王琮民,閆紀(jì)琳,李海濤,牛麗輝,王敏,苗玲
(1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院,河北 邯鄲 056000;2.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院,河北 邯鄲 056000;3.邯鄲市中心醫(yī)院,河北 邯鄲 056000)
急性腦梗死屬于神經(jīng)內(nèi)科常見(jiàn)疾病,臨床癥狀主要為偏癱,是一類致死率、致殘率、復(fù)發(fā)率極高的心腦血管疾病[1]。該病發(fā)病原因主要為腦部供血不足,造成腦組織缺血、缺氧性壞死,最終導(dǎo)致神經(jīng)功能受損[2]。目前治療腦梗死的方法主要是服用藥物,如他汀類、阿司匹林等,但是治療效果不佳[3]。而隨著我國(guó)老齡人口不斷增加,中老年人對(duì)生活的質(zhì)量有了更高的要求,對(duì)心腦血管疾病治療也更為重視,因此迫切需要簡(jiǎn)單、有效的方法治療急性腦梗死。針灸作為傳統(tǒng)康復(fù)治療手段,操作簡(jiǎn)單,在治療急性腦梗死中已經(jīng)得到了認(rèn)可,但大部分文獻(xiàn)報(bào)道僅僅局限于觀察臨床療效方面,對(duì)具體的作用機(jī)制鮮有報(bào)道[4]。而腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)/酪氨酸激酶(Tyrosine kinase,TrkB)/磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)信號(hào)通路作為一種常見(jiàn)的信號(hào)通路,在治療腦梗死方面受到很多學(xué)者的關(guān)注。因此,本研究通過(guò)改良線栓法建立腦梗死大鼠模型,從BDNF/TrkB/PI3K信號(hào)通路方面探索電針對(duì)腦梗死大鼠的治療效果,以期為電針治療腦梗死提供理論依據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6~7周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠85只,體質(zhì)量210~230 g,購(gòu)自北京腦科學(xué)與類腦研究中心,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2021-0005。所有大鼠均飼養(yǎng)于溫度22 ℃、濕度55%的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中,自由進(jìn)食進(jìn)水。使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遵循國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》,并經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。
1.2 藥物與試劑 白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)ELISA試劑盒(批號(hào):ml037351)、腫瘤壞死因子-ɑ(tumour necrosis factor-ɑ,TNF-ɑ)ELISA試劑盒(批號(hào):ml002859)、白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)ELISA試劑盒(批號(hào):ml064292)均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色液(批號(hào):DK0005)購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司;兔抗BDNF抗體(批號(hào):ab108319)、兔抗TrkB抗體(批號(hào):ab187041)、p-PI3K抗體(批號(hào):ab278545)、PI3K抗體(批號(hào):ab32089)、蛋白激酶B抗體(protein kinase B,AKT)(批號(hào):ab81283)、p-AKT抗體(批號(hào):ab8805)均購(gòu)自abcam公司;BDNF/TrkB通路抑制劑-K252a(批號(hào):HY-N6732)購(gòu)自美國(guó)MCE公司。
1.3 主要儀器 ZFM-800光學(xué)顯微鏡(上海正晞儀器設(shè)備有限公司);Bio-Rad iMark酶標(biāo)儀(上海京工實(shí)業(yè)有限公司);XS-998B06低頻脈沖電針治療儀(上海聚慕醫(yī)療器械有限公司)。
1.4 造模與分組 參照張芳等[5]建立急性腦梗死大鼠模型的方法造模,操作過(guò)程如下:隨機(jī)選取70只實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前1天禁水、禁食,經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉大鼠,仰臥位固定于操作臺(tái)上,對(duì)頸部皮膚消毒,切開(kāi)大鼠頸部,分離皮下組織,依次分離頸部總動(dòng)脈,頸內(nèi)、外動(dòng)脈,近心端結(jié)扎頸外動(dòng)脈,尼龍線(3 mm)結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈,阻斷血流,于頸內(nèi)動(dòng)脈根部位固定線栓,觀察無(wú)出血現(xiàn)象即可縫合傷口并進(jìn)行傷口清潔消毒。大鼠蘇醒后,觀察大鼠狀況,如出現(xiàn)右眼瞼下垂,瞳孔變小等霍納綜合征;運(yùn)動(dòng)時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;提尾時(shí)左側(cè)前肢內(nèi)收屈曲等癥狀,說(shuō)明大鼠模型構(gòu)建成功[6]。共有60只大鼠符合上述造模標(biāo)準(zhǔn),4只大鼠死亡,6只大鼠造模失敗,造模成功率為86%。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組,每組15只。剩余15只大鼠作為假手術(shù)組,除不結(jié)扎外,其余操作與造模大鼠相同。
1.5 干預(yù)方法 抑制劑組、電針+抑制劑組大鼠經(jīng)右側(cè)腦室注射K252a,10 μg/kg[7];假手術(shù)組、模型組、電針組大鼠注射等體積的生理鹽水,1次/d,連續(xù)干預(yù)7 d。電針組、電針+抑制劑組對(duì)大鼠百會(huì)、風(fēng)府、心俞、內(nèi)關(guān)進(jìn)行電針干預(yù),電針干預(yù)方法參照大鼠解剖結(jié)構(gòu)及《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]確認(rèn)大鼠百會(huì)、風(fēng)府、心俞、內(nèi)關(guān)的定位。百會(huì)與風(fēng)府為一組,患側(cè)內(nèi)關(guān)與心俞為一組,其中百會(huì)、內(nèi)關(guān)接負(fù)極,風(fēng)府、心俞接正極;將各組大鼠均置于操作臺(tái)上并用皮筋固定在鼠板上,其中電針組、電針+抑制劑組大鼠進(jìn)行電針干預(yù),電針治療儀連接0.3 mm×25 mm毫針,直刺4~6 mm,參數(shù)選擇:頻率為10 Hz的疏密波,留針時(shí)間為30 min。1次/d,連續(xù)治療7 d。
1.6 觀察指標(biāo)
1.6.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)估 參照Longa[9]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),對(duì)治療后的大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)估:無(wú)神經(jīng)功能損傷癥狀計(jì)0分;不能完全伸展左側(cè)前爪或后爪計(jì)1分;行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈計(jì)2分;行走時(shí)向左側(cè)傾倒計(jì)3分;無(wú)法自發(fā)行走,喪失意識(shí)計(jì)4分。
1.6.2 樣本采集及處理 神經(jīng)功能缺損評(píng)估完成后,每組隨機(jī)選取10只大鼠,采用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉大鼠,眼球取血,離心取上清液,用于ELISA檢測(cè)血清中炎癥因子水平;處死大鼠,取出腦組織,置于-80 ℃冰箱中保存,用于后續(xù)Western blotting檢測(cè);將剩下各組5只大鼠處死,取出腦組織置于-20 ℃冰箱中保存,用于TTC染色。
1.6.3 大鼠腦梗死面積 取上述“1.6.2”中置于-20 ℃冰箱中的腦組織,從額極開(kāi)始,每間隔2 mm進(jìn)行一次冠狀面切片,之后放入培養(yǎng)皿中培養(yǎng),避光條件下進(jìn)行TTC染色,37 ℃孵育25 min,10%多聚甲醛溶液中固定,拍照并用圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)大鼠腦梗死面積,腦梗死面積比=(缺血部分面積/切片面積)×100%。
1.6.4 血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2水平 取上述“1.6.2”中血清樣本,檢測(cè)大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2水平,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
1.6.5 大鼠腦組織中BDNF/TrkB/PI3K通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取上述“1.6.2”中適量腦組織,加入細(xì)胞裂解液,4 ℃、12 000 r/min離心10 min提取總蛋白,BAC蛋白定量試劑盒定量分析、SDS-聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,加入稀釋后的BDNF、TrkB、p-PI3K、p-AKT、AKT、PI3K一抗(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000),4 ℃恒溫箱過(guò)夜;TBST洗滌、加入二抗室溫孵育1 h,ECL試劑盒顯色、凝膠成像儀拍照,分析灰度值,計(jì)算各組大鼠BDNF、TrkB、p-PI3K、p-AKT、PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”()表示,多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯升高(P<0.05);與模型組比較,電針組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯降低(P<0.05),抑制劑組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯升高(P<0.05);電針+抑制劑組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分與模型組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);電針+抑制劑組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯高于電針組,而明顯低于抑制劑組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(見(jiàn)表1)
表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較(,分)
表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較(,分)
注:與假手術(shù)組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與電針組比較,cP<0.05;與抑制劑組比較,dP<0.05
2.2 各組大鼠腦梗死面積比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦梗死面積明顯增大(P<0.05);與模型組比較,電針組大鼠腦梗死面積明顯減小(P<0.05),抑制劑組大鼠腦梗死面積明顯增大(P<0.05);電針+抑制劑組大鼠腦梗死面積與模型組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);電針+抑制劑組大鼠腦梗死面積明顯大于電針組,而明顯小于抑制劑組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(見(jiàn)圖1、表2)
表2 各組大鼠腦梗死面積比比較(,%)
表2 各組大鼠腦梗死面積比比較(,%)
注:與假手術(shù)組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與電針組比較,cP<0.05;與抑制劑組比較,dP<0.05
2.3 各組大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2水平比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2含量均明顯升高(P<0.05);與模型組比較,電針組大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2含量均明顯降低(P<0.05),抑制劑組大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2含量均明顯升高(P<0.05);電針+抑制劑組大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2含量與模型組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);電針+抑制劑組大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2含量明顯高于電針組,而明顯低于抑制劑組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(見(jiàn)表3)
表3 各組大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2 水平比較(,ng/mL)
表3 各組大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2 水平比較(,ng/mL)
注:與假手術(shù)組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與電針組比較,cP<0.05;與抑制劑組比較,dP<0.05
2.4 各組大鼠腦組織中BDNF、TrkB、p-PI3K、p-AKT、PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織中BDNF、TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT均明顯降低(P<0.05);與模型組比較,電針組大鼠腦組織中BDNF、TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT均明顯升高(P<0.05),抑制劑組大鼠腦組織中BDNF、TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT均明顯降低(P<0.05);電針+抑制劑組大鼠腦組織中BDNF、TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT與模型組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);電針+抑制劑組大鼠腦組織中BDNF、TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT明顯低于電針組,而明顯高于抑制劑組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(見(jiàn)圖2、表4)
表4 各組大鼠腦組織中BDNF、TrkB、p-PI3K、p-AKT、PI3K、AKT 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較()
表4 各組大鼠腦組織中BDNF、TrkB、p-PI3K、p-AKT、PI3K、AKT 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較()
注:與假手術(shù)組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與電針組比較,cP<0.05;與抑制劑組比較,dP<0.05
腦梗死主要是由于腦部血液流通受阻,致使大腦缺血、缺氧、腦細(xì)胞壞死,與吸煙、年齡、高尿酸血癥及動(dòng)脈粥樣硬化等危險(xiǎn)因素密切相關(guān)[10]。該病發(fā)病快,發(fā)病率、致死率及致殘率均較高?;颊邥?huì)出現(xiàn)認(rèn)知、語(yǔ)言、運(yùn)動(dòng)等方面障礙,嚴(yán)重影響了患者的生理、心理和日常生活。腦梗死須進(jìn)行長(zhǎng)期康復(fù)治療[11-12],其中溶栓、抗凝、護(hù)腦等是常見(jiàn)的治療手段,但治療周期較長(zhǎng),加重了患者的心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),容易對(duì)治療失去信心。因此開(kāi)發(fā)新的腦梗死治療手段已成為心腦血管領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。本研究通過(guò)改良線栓法建立腦梗死大鼠模型,發(fā)現(xiàn)模型大鼠出現(xiàn)右眼霍納綜合征、向左側(cè)轉(zhuǎn)圈、左側(cè)前肢內(nèi)收屈曲等癥狀,這表明造模成功,可進(jìn)行下一步的研究。
中醫(yī)學(xué)又稱腦梗死為“中風(fēng)”,造成該疾病的原因主要與氣血運(yùn)行受阻,清竅失養(yǎng)有關(guān)[13]。針灸作為非藥物治療手段,可以通過(guò)刺激穴位達(dá)到通經(jīng)活絡(luò)、活血化瘀的目的,從而改善神經(jīng)功能缺損[14-15]。百會(huì)穴可通關(guān)開(kāi)竅、補(bǔ)神益智、啟閉醒神;心俞為調(diào)理“心”臟要穴;風(fēng)府可調(diào)動(dòng)五臟六腑之精氣;內(nèi)關(guān)使血、心、脈及神相互聯(lián)系,可起到寧心安神之效。百會(huì)配風(fēng)府,輔以心俞、內(nèi)關(guān),可醒神開(kāi)竅、調(diào)督通絡(luò)。姚文超等[16]研究表明電針百會(huì)、風(fēng)府、心俞、內(nèi)關(guān)聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練,可有效促進(jìn)右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血模型大鼠血管新生,恢復(fù)神經(jīng)功能;王珊等[17]研究表明電針可以緩解腦缺血再灌注大鼠的腦損傷,提高大鼠運(yùn)動(dòng)能力。本研究選擇對(duì)缺血性疾病具有較好療效的百會(huì)、風(fēng)府、內(nèi)關(guān)、心俞進(jìn)行電針干預(yù),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與模型組比較,電針組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死面積均明顯降低。這表明電針治療在一定程度上可以改善腦梗死造成的不良癥狀,但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索。
BNDF作為一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,在腦梗死發(fā)生后,有助于縮小腦組織梗死面積及減輕腦損傷,其生物學(xué)功能主要通過(guò)受體TrkB發(fā)揮作用。BNDF與TrkB結(jié)合形成二聚體的同時(shí)會(huì)誘導(dǎo)TrkB磷酸化,激活下游通路,保護(hù)腦組織,促進(jìn)神經(jīng)元可塑性[18]。PI3K是一種可與營(yíng)養(yǎng)因子結(jié)合的生長(zhǎng)因子,AKT是一種特異性蛋白激酶,一旦受到生長(zhǎng)因子、胰島素等影響,便會(huì)激活PI3K/AKT信號(hào)通路,參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、營(yíng)養(yǎng)代謝等過(guò)程。PI3K/AKT信號(hào)通路作為BNDF/TrkB下游通路之一,在保護(hù)腦組織和抗細(xì)胞缺血缺氧過(guò)程中起著重要作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織中BDNF、TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT均明顯降低,表明抑制BDNF/TrkB/PI3K通路可能是造成大鼠腦損傷的原因。電針組大鼠腦組織中BDNF、TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT均明顯升高,表明電針改善腦梗死造成的不良癥狀,可能與激活BDNF/TrkB/PI3K通路有關(guān)。
BDNF/TrkB/PI3K信號(hào)通路在一定程度上與炎癥因子釋放有密切關(guān)系。線粒體損傷、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、激活凋亡因子等過(guò)程均可導(dǎo)致腦梗死的發(fā)生發(fā)展,其中炎癥反應(yīng)在腦梗死中起著關(guān)鍵作用。腫瘤壞死因子、干擾素、白細(xì)胞介素等炎癥因子是炎癥免疫中的基本介質(zhì),其中腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素相互拮抗,在疾病治療中共同發(fā)揮抑制炎癥作用[20]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步使用BDNF/TrkB/PI3K通路抑制劑K252a干預(yù)大鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與電針組比較,電針+抑制劑組大鼠血清IL-8、IL-2、TNF-ɑ含量均顯著升高,大鼠腦組織中BDNF、TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT均明顯降低,提示BDNF/TrkB/PI3K通路抑制劑可逆轉(zhuǎn)電針對(duì)大鼠腦梗死的緩解作用。這進(jìn)一步揭示了電針可改善腦梗死造成的不良癥狀,減輕炎癥反應(yīng),與激活BDNF/TrkB/PI3K信號(hào)通路。
綜上所述,電針治療可以有效地改善腦梗死大鼠腦損傷,減輕炎癥反應(yīng),其機(jī)制可能與激活BDNF/TrkB/PI3K信號(hào)通路有關(guān)。電針治療腦梗死的作用機(jī)制可能還受其他信號(hào)通路的影響,還有待進(jìn)一步研究。