相對表達(dá)量均明顯降低(P〈0.05)。(見表5)

        表5 各組大鼠軟骨Wnt-3a mRNA、β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA相對表達(dá)量比較(±s)

        表5 各組大鼠軟骨Wnt-3a mRNA、β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA相對表達(dá)量比較(±s)

        注:與空白組比較,aP〈0.05;與模型組比較,bP〈0.05;與抑制組比較,cP〈0.05;與塞來昔布組比較,dP〈0.05

        組別 動(dòng)物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)Wnt-3a mRNA β-catenin mRNA MMP-13 mRNA空白組 6 - 0.02±0.34 1.01±0.29 1.14±0.32模型組 6 - 8.83±0.16a 9.72±0.18a 11.23±0.08a川芎嗪組 6 100 2.89±0.37abcd 2.29±0.29abcd 3.29±0.42abcd塞來昔布組6 24 4.59±0.28abc 4.42±0.21abc 4.54±0.27abc抑制劑組 6 100 6.12±0.21ab 6.22±0.21ab 6.01±0.16ab F 21.285 19.287 13.223 P 0.012 0.023 0.019

        2.9 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a、β-catenin、MMP-13蛋白水平變化與空白組比較,模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a、β-catenin、MMP-13蛋白相對表達(dá)量均明顯升高(P〈0.05);與模型組比較,川芎嗪組、塞來昔布組和抑制劑組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a、β-catenin、MMP-13蛋白相對表達(dá)量均明顯降低(P〈0.05),其中川芎嗪組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a、β-catenin、MMP-13蛋白相對表達(dá)量低于塞來昔布組(P〈0.05);與抑制劑組比較,川芎嗪組和塞來昔布組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a、β-catenin、MMP-13蛋白相對表達(dá)量均明顯降低(P〈0.05)。(見圖6、表6)

        圖6 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a、β-catenin、MMP-13蛋白表達(dá)Western blotting圖

        表6 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt-3a、β-catenin、MMP-13蛋白相對表達(dá)量比較(±s)

        注:與空白組比較,aP〈0.05;與模型組比較,bP〈0.05;與抑制組比較,cP〈0.05;與塞來昔布組比較,dP〈0.05

        組別 動(dòng)物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)Wnt-3a/β-actin β-catenin/β-actin MMP-13/β-actin空白組 6 - 2.98±0.13 3.01±0.32 2.77±0.28模型組 6 - 5.17±0.06a 7.44±0.05a 6.26±0.16a川芎嗪組 6 100 1.37±0.12a b c d 1.79±0.21a b c d 1.45±0.17a b c d塞來昔布組6 24 2.97±0.08a b c 3.03±0.13a b c 3.17±0.12a b c抑制劑組 6 100 4.43±0.05a b 5.66±0.11a b 5.08±0.09a b F 24.563 19.234 27.217 P 0.023 0.018 0.025

        3 討 論

        KOA以膝關(guān)節(jié)軟骨變性壞死及關(guān)節(jié)周圍骨贅形成為病理表現(xiàn),以關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限、腫脹等為主要臨床表現(xiàn),嚴(yán)重者可出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形甚至導(dǎo)致殘疾[8]。KOA好發(fā)于中老年人,隨著老齡化進(jìn)程的日趨嚴(yán)峻,如何防治KOA成為目前研究的熱點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為KOA屬于“骨痹”“膝痹病”“痹證”等范疇,唐代《理傷續(xù)斷方》認(rèn)為瘀血可致痹證,葉天士亦認(rèn)為久病入絡(luò),對痹證久者應(yīng)以活血化瘀藥治之。瘀是痹證的病理產(chǎn)物,在KOA的不同病理階段,雖涉及肝脾腎等,但瘀血始終存在,只是程度輕重差異而已,故活血化瘀應(yīng)貫穿治療始終[9-11]。本研究采用塞來昔布作為陽性對照藥物對模型大鼠進(jìn)行干預(yù),有文獻(xiàn)顯示塞來昔布能有效抑制機(jī)體IL-1及TNF-α的表達(dá)水平,從而減少KOA機(jī)體的炎癥水平,緩解患者的疼痛。塞來昔布是目前公認(rèn)的治療KOA安全有效的藥物之一,因此將塞來昔布作為陽性對照藥物具有可行性。

        川芎具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效。川芎嗪是從川芎中提取的酰胺類活性生物堿,2,3,5,6-四甲基吡嗪是川芎嗪的化學(xué)結(jié)構(gòu)。大量臨床研究[12-14]顯示川芎嗪可有效改善KOA患者的臨床癥狀。本研究利用KOA模型大鼠作為觀察對象,發(fā)現(xiàn)川芎嗪可明顯改善KOA模型鼠的行為學(xué),通過膝關(guān)節(jié)X-ray、HE染色、番紅O染色方法證實(shí)川芎嗪可明顯降低Mankin評分,改善KOA關(guān)節(jié)軟骨組織病理改變,延緩KOA軟骨退變程度。

        Wnt信號通路的啟動(dòng)因子是Wnt家族蛋白,Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a和Wnt10a等均是Wnt家族的重要成員,其中Wnt3a已被證實(shí)是激活β-catenin重要上游靶基因,β-catenin是Wnt信號通路的重要因子,β-catenin被激活后可參與調(diào)控KOA的病理過程[15]。有學(xué)者[16]研究發(fā)現(xiàn),退變的軟骨細(xì)胞中β-catenin呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),Wnt-β-catenin信號通路的激活與軟骨的丟失關(guān)系密切。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路可調(diào)控下游基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達(dá),其中MMP-13與KOA發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,是目前公認(rèn)的Ⅱ型膠原降解酶。該因子的過度表達(dá)將引起關(guān)節(jié)軟骨的破壞。李翠葳等[17]研究發(fā)現(xiàn)Wnt/βcatenin信號通路被激活后小鼠膝關(guān)節(jié)呈現(xiàn)出明顯的KOA征像,且軟骨細(xì)胞中的MMP-13亦出現(xiàn)過表達(dá),而MMP-13在成熟的軟骨細(xì)胞中因Wnt/β-catenin信號通路被激活而進(jìn)一步刺激軟骨細(xì)胞,促使其肥大化、基質(zhì)礦化,誘導(dǎo)膝關(guān)節(jié)產(chǎn)生KOA病理改變。有研究人員在特異性激活Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)MMP-13高表達(dá),由此引發(fā)骨贅生成/軟骨退變等類KOA表現(xiàn),因此軟骨的退變/丟失與Wnt/βcatenin信號通路激活后誘發(fā)MMP-13過表達(dá)相關(guān)[18]。本研究利用Western blotting及Real-time PCR法檢測發(fā)現(xiàn)KOA模型大鼠軟骨組織中Wnt3a、β-catenin、MMP-13水平均出現(xiàn)高表達(dá),而在使用該通路抑制劑后大鼠的KOA病理改善,軟骨細(xì)胞的凋亡情況明顯緩解,這說明Wnt/β-catenin信號通路通過橋接MMP-13參與了KOA的發(fā)生發(fā)展。在進(jìn)一步研究中我們發(fā)現(xiàn)使用川芎嗪后大鼠關(guān)節(jié)軟骨Wnt3a、β-catenin、MMP-13表達(dá)降低,一定程度上可減輕關(guān)節(jié)軟骨退變、修復(fù)軟骨損傷。

        綜上所述,川芎嗪可延緩膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變,其作用機(jī)制可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路,抑制軟骨細(xì)胞凋亡。

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