潘天樂 林雅雯 陳 瑩 張定江 賴曉剛 楊春龍 王 宇* 張先福*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，杭州，311304；2.云南石林龍暉野生動(dòng)物科研中心有限公司，石林，652200)

南白犀(Ceratotheriumsimumsimum)又稱方吻犀或?qū)捨窍?，屬奇蹄?Perissodactyla)犀科(Rhinocerotidae)，體型碩大，分布于非洲赤道南北的叢林及草原地帶[1]。由于人類過去對南白犀的肆意捕殺，數(shù)量急劇下降，被CITES列入附錄Ⅱ。

南白犀是世界現(xiàn)存體形最大的犀牛，堪稱“犀牛之王”，雌性6～7歲性成熟，孕期16個(gè)月，繁殖期間隔2～3年[2]。國內(nèi)外關(guān)于南白犀的研究主要涉及疾病[3-7]、組織與血液生化指標(biāo)[8-10]、營養(yǎng)繁殖及行為[11-14]等方面，缺乏睪酮水平方面的研究報(bào)道。

南白犀一年四季均可繁殖，但在南部非洲種群中，繁殖高峰通常在10—12月，在東部非洲種群中，繁殖高峰通常在2—6月，妊娠期長達(dá)16～18個(gè)月，自然繁殖率較低[15]。為提高圈養(yǎng)南白犀的繁殖水平，增加妊娠成功率，開展繁殖高峰期糞便睪酮水平測定，旨在探索雄性南白犀睪酮分泌量與年齡相關(guān)性，為繁殖生理監(jiān)測和種群繁育管護(hù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣對象與采樣方法

采樣對象為石林龍暉野生動(dòng)物科研中心(簡稱石林)、三亞龍暉動(dòng)物繁育有限公司(三亞)和杭州野生動(dòng)物世界(杭州)圈養(yǎng)的南白犀群體，共46頭，均由南非引進(jìn)，最初飼養(yǎng)于海南三亞犀?；兀?010年起逐步將大部分南白犀轉(zhuǎn)移到云南石林飼養(yǎng)繁育。轉(zhuǎn)移時(shí)南白犀平均年齡5歲，最大13歲，最小3歲。2012年6月—2013年7月，分別在3處地點(diǎn)收集所有南白犀的年齡數(shù)據(jù)，采集雄性圈養(yǎng)南白犀的糞便(2011年11月在三亞和杭州收集5頭)，采樣時(shí)間為09：00—10：00，采集的糞便樣品立即裝入封口收集袋中，-20 ℃保存(表1)。

1.2 糞便睪酮水平的測定

提取糞樣激素，ELISA方法測定南白犀糞便樣品中的睪酮水平。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，糞便樣本睪酮水平以μg/g表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 18.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，聚類分析采用系統(tǒng)聚類法(Ward法)，組間差異性分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差法(one-way ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雄性南白犀糞便睪酮水平聚類分析

為探究雄性南白犀群體糞便睪酮水平個(gè)體差異及分布特點(diǎn)，對個(gè)體的糞便睪酮水平進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果將46頭南白犀糞便睪酮水平分為4個(gè)類別，各聚類組間南白犀睪酮水平差異顯著(P<0.05)(表2)。

表2 聚類各組雄性南白犀的糞便睪酮水平

2.2 不同年齡雄性南白犀的糞便睪酮水平

為探究雄性南白犀糞便睪酮水平與年齡的相關(guān)性，對不同年齡糞便睪酮水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。南白犀4～8歲時(shí)，睪酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.034～0.037 μg/g，沒有明顯的年齡相關(guān)趨勢。與4～8歲各年齡相比，10歲后的糞便睪酮水平顯著上升(P<0.05)。綜上，隨年齡的增加，睪酮水平逐步上升，10歲及以后顯著上升(表3)。

表3 不同年齡雄性南白犀的糞便睪酮水平

2.3 不同年齡雄性南白犀的發(fā)情行為

對46頭不同年齡雄性南白犀的發(fā)情行為分析統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增加，表現(xiàn)出發(fā)情行為的個(gè)體數(shù)量逐漸增加，未表現(xiàn)發(fā)情行為的個(gè)體數(shù)量逐漸降低。在表現(xiàn)出發(fā)情行為的各年齡中，4～6歲逐漸表現(xiàn)出發(fā)情行為，但普遍交配不成功；表現(xiàn)出發(fā)情行為的8頭8歲南白犀中，3頭交配成功；10歲和13歲表現(xiàn)出發(fā)情行為，皆成功交配。因此，8歲可能是雄性南白犀性成熟臨界點(diǎn)(表4)。

表4 不同年齡雄性南白犀的發(fā)情行為表現(xiàn)

2.4 不同年齡雄性南白犀的聚類分組情況

對不同年齡雄性南白犀的聚類分組統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，4歲組(5只)分屬3個(gè)不同的聚類分組(組1、組2和組3)；5歲組(17只)分屬3個(gè)不同的分組(組1、組2和組3)；6歲組(7只)分屬2個(gè)不同的分組(組1和組2)；8歲組(13只)分屬4個(gè)不同的分組(組1、組2、組3和組4)；10歲個(gè)體僅1只，歸屬組4；13歲組(3只)分屬2個(gè)不同的分組(組3和組4)。結(jié)果表明，同一年齡的圈養(yǎng)南白犀糞便睪酮水平波動(dòng)較大，特別是在4～8歲，處于很不穩(wěn)定的狀態(tài)(表5)。

表5 不同年齡圈養(yǎng)雄性南白犀的聚類分組情況

3 討論

本研究采用非損傷采樣方法，通過收集南白犀糞便，檢測糞便睪酮含量，避免了機(jī)械保定、化學(xué)麻醉或其他人為干擾對睪酮激素分泌的影響[16]，發(fā)現(xiàn)南白犀糞便睪酮水平分為4個(gè)類別，各聚類組間睪酮水平差異顯著，每個(gè)聚類可視為具有相同或相似繁殖生理特征的南白犀群體，具有明顯的多樣性。南白犀的糞便睪酮水平與其年齡有著一定的相關(guān)性，呈現(xiàn)隨年齡增加而逐步增多的趨勢，到10歲后，糞便睪酮水平顯著上升；但在4～8歲時(shí)，睪酮含量沒有明顯的年齡相關(guān)性。南白犀平均壽命約50歲，龍暉野生動(dòng)物科研中心最近幾年的繁殖實(shí)踐證明，雄性南白犀25歲仍然具有旺盛的交配力和繁殖力，在10～25歲，睪酮水平仍然維持在發(fā)情高位，至于何時(shí)開始睪酮水平下降，喪失發(fā)情交配能力，未見記載，有待今后飼養(yǎng)實(shí)踐來闡明。

本研究表明，在4～8歲，同一年齡的圈養(yǎng)南白犀糞便睪酮水平波動(dòng)較大，分屬于多個(gè)聚類分組，年齡因素不足以作為判斷性發(fā)育水平的唯一標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合聚類分析，輔助南白犀繁育、管護(hù)和獸醫(yī)臨床實(shí)踐，可以更好地綜合整體性和個(gè)體性來預(yù)測南白犀的性發(fā)育水平。長期慢性應(yīng)激如圈養(yǎng)狀態(tài)下的空間限制、伴侶缺乏、食物限制[17]、近親繁殖[18]和環(huán)境[19]等因子，也會(huì)不同程度影響南白犀的繁殖功能及繁育效果。

睪酮水平直接影響犀牛性發(fā)育和性行為表現(xiàn)[20]。本研究對不同年齡的雄性南白犀的發(fā)情行為進(jìn)行了實(shí)際觀察，自4歲起，逐漸表現(xiàn)出交配行為，交配成功最早出現(xiàn)在8歲，說明8歲及以后才表現(xiàn)為性成熟。而野生狀態(tài)下雄性南白犀在6歲左右性成熟，圈養(yǎng)南白犀的性成熟時(shí)間可能略有推遲。我國地處北半球，氣候、飼料及管理方式與南白犀原產(chǎn)地差別較大，這可能影響南白犀的性成熟，至于如何降低這些不利影響有待進(jìn)一步研究。

圈養(yǎng)南白犀能否成功繁育，關(guān)系到引入南白犀飼養(yǎng)種群的穩(wěn)定和增長。本研究分析不同年齡南白犀糞便睪酮水平，推斷4～8歲屬于亞成體到成體的過渡期，糞便睪酮水平波動(dòng)較大，對生長發(fā)育和繁殖可能會(huì)產(chǎn)生一定影響，應(yīng)將這一年齡作為關(guān)注的重點(diǎn)。