蔣夢亭，施錦梅，葉文蔚，潘 丹

(臺州學(xué)院附屬市立醫(yī)院 (臺州市立醫(yī)院) 婦科，浙江 臺州 318000)

宮頸癌是發(fā)生在子宮頸部位的惡性腫瘤，疾病晚期的患者預(yù)后較差，且發(fā)病機(jī)制尚不清楚，因此更好地了解腫瘤進(jìn)展非常重要。microRNA是一組小的非編碼RNA，通過結(jié)合目標(biāo)基因互補(bǔ)序列的3’非翻譯區(qū)負(fù)調(diào)節(jié)基因。研究表明，miRNAs在多種生物過程中如細(xì)胞增殖、分化、凋亡和腫瘤發(fā)展等過程中發(fā)揮著重要作用。miR-377是染色體14q32上的大miRNA簇的成員，在一些人類惡性腫瘤中低表達(dá)，包括室管膜瘤、骨肉瘤、胃腸間質(zhì)瘤和膠質(zhì)瘤，有文獻(xiàn)報道m(xù)iR-377通過靶向pim3抑制胰腺癌的增殖。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-377過表達(dá)可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移，并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)HDAC9、ETS-1蛋白表達(dá)有關(guān)。但目前關(guān)于miR-377與宮頸癌之間的關(guān)系尚不明了。本研究擬探究miR-377在宮頸癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入了解其在宮頸癌中發(fā)揮的調(diào)控作用而奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 宮頸癌組織、距病變位置約為10 mm的癌旁正常組織，標(biāo)本來自我院，采集的標(biāo)本均獲得患者或家屬同意。人宮頸上皮永生化細(xì)胞株(H8細(xì)胞)、Hela、SiHa、Caski細(xì)胞購自上海奧陸生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自中國賽默飛世爾科技公司；PKA通路抑制劑H-89購自美國Selleck公司；E-cadherin、N-cadherin抗體購自上海圣克魯斯生物公司；CUL4A siRNA、miR-377 mimics、miR-377 inhibitor質(zhì)粒由GenePharma公司合成。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過本院倫理委員會審查和批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞Hela、SiHa和Caski細(xì)胞、H8細(xì)胞，培養(yǎng)基中添加10% FBS，置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中，長滿后傳代培養(yǎng)。Hela細(xì)胞長滿后分散鋪于12孔板，密度達(dá)70%時，添加DMEM培養(yǎng)基，按照說明書將Turbofect、質(zhì)粒、Opti-MEM混勻后靜置20 min，滴至細(xì)胞中，48 h后收集細(xì)胞樣用于后續(xù)檢測。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分為五組：第一組，包括Control組、mimics NC組和miR-377 mimics組；第二組，包括Control組、inhibitor NC組和miR-377 inhibitor組；第三組，包括CUL4A wt+mimics NC組、CUL4A wt+miR-377mimics組、CUL4A mut+mimics NC組、CUL4A mut+miR-377mimics組；第四組，包括Control組、siRNA NC組和CUL4A siRNA組；第五組，包括Control組、pcDNA-3.1(+)組、pcDNA-CUL4A組和pcDNA-CUL4A+H-89組。

1.3 細(xì)胞增殖測定 Hela細(xì)胞分散鋪于96孔板中，細(xì)胞密度為75%時用Turbofect試劑轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，48 h后加入100 μL PBS清洗，重復(fù)3次，取10 μL CCK-8工作液添加至細(xì)胞內(nèi)，2 h后通過酶標(biāo)儀讀取細(xì)胞在450 nm處的吸光值。

1.4 雙熒光素酶報告基因活性檢測 TargetScan預(yù)測miR-377潛在靶基因以及CUL4A wt載體構(gòu)建成功后，再構(gòu)建CUL4A mut載體。將Hela細(xì)胞接種于12孔板，細(xì)胞長到70%～75%時，將CUL4A wt、CUL4A mut分別與miR-377 mimics、mimics NC質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞，48 h后測定共轉(zhuǎn)細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 從-20 ℃ 取出matrigel，加入無FBS DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋(質(zhì)量濃度為1 mg/mL)，將100 μL matrigel添加于上室中凝成膠狀。調(diào)整Hela細(xì)胞密度為5×10/mL，細(xì)胞懸液添加到Transwell小室，添加DMEM培養(yǎng)基于下室，48 h后加入PBS洗滌小室2次，多聚甲醛固定20 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色15 min。采用直接法進(jìn)行計數(shù)：隨機(jī)選取5個視野細(xì)胞放在顯微鏡下觀察，使用正置顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照，把Transwell小室反過來底朝上可清楚看到小室底膜上下室側(cè)附著的細(xì)胞，直接計數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.6 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行消化并制成單細(xì)胞懸液，每孔取3×10個/孔細(xì)胞置于6孔板中，48 h后取200 μL槍頭在細(xì)胞表面垂直于孔板制造線性劃痕，加入PBS清洗細(xì)胞，添加空培養(yǎng)基后在顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照，最后計算細(xì)胞劃痕愈合率。

1.7 實(shí)時熒光定量PCR 從液氮中取出保存的組織標(biāo)本，-80 ℃ 取出RNA樣品，加入Trizol，并提取組織和細(xì)胞總RNA，RNA濃度和純度測定后，反轉(zhuǎn)成cDNA，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，按照預(yù)變性95 ℃，10 min，變性95 ℃，10 s，退火60 ℃，20 s，延伸72 ℃，30 s，40個循環(huán)的程序進(jìn)行。以GAPDH為內(nèi)參，使用2法分析結(jié)果。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 Western blot 提取組織和細(xì)胞中總蛋白，BCA試劑盒對蛋白裂解產(chǎn)物進(jìn)行定量，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白裂解物，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉在TBST中封閉1 h。PVDF膜與一抗在4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，用二抗在37 ℃孵育1 h，最后蛋白顯影及對蛋白條帶灰度值定量分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-檢驗(yàn)，當(dāng)<0.05時，表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-377在宮頸癌中的表達(dá) 如圖1所示，miR-377在宮頸癌組織的表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，在宮頸癌Hela、SiHa、Caski細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于H8細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.01)，且在Hela細(xì)胞中的表達(dá)量最低，因此選取Hela細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A. miR-377在宮頸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)；B. miR-377在Hela、SiHa、Caski和H8細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 過表達(dá)miR-377對Hela細(xì)胞發(fā)展的影響 RT-qPCR結(jié)果顯示：miR-377 mimics組的miR-377表達(dá)量為2.83±0.57，E-cadherin表達(dá)量為0.87±0.21；Control組和mimics NC組的miR-377表達(dá)量分別為1.03±0.25、1.12±0.73，E-cadherin表達(dá)量分別為0.42±0.06和0.41±0.12；miR-377 mimics組的miR-377、E-cadherin表達(dá)量均高于Control組和mimics NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.01)。如圖2所示，與其他2組比較，miR-377 mimics組細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少，N-cadherin表達(dá)明顯下降，Hela細(xì)胞劃痕愈合率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.01)。

A.CCK-8檢測過表達(dá)miR-377對Hela細(xì)胞增殖的影響；B.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)miR-377對Hela細(xì)胞侵襲的影響；C.Hela細(xì)胞侵襲數(shù)目；D.Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin的表達(dá)量；E.E-cadherin、N-cadherin的相對表達(dá)量；F.細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)miR-377對Hela細(xì)胞遷移的影響；G.Hela細(xì)胞的劃痕愈合率

2.3 下調(diào)miR-377對Hela細(xì)胞發(fā)展的影響 RT-qPCR結(jié)果顯示，miR-377 inhibitor組miR-377表達(dá)量為0.43±0.75，E-cadherin表達(dá)量為0.52±0.08；Control和inhibitor NC組miR-377表達(dá)量分別為1.12±0.22、1.09±0.27，E-cadherin表達(dá)量分別為1.15±0.23和1.06±0.35；miR-377 inhibitor組的miR-377、E-cadherin表達(dá)量均低于Control組和inhibitor NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.01)。由圖3可知，與inhibitor NC或Control組相比，miR-377 inhibitor組細(xì)胞增殖能力升高，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加，N-cadherin表達(dá)明顯上升，E-cadherin表達(dá)明顯下降，Hela細(xì)胞劃痕愈合率明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.01)。

A.CCK-8檢測下調(diào)miR-377對Hela細(xì)胞增殖的影響；B.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)miR-377對Hela細(xì)胞侵襲的影響；C.Hela細(xì)胞的侵襲數(shù)目；D.Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin表達(dá)量；E.E-cadherin、N-cadherin相對表達(dá)量；F.細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)miR-377對Hela細(xì)胞遷移的影響；G.Hela細(xì)胞的劃痕愈合率

2.4 miR-377與CUL4A的關(guān)系 預(yù)測miR-377和CUL4A之間的結(jié)合位點(diǎn)見圖4A。由圖4B結(jié)果可知，和CUL4A wt+mimics NC組相比，CUL4A wt+miR-377mimics組細(xì)胞熒光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.01)；2組間細(xì)胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(>0.05)。由RT-qPCR結(jié)果可知：miR-377 mimics組CUL4A表達(dá)量(0.37±0.65)低于Control組(1.05±0.46)或mimics NC組(1.14±0.83)，miR-377 inhibitor組CUL4A表達(dá)量(2.13±0.42)高于Control組(1.05±0.46)或inhibitor NC組(1.08±0.26)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.01)。

A.TargetScan預(yù)測miR-377和CUL4A之間的結(jié)合位點(diǎn)；B.熒光素酶表達(dá)量的測定

2.5 下調(diào)CUL4A對Hela細(xì)胞發(fā)展的影響 由圖5可知，CUL4A在宮頸癌Hela細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于H8細(xì)胞，CUL4A siRNA組細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯低于Control組或siRNA NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.01)。和Control組或siRNA NC組相比，CUL4A siRNA組E-cadherin表達(dá)明顯上升，N-cadherin表達(dá)明顯下降，Hela細(xì)胞劃痕愈合率明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.01)。

A.RT-qPCR檢測CUL4A在Hela和H8細(xì)胞中的表達(dá)量；B.CCK-8檢測下調(diào)CUL4A對Hela細(xì)胞增殖的影響；C.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)CUL4A對Hela細(xì)胞侵襲的影響；D.Hela細(xì)胞的侵襲數(shù)目；E.Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin表達(dá)量；F.E-cadherin、N-cadherin的相對表達(dá)量；G.細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)CUL4A對Hela細(xì)胞遷移的影響；H.Hela細(xì)胞的劃痕愈合率

2.6 CUL4A通過cAMP/PKA對Hela細(xì)胞發(fā)展的影響 和Control組或pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-CUL4A組細(xì)胞內(nèi)p-cAMP/cAMP和p-PKA/PKA比值升高(圖6A、B)；和Control組相比，H-89作用細(xì)胞后能夠明顯抑制PKA蛋白磷酸化水平(圖6C)；和pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-CUL4A組的細(xì)胞增殖能力、侵襲數(shù)目、N-cadherin表達(dá)和細(xì)胞劃痕愈合率升高、E-cadherin表達(dá)降低(圖6D-6I)；和pcDNA-CUL4A組相比，pcDNA-CUL4A+H-89組的細(xì)胞增殖能力、侵襲數(shù)目、N-cadherin表達(dá)和細(xì)胞劃痕愈合率均降低，E-cadherin表達(dá)升高；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.01)。

A.Western blot檢測過表達(dá)CUL4A對cAMP/PKA通路的影響；B.p-cAMP/cAMP和p-PKA/PKA比值；C.Western blot檢測H-89作用細(xì)胞后對p-PKA、PKA表達(dá)的影響；D.CCK-8檢測過表達(dá)CUL4A通過cAMP/PKA通路對Hela細(xì)胞增殖的影響；E.細(xì)胞侵襲檢測過表達(dá)CUL4A通過cAMP/PKA通路對Hela細(xì)胞侵襲的影響；F.Hela細(xì)胞侵襲數(shù)目；G.Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin表達(dá)量；H.E-cadherin、N-cadherin相對表達(dá)量；I.Hela細(xì)胞的劃痕愈合率；J.細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)CUL4A對Hela細(xì)胞遷移的影響

3 討論

研究表明在許多人類惡性腫瘤如室管膜瘤、胃腸道間質(zhì)瘤和膠質(zhì)瘤中，miR-377的表達(dá)被沉默。事實(shí)上，包括miR-377在內(nèi)的14q32號染色體上的大miRNA簇被稱為最大的miRNA腫瘤抑制簇。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，miR-377在調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面具有豐富的功能，如miR-377的下調(diào)通過靶向HDAC9促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的生長和遷移，另外發(fā)現(xiàn)miR-377靶向ETS1在人透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中發(fā)揮抑癌作用。而在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-377在宮頸癌組織和Hela、SiHa、Caski細(xì)胞中表達(dá)量明顯降低，且過表達(dá)miR-377降低了Hela細(xì)胞活力，抑制了癌細(xì)胞的侵襲，而下調(diào)miR-377則起到相反作用。提示miR-377可能在宮頸癌中起到抑制作用。

先前的研究表明miR-377能夠靶向frizzled類受體4，該受體是前列腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移所必需的。miR-377還被證明靶向細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6和E2F轉(zhuǎn)錄因子3。然而，目前還不清楚miR-377在宮頸癌細(xì)胞中是否靶向CUL4A。EMT是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要過程。通過EMT，癌細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)和血管基底膜獲得更強(qiáng)的移動和遷移到循環(huán)系統(tǒng)中的能力，并由此形成二次轉(zhuǎn)移。調(diào)控EMT在宮頸癌中的發(fā)生可能不僅是預(yù)測宮頸癌預(yù)后的重要生物標(biāo)志物，也是進(jìn)一步研究干預(yù)治療以更有效地抑制或阻斷宮頸癌轉(zhuǎn)移的重要靶點(diǎn)。泛素連接酶E3，根據(jù)泛素轉(zhuǎn)移方式的不同，分為環(huán)指E3泛素連接酶家族和與E6AP C端(HECT)泛素連接酶家族同源的兩大類，在泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解中起作用。CUL4A屬于cullin環(huán)基E3連接酶(CRLs)，是環(huán)指E3泛素連接酶家族的主要組成部分，首先在乳腺癌中被發(fā)現(xiàn)，其擴(kuò)增與多種癌癥的發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。CUL4A在卵巢癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，是miR-377的直接靶點(diǎn)，其活性受miR-377的調(diào)控。本研究表明，在宮頸癌中miR-377靶向和負(fù)調(diào)控CUL4A，且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)CUL4A降低了Hela細(xì)胞活力，抑制了癌細(xì)胞的侵襲和EMT。

許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括轉(zhuǎn)化生長因子β、絲裂原活化蛋白激酶、Notch和Wnt參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT過程。如研究發(fā)現(xiàn)miR-377-3p通過上調(diào)GSK-3β表達(dá)和激活NF-κB通路在hCRC細(xì)胞中驅(qū)動惡性發(fā)展。還有文獻(xiàn)報道m(xù)iR-377-3p、靶向XIAP和ZEB2負(fù)調(diào)控Wnt/catenin信號通路抑制結(jié)直腸癌。本研究表明過表達(dá)CUL4A激活了Hela細(xì)胞內(nèi)cAMP/PKA信號通路，且通過該通路促進(jìn)了癌細(xì)胞的發(fā)展。本研究結(jié)果提示miR-377靶向CUL4A可能通過cAMP/PKA信號通路抑制EMT過程，從而降低Hela細(xì)胞的增殖和遷移能力。

綜上所述，本研究結(jié)果表明miR-377作為CUL4A的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞存活率和侵襲能力降低。本研究為深入了解宮頸癌的發(fā)病機(jī)制提供了理論依據(jù)，miR-377可能是宮頸癌患者的一個有希望的治愈靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步深入探討。