王予辰 陳 瑩 王 宇* 金 煜*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2.云南石林龍暉野生動(dòng)物科研中心有限公司，石林，652200)

奇蹄目(Perissodactyla)犀科(Rhinocerotidae)共4屬5種，即黑犀(Dicerosbicornis)、白犀(Ceratotheriumsimum)、印度犀(Rhinocerosunicornis)、爪哇犀(Rh.sondaicus)和蘇門答臘犀(Dicerorhinussumatrensis)，都處于瀕危狀態(tài)，被列入CITES附錄Ⅰ，僅南白犀(Ceratotheriumsimumsimum)被列入附錄Ⅱ。白犀歷史上在整個(gè)南部非洲草原均有分布[1]。20世紀(jì)初，南非白犀種群遭到殖民者的大量屠殺，僅有約100頭存活在南非東海岸的一小塊區(qū)域[2]，后雖從滅絕邊緣恢復(fù)，但一直受盜獵、棲息地破碎喪失和犀牛制品非法國際貿(mào)易等因素影響處于受危狀態(tài)。

犀牛生殖需經(jīng)歷4～6周的發(fā)情期、16個(gè)月的妊娠期和1～6個(gè)月的哺乳期，總周期1.5～2.0年，是陸生哺乳動(dòng)物最長的生殖周期之一[3]。白犀野外繁殖率相對(duì)較低，主要受限于繁殖生物學(xué)的特性以及環(huán)境波動(dòng)等；人工繁育生產(chǎn)率有所提高，借助觀察各種產(chǎn)前變化、血清孕酮含量、不同產(chǎn)程和胎兒情況等幫助診斷難產(chǎn)和圍產(chǎn)期并發(fā)癥，可以減少生產(chǎn)過程中的死亡率，提高種群的出生率[4-5]。

南非殖民時(shí)期的遭遇使南白犀的遺傳變異性比其他種的犀牛都要低[6]，由于缺乏分散的機(jī)會(huì)，小而孤立的種群在近親間繁殖的風(fēng)險(xiǎn)特別大，需要對(duì)種群交配系統(tǒng)具有廣泛和持續(xù)的了解，以確定近親繁殖可能造成的風(fēng)險(xiǎn)，因此詳細(xì)準(zhǔn)確的譜系記錄對(duì)于南白犀的種群發(fā)展至關(guān)重要。種群的遷移易位以及多雄交配使得真實(shí)父權(quán)難以通過觀察得到[7]，利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記進(jìn)行親子鑒定可以很好地解決這一問題，為種群的所有個(gè)體提供準(zhǔn)確的譜系信息，實(shí)行最佳的管理和保護(hù)。

本研究以110頭人工半散放南白犀為研究對(duì)象，篩選出13個(gè)多態(tài)性好且可靠性高的微衛(wèi)星位點(diǎn)，利用相關(guān)軟件計(jì)算其遺傳多樣性和累積排除概率，分析這些位點(diǎn)用于南白犀親子鑒定的可行性，給出位點(diǎn)聯(lián)合使用方案。選用4組雙親本已知三聯(lián)體組合對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，在此基礎(chǔ)上，對(duì)2只父系不清幼體的生物學(xué)父親進(jìn)行了確認(rèn)，以期確定選用的微衛(wèi)星位點(diǎn)組合在實(shí)際應(yīng)用中的有效性。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

群體為人工半散放非洲南白犀，共110頭，樣本為靜脈血，于2020年12月23日在石林龍暉野生動(dòng)物科研中心采集。

1.2 基因組DNA提取及檢測(cè)

用Axygen公司Blood Genomic DNA Miniprep Kit 250-prep試劑盒提取血液樣本基因組DNA，利用德國Implen NanoPhotometer-N50超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。

1.3 引物篩選和PCR擴(kuò)增

查閱文獻(xiàn)獲得26對(duì)犀牛的微衛(wèi)星引物[8-12]；依據(jù)NCBI所載非洲南白犀全基因組序列，使用SSRHunter查找微衛(wèi)星重復(fù)序列，自行設(shè)計(jì)30對(duì)引物(BX1～BX30)。全部引物由北京擎科生物科技有限公司合成，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否擴(kuò)增出產(chǎn)物。擴(kuò)增體系(總體積20.0 μL)：10.0 μLTaqMaster Mix酶，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 7.2 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，50～62 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.4 引物的熒光標(biāo)記和毛細(xì)管分型

在引物5′端用FAM熒光基團(tuán)修飾(北京擎科生物科技有限公司)，擴(kuò)增產(chǎn)物通過毛細(xì)管電泳測(cè)序(生工生物工程(上海)股份有限公司)，運(yùn)用GeneMapper 4.0軟件，以LIZ-500為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，進(jìn)行基因分型，獲得相應(yīng)位點(diǎn)的長度多態(tài)信息。

1.5 數(shù)據(jù)處理及微衛(wèi)星位點(diǎn)組合篩選

使用POPGENE軟件計(jì)算各位點(diǎn)的等位基因數(shù)、雜合度和多態(tài)信息含量，并對(duì)各位點(diǎn)進(jìn)行MicroChecker檢驗(yàn)和哈溫平衡(Hardy-Weinberg)檢測(cè)。利用Cervus 3.0軟件計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)在2個(gè)親本基因型未知、1個(gè)親本基因型已知和2個(gè)親本基因型已知情況下的非父排除概率及累積非父排除概率，確定最適用于南白犀親子鑒定的微衛(wèi)星位點(diǎn)組合方案。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性及MicroChecker檢驗(yàn)

56對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，有32對(duì)引物擴(kuò)增出目的條帶(表1)。通過毛細(xì)管電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)DB5、DB14、DB23、DB30、IR22、SR74、BX10、BX21和BX23位點(diǎn)的等位基因數(shù)只有1個(gè)，余下的23個(gè)位點(diǎn)經(jīng)過MicroChecker檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)有10個(gè)位點(diǎn)存在無效等位基因和等位基因缺失的情況，故實(shí)際僅有13個(gè)位點(diǎn)可用于后續(xù)的親子關(guān)系分配(表2)。

續(xù)表1

表2 MicroChecker篩選的可用于南白犀親子關(guān)系分配的位點(diǎn)

供試群體共檢測(cè)出37個(gè)等位基因，其中BX1的等位基因數(shù)目最多，為5個(gè)，DB1、AY138545、BX2、BX26和BX29等位基因數(shù)目最少，均為2個(gè)。各位點(diǎn)在群體中的觀察雜合度(Ho)為0.036～1.000，平均值為0.511；期望雜合度(He)為0.053～0.759，平均值為0.482。根據(jù)Botstein等[13]的PIC分類標(biāo)準(zhǔn)，共檢測(cè)到4個(gè)高度多態(tài)位點(diǎn)(PIC>0.500)，6個(gè)中度多態(tài)位點(diǎn)(0.250

表3 南白犀13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性

2.2 非父排除概率和累積非父排除概率

2.2.1 非父排除概率

13個(gè)位點(diǎn)的非父排除概率計(jì)算結(jié)果：PE-1P值為0.001～0.351，PE-2P值為0.026～0.530，PE-PP值為0.050～0.712。BX1位點(diǎn)的多態(tài)信息含量最高，其PE-1P、PE-2P、PE-PP的值也最高；BX29位點(diǎn)多態(tài)信息含量最低，其PE-1P、PE-2P、PE-PP的值也最低，即PE-1P、PE-2P、PE-PP值隨PIC的降低而降低(表4)。

表4 南白犀13個(gè)位點(diǎn)的平均排除概率

2.2.2 累積非父排除率

將13個(gè)位點(diǎn)根據(jù)多態(tài)信息含量(PIC)由高到低排列，將其作為位點(diǎn)組合的依據(jù)，依次計(jì)算位點(diǎn)數(shù)目從1增加到13時(shí)的聯(lián)合排除概率。結(jié)果顯示：隨著聯(lián)用位點(diǎn)數(shù)的增加，聯(lián)合排除概率隨之增高；三聯(lián)體親子鑒定中，微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)達(dá)到13時(shí)，聯(lián)合排除概率CPE-PP的值超過99%(表4)。

2.3 種群實(shí)測(cè)與效果評(píng)價(jià)

根據(jù)表4可知在CPE-PP的情況下，采用的13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的累積非父排除率可達(dá)到99%以上，利用這些位點(diǎn)對(duì)4組共12頭具有譜系記錄的南白犀進(jìn)行親子鑒定分析，包括子代4頭、母本4頭和父本4頭，計(jì)算每個(gè)子代父親的LOD值來驗(yàn)證所選取的微衛(wèi)星位點(diǎn)組合的準(zhǔn)確性。

在2個(gè)親本基因型已知的情況下，計(jì)算4個(gè)父本的LOD值，F(xiàn)-01、F-02和F-04的LOD值均達(dá)到95%的嚴(yán)格置信度(表5)。Cervus分配的最似父本與譜系記錄一致，所選用的13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)組合適于在2個(gè)親本基因型已知的情況下確定親生父本。

表5 南白犀13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)組合的LOD值

表6 南白犀親子鑒定結(jié)果

在只有母本基因型清楚的情況下，利用該微衛(wèi)星位點(diǎn)組合對(duì)2個(gè)父本不清的子代進(jìn)行親子鑒定，C-01的3個(gè)候選父親中，F(xiàn)-04和F-06存在的錯(cuò)配位點(diǎn)過多，未計(jì)算出LOD值；F-05的LOD值達(dá)到95%的嚴(yán)格置信度，鑒定為C-01的親生父親。C-02的2個(gè)候選父親中，F(xiàn)-07也因錯(cuò)配位點(diǎn)過多未計(jì)算出LOD值，親生父親經(jīng)鑒定為F-03。

3 討論

3.1 分型的可靠性

現(xiàn)有的關(guān)于犀牛的微衛(wèi)星標(biāo)記大部分都是二堿基重復(fù)序列，在DNA復(fù)制過程中極容易出現(xiàn)引物或模板滑脫，滑動(dòng)鏈與互補(bǔ)鏈堿基錯(cuò)配，形成影子帶。在毛細(xì)管分型圖譜中，影子帶通常比等位基因少一個(gè)或多一個(gè)重復(fù)單元，形成的影子峰緊挨著主峰，特別是對(duì)雜合子個(gè)體而言極易造成分型錯(cuò)誤。為了減少按DNA分子質(zhì)量測(cè)定值計(jì)算等位基因DNA片段長短所產(chǎn)生的誤差[14]，選用四堿基重復(fù)序列可得到更準(zhǔn)確的基因分型結(jié)果。通過NCBI查找南白犀的全基因組序列，設(shè)計(jì)了多對(duì)四堿基微衛(wèi)星引物，結(jié)果顯示影子帶出現(xiàn)頻率極低，便于判讀基因分型結(jié)果。

采用微衛(wèi)星標(biāo)記分析親子關(guān)系時(shí)，無效等位基因的存在會(huì)直接影響親本分析結(jié)果，Dakin等[15]研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)位點(diǎn)存在無效等位基因，且頻率較高時(shí)，會(huì)造成親本分析結(jié)果的混亂和錯(cuò)誤，故本研究所有位點(diǎn)利用MicroChecker剔除存在無效等位基因的位點(diǎn)，保證后續(xù)分析結(jié)果的可靠性。

3.2 位點(diǎn)的多態(tài)信息含量

每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)量不僅是衡量遺傳變異的指標(biāo)，也是實(shí)現(xiàn)高親本分配率的重要因素，DB52和DB1位點(diǎn)是專門為黑犀設(shè)計(jì)的，本研究中檢測(cè)出的等位基因數(shù)量同Brown等[9]的研究相比數(shù)量較少，與Nielsen等[8]的相同，因此在跨物種研究中使用這2個(gè)位點(diǎn)時(shí)無法提供相同水平的多態(tài)信息含量。AY138541、AY138542、AY138544和AY138545位點(diǎn)是專門為南白犀設(shè)計(jì)的，但由于群體不同，導(dǎo)致等位基因數(shù)量同F(xiàn)lorescu等[16]的相比較少，因此專門新設(shè)計(jì)了7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，可提供較多的等位基因數(shù)量和多態(tài)信息含量。

根據(jù)本研究確定的遺傳參數(shù)，發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性水平并不像歷史瓶頸所預(yù)期的那樣低，本研究中描述群體雜合度的參數(shù)平均值，如Ho、He比其他南白犀基因研究中發(fā)現(xiàn)的參數(shù)平均值略高。微衛(wèi)星標(biāo)記在其他南白犀研究中估計(jì)的平均Ho為0.435～0.478[6，17-19]，而本研究的平均Ho為0.511，這可能是由于混合先前分離的小種群產(chǎn)生的效應(yīng)，如在納米比亞的一個(gè)南白犀種群中，F(xiàn)0和F1動(dòng)物的雜合度高于F2，因?yàn)镕0是從不同地方遷移的[6]。

進(jìn)行親子鑒定時(shí)，應(yīng)選用符合Hardy-Weinberg平衡的微衛(wèi)星位點(diǎn)，但是只有當(dāng)一個(gè)大的孟德爾群體內(nèi)的個(gè)體間進(jìn)行隨機(jī)交配，不存在選擇、突變和遷移等情況時(shí)[20]，該群體的微衛(wèi)星位點(diǎn)才處于平衡?，F(xiàn)有南白犀的微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)目有限，且選用的試驗(yàn)群體為半散放人工養(yǎng)殖群體，群體內(nèi)奠基者效益較嚴(yán)重，為了充分利用遺傳信息，故將偏離Hardy-Weinberg平衡的位點(diǎn)也全部應(yīng)用進(jìn)來。

3.3 親子鑒定的有效性和可靠性

由于白犀的遺傳多樣性較低，對(duì)于南白犀的父權(quán)認(rèn)定大都采用三聯(lián)體，但是有些在親子分配方面并不能達(dá)到100%嚴(yán)格置信。Coutts[17]試圖在2個(gè)南白犀種群中確定父權(quán)，2個(gè)種群都有10頭小牛和12個(gè)候選父親，分析表明，每個(gè)種群僅有1頭小牛能達(dá)到95%嚴(yán)格置信；Kim[21]也利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)黑犀種群進(jìn)行親子關(guān)系研究，6頭小牛有2只達(dá)到了95%的嚴(yán)格置信，與Coutts[17]相比其候選父親數(shù)量很少，為2～5個(gè)。Garnier等[22]能夠明確地為一個(gè)小野生黑犀種群(n=33)的19個(gè)后代指定親緣關(guān)系，選用的10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)排除概率為0.593～0.999，雙親基因型已知時(shí)的聯(lián)合排除概率達(dá)到了0.999。本研究選用的13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)排除概率在0.050～0.712，雙親基因型已知時(shí)的聯(lián)合排除概率達(dá)到了0.998，選用的4頭小牛最似父親分配均達(dá)到嚴(yán)格置信，位點(diǎn)排除概率相對(duì)較低的主要原因可能是黑犀種群的遺傳多樣性比白犀種群高[1]，故選用排除率高的位點(diǎn)組合進(jìn)行親子關(guān)系分析時(shí)可靠性會(huì)顯著提高。

復(fù)合擴(kuò)增雖然可以有效提高等位基因分型效率，尤其是從毛發(fā)等非損傷性材料中提取DNA用于試驗(yàn)，但是本研究選用的13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因長度相似，這導(dǎo)致在同一個(gè)體系中無法使用一種熒光基團(tuán)擴(kuò)增多個(gè)位點(diǎn)，在同一體系中熒光基團(tuán)數(shù)量過多可能出現(xiàn)相互抑制的情況，故均采用FAM熒光基團(tuán)進(jìn)行修飾。犀牛人工繁育和野外最易獲得的是糞便，因此本方法適用性仍然比較廣泛，只是分析成本相對(duì)較高。