甄瑾，春梅，李敏，劉斌，王梅玲，云永利，柳雅潔，馬翔凌

白介素（interleukin，IL）-22是由多種免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，包括輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）17、NK22細(xì)胞和Th22［1］，其可參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）、干燥綜合征和銀屑病等。MS是典型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）特發(fā)性炎性脫髓鞘疾?。╥diopathic inflammatory demyelinating diseases，IIDDs），其好發(fā)于年輕女性。研究證實，IL-22受體α2升高是MS的危險因素［2］，IL-22參與了血-腦脊液屏障（blood brain barrier，BBB）的破壞，進(jìn)而促進(jìn)淋巴細(xì)胞進(jìn)入CNS，增加炎癥因子釋放，加速MS進(jìn)程［3］。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是CNS的一類重要細(xì)胞，其可為CNS神經(jīng)元提供營養(yǎng)支持，促進(jìn)神經(jīng)突觸形成，且其在維持CNS穩(wěn)態(tài)和功能中起關(guān)鍵作用。研究表明，阿爾茨海默病、帕金森病、MS等神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者以補(bǔ)體C3高表達(dá)為特征的A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞含量升高［4］；此外，F(xiàn)KBP5、GGTA1、Serping1、Srgn等蛋白表達(dá)增加也是A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞的重要特征［5］。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可通過分泌IL-1α、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、C1q等細(xì)胞因子可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞向A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化［4］。但I(xiàn)L-22作為MS病理進(jìn)程中的重要細(xì)胞因子，對星形膠質(zhì)細(xì)胞向A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化是否有影響尚未見報道。本研究旨在探討IL-22對星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用及可能機(jī)制，以期為MS發(fā)病機(jī)制的研究提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2020-06-20至2021-09-23。

1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：重組人IL-22蛋白（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，貨號：bs-2623R），重組人IL-1α（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，貨號：bs-4947p），重組人TNF-α（Abcam公司，貨號：ab9642），重組人C1q（Abcam公司，貨號：ab96363），TRIzol（美國Sigma公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme公司），StarLighter Probe qPCR Mix（Universal）（北京啟恒星科技有限公司，F(xiàn)S-Q3002），兔抗C3單抗（Abcam公司，貨號：ab200999），兔抗磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶p38（phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase，p-p38 MAPK）抗體（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，貨號：bs-5476R），兔抗磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶活化的蛋白激酶2（phosphorylated mitogen activated protein kinase activated protein kinase 2，p-MAPKAPK-2）抗體（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，貨號：bs-5503R），二抗羊抗兔單克隆抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：A0208）。主要儀器：細(xì)胞二氧化碳培養(yǎng)箱（SANYO，MCO-175），Vortex振蕩器（Kylin-Bell Lab Instruments，XW-80A），移液器（Eppendorf Reference，4924000908），混勻儀（其林貝爾儀器制造有限公司，TS-100），Nanodrop分光光度計（Thermo，2000/2000C），qPCR儀（ABI，VII7），SDS-Acryl/Bis蛋白電泳儀（上海天能科技有限公司，VE-180），蛋白轉(zhuǎn)膜儀（上海天能科技有限公司，VE-186），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（GE，AI600）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800（購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）在AM1801培養(yǎng)基中培養(yǎng)（傳代不超過10代），待細(xì)胞生長融合至90%，采用0.25%胰酶消化細(xì)胞并加入4 ml完全培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞，轉(zhuǎn)入15 ml離心管中，800 r/min（離心半徑10 cm）離心3 min，棄上清液。再用3 ml含10% FBS的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并將其分到3個T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 qPCR 將人星形膠質(zhì)細(xì)胞分為對照組、IL-22處理組、C1q+TNF-α+IL-1α處理組及C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22處理組。對照組細(xì)胞未進(jìn)行特殊處理，IL-22處理組細(xì)胞給予IL-22（400 ng/ml）處理48 h，C1q+TNF-α+IL-1α處理組細(xì)胞給予C1q（400 ng/ml）、TNF-α（30 ng/ml）、IL-1α（3 ng/ml）聯(lián)合處理48 h，C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22處理組細(xì)胞給予C1q（400 ng/ml）、TNF-α（30 ng/ml）、IL-1α（3 ng/ml）、IL-22（400 ng/ml）聯(lián)合處理48 h。之后采用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞。采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，Nanodrop 100分光光度計檢測RNA濃度及質(zhì)量。將1.0 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA的第一鏈，之后以cDNA為模板進(jìn)行qPCR，檢測補(bǔ)體C3 mRNA表達(dá)水平，實驗獨立重復(fù)3次。

將人星形膠質(zhì)細(xì)胞分為對照組和IL-22處理組，對照組細(xì)胞未進(jìn)行特殊處理；IL-22處理組細(xì)胞給予IL-22（400 ng/ml）處理48 h。采用qPCR檢測FKBP5、GGTA1、Serping1、Srgn mRNA表達(dá)水平，檢測步驟同上，實驗獨立重復(fù)3次。qPCR引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列Table 1 qPCR primer sequences

1.3.3 Western blot法 將人星形膠質(zhì)細(xì)胞分為對照組、IL-22處理組、C1q+TNF-α+IL-1α處理組及C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22處理組。對照組細(xì)胞未進(jìn)行特殊處理，IL-22處理組細(xì)胞給予IL-22（400 ng/ml）處理48 h，C1q+TNF-α+IL-1α處理組細(xì)胞給予C1q（400 ng/ml）、TNF-α（30 ng/ml）、IL-1α（3 ng/ml）聯(lián)合處理48 h，C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22處理組細(xì)胞給予C1q（400 ng/ml）、TNF-α（30 ng/ml）、IL-1α（3 ng/ml）、IL-22（400 ng/ml）聯(lián)合處理48 h。之后采用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，加入200 μl細(xì)胞裂解液（150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.1% SDS，1 mmol/L PMSF，1%蛋白酶抑制劑），置于冰上裂解10 min。4 ℃環(huán)境下，12 000 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加上樣緩沖液；4 ℃環(huán)境下，12 000 r/min（離心半徑10 cm）離心1 min，采用Bradford法檢測總蛋白濃度。然后取20 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，采用5%脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉1 h，TBST洗膜3次，5 min/次。加入一抗（1∶2 000），4 ℃過夜；加入二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，10 min/次。采用ECL法顯色，檢測補(bǔ)體C3蛋白表達(dá)水平，實驗獨立重復(fù)3次。

將人星形膠質(zhì)細(xì)胞分為對照組、IL-22處理組、絲裂原活化蛋白激酶p38（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）抑制劑處理組、IL-22+p38 MAPK抑制劑處理組。對照組細(xì)胞未進(jìn)行處理，IL-22處理組細(xì)胞采用IL-22（400 ng/ml）處理60 min，p38 MAPK抑制劑處理組細(xì)胞采用p38 MAPK 抑制劑SB202190（10 μmol/L）處理60 min，IL-22+p38 MAPK抑制劑處理組細(xì)胞采用IL-22（400 ng/ml）、p38 MAPK 抑制劑SB202190（10 μmol/L）處理60 min。采用Western blot法檢測磷酸化p38（phosphorylated p38，p-p38）、p-MAPKAPK-2、補(bǔ)體C3蛋白表達(dá)水平，檢測方法同上，實驗獨立重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad prism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，兩組間比較采用成組t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-22促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞補(bǔ)體C3 mRNA、蛋白表達(dá) 對照組、IL-22處理組、C1q+TNF-α+IL-1α處理組、C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22處理組補(bǔ)體C3 mRNA、蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；IL-22處理組、C1q+TNF-α+IL-1α處理組及C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22處理組補(bǔ)體C3 mRNA、蛋白表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C1q+TNF-α+IL-1α處理組、C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22處理組補(bǔ)體C3 mRNA、蛋白表達(dá)水平高于IL-22處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖1。

表2 對照組、IL-22處理組、C1q+TNF-α+IL-1α處理組及C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22處理組補(bǔ)體C3 mRNA、蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of expression levels of complement C3 mRNA and protein in the control group，IL-22 interventional group，C1q+TNF-α+IL-1α interventional group and C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22 interventional group

表2 對照組、IL-22處理組、C1q+TNF-α+IL-1α處理組及C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22處理組補(bǔ)體C3 mRNA、蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of expression levels of complement C3 mRNA and protein in the control group，IL-22 interventional group，C1q+TNF-α+IL-1α interventional group and C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22 interventional group

注：IL=白介素，TNF-α=腫瘤壞死因子α；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與IL-22處理組比較，P＜0.05

組別 補(bǔ)體C3 mRNA 補(bǔ)體C3蛋白對照組 1.001±0.063 0.361±0.023 IL-22處理組 1.848±0.054a 0.618±0.029a C1q+TNF-α+IL-1α處理組 2.622±0.084ab 0.720±0.064ab C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22處理組 2.760±0.096ab 1.195±0.075ab F值 340.700 132.787 P值 ＜0.001 ＜0.001

圖1 對照組、IL-22處理組、C1q+TNF-α+IL-1α處理組、C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22處理組補(bǔ)體C3蛋白SDS-PAGE圖Figure 1 SDS-PAGE of complement C3 protein in the control group，IL-22 interventional group，C1q+TNF-α+IL-1α interventional group and C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22 interventional group

2.2 IL-22促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞FKBP5、GGTA1、Serping1、Srgn mRNA表達(dá) IL-22處理組FKBP5、GGTA1、Serping1、Srgn mRNA表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 對照組和IL-22處理組FKBP5、GGTA1、Serping1、Srgn mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of mRNA expression levels of FKBP5，GGTA1，Serping1 and Srgn between control group and IL-22 interventional group

表3 對照組和IL-22處理組FKBP5、GGTA1、Serping1、Srgn mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of mRNA expression levels of FKBP5，GGTA1，Serping1 and Srgn between control group and IL-22 interventional group

組別 FKBP5 GGTA1 Serping1 Srgn對照組 1.003±0.087 0.813±0.150 1.432±0.076 1.585±0.392 IL-22處理組 1.262±0.084 1.566±0.115 2.503±0.368 2.655±0.116 t值 -3.709 -6.900 -4.937 -4.533 P值 0.021 0.002 0.008 0.011

2.3 IL-22調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞補(bǔ)體C3蛋白表達(dá)的相關(guān)信號通路 對照組、IL-22處理組、p38 MAPK抑制劑處理組、IL-22+p38 MAPK抑制劑處理組p-p38、p-MAPKAPK-2、補(bǔ)體C3蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；IL-22處理組p-p38、p-MAPKAPK-2、補(bǔ)體C3蛋白表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；p38 MAPK抑制劑處理組p-p38、p-MAPKAPK-2、補(bǔ)體C3蛋白表達(dá)水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；IL-22+p38 MAPK抑制劑處理組p-p38、p-MAPKAPK-2、補(bǔ)體C3蛋白表達(dá)水平低于IL-22處理組，但高于p38 MAPK抑制劑處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4、圖2。

圖2 對照組、IL-22處理組、p38 MAPK抑制劑處理組、IL-22+p38 MAPK抑制劑處理組p-p38、p-MAPKAPK-2、補(bǔ)體C3蛋白SDS-PAGE電泳圖Figure 2 SDS-PAGE electrophoresis of p-p38，p-MAPKAPK-2 and complement C3 protein in control group，IL-22 interventional group，p38 MAPK inhibitor interventional group and IL-22+p38 MAPK inhibitor interventional group

表4 對照組、IL-22處理組、p38 MAPK抑制劑處理組、IL-22+p38 MAPK抑制劑處理組p-p38、p-MAPKAPK-2、補(bǔ)體C3蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 4 Comparison of expression levels of p-p38，p-MAPKAPK-2 and complement C3 protein in control group，IL-22 interventional group，p38 MAPK inhibitor interventional group and IL-22+p38 MAPK inhibitor interventional group

表4 對照組、IL-22處理組、p38 MAPK抑制劑處理組、IL-22+p38 MAPK抑制劑處理組p-p38、p-MAPKAPK-2、補(bǔ)體C3蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 4 Comparison of expression levels of p-p38，p-MAPKAPK-2 and complement C3 protein in control group，IL-22 interventional group，p38 MAPK inhibitor interventional group and IL-22+p38 MAPK inhibitor interventional group

注：p38 MAPK=絲裂原活化蛋白激酶p38，p-p38=磷酸化p38，p-MAPKAPK-2=磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶活化的蛋白激酶2；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與IL-22處理組比較，P＜0.05；c表示與p38 MAPK抑制劑處理組比較，P＜0.05

組別 p-p38 p-MAPKAPK-2 補(bǔ)體C3蛋白對照組 0.761±0.067 0.827±0.018 0.956±0.050 IL-22處理組 1.218±0.043a 1.244±0.052a 1.145±0.068a p38 MAPK抑制劑處理組 0.631±0.013a 0.682±0.011a 0.574±0.015a IL-22+p38 MAPK抑制劑處理組 0.755±0.060bc 0.872±0.041bc 0.912±0.100bc F值 78.854 139.748 39.197 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

IL-22是IL-10家族成員，人IL-22由146個氨基酸組成，其與小鼠IL-22有80.8%的同源性，是一個具有α螺旋的二級結(jié)構(gòu)，其通過與IL-22受體結(jié)合可發(fā)揮生物學(xué)活性［6］。IL-22受體屬于Ⅱ級細(xì)胞因子受體家族，由兩個亞單位組成，即IL-22受體1和IL-10受體2，前者主要表達(dá)于非免疫組織，如皮膚、肺臟、腎臟、胰腺等；后者廣泛表達(dá)于免疫細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等。研究表明，在小鼠和人腎臟細(xì)胞中，IL-22受體被激活后可引起STAT3和STAT5磷酸化，而IL-22可以活化JAK1和TYK2，從而激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路［7-8］。

CNS受損時，星形膠質(zhì)細(xì)胞會轉(zhuǎn)化成反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，但反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞對CNS的修復(fù)作用尚存在爭議［9-10］。有研究者通過純化和遺傳分析反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞可以被激活成兩種極化狀態(tài)：A1型（神經(jīng)毒性或促炎表型）和A2型（神經(jīng)保護(hù)或抗炎表型）［11］，盡管上述分型并不能完全代表反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞表型，但其有助于理解不同CNS疾病中星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)狀態(tài)。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是最豐富的膠質(zhì)細(xì)胞，對CNS功能維持具有重要作用，其可以參與神經(jīng)發(fā)育過程中神經(jīng)元的突觸形成、成熟和消除［12］。當(dāng)CNS損傷時，星形膠質(zhì)細(xì)胞在細(xì)胞外環(huán)境中可改變自身形態(tài)和功能特征，從而轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞［13］。與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞具有以下特征：突觸功能下降，吞噬能力降低，神經(jīng)毒性增強(qiáng)［14］。一般情況下，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞能維持CNS中的神經(jīng)元存活，但A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞可以分泌可溶性毒素，進(jìn)而迅速殺傷神經(jīng)元和成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞［15］。而CNS中小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的多種炎性因子可共同活化星形膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而在多種CNS疾病中發(fā)揮生物學(xué)作用［16］。

研究表明，MS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞和信號通路，除小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等外，星形膠質(zhì)細(xì)胞也在其中發(fā)揮了重要作用［15］。局灶性白質(zhì)活動性病變患者星形膠質(zhì)細(xì)胞肥大，可表達(dá)高水平的膠質(zhì)纖維酸性蛋白，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子、趨化因子表達(dá)及髓鞘再生，進(jìn)而參與MS的發(fā)生［17］；同時，在特定條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞還表現(xiàn)出抗原遞呈細(xì)胞的特征，促進(jìn)免疫細(xì)胞應(yīng)答，加速CNS中的免疫損傷；再者，星形膠質(zhì)細(xì)胞還與MS的硬化斑塊形成直接相關(guān)［18］。因此，研究星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化機(jī)制可能對MS的治療具有一定幫助。

研究表明，細(xì)胞因子IL-1α、TNF-α和C1q可以誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞向A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化［12］。本研究結(jié)果顯示，IL-22處理組補(bǔ)體C3 mRNA、蛋白表達(dá)水平及FKBP5、GGTA1、Serping1、Srgn mRNA表達(dá)水平均高于對照組，提示IL-22可以促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞；C1q+TNF-α+IL-1α處理組、C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22處理組補(bǔ)體C3 mRNA、蛋白表達(dá)水平高于IL-22處理組，提示C1q、TNF-α、IL-1α對星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用強(qiáng)于IL-22，但其相互之間的作用復(fù)雜，其機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明。

IL-22作為一種重要的細(xì)胞因子，可以激活多種信號通路［19］。本研究結(jié)果顯示，IL-22處理組p-p38、p-MAPKAPK-2、補(bǔ)體C3蛋白表達(dá)水平高于對照組；p38 MAPK抑制劑處理組p-p38、p-MAPKAPK-2、補(bǔ)體C3蛋白表達(dá)水平低于對照組；IL-22+p38 MAPK抑制劑處理組p-p38、p-MAPKAPK-2、補(bǔ)體C3蛋白表達(dá)水平低于IL-22處理組，但高于p38 MAPK抑制劑處理組；提示IL-22可能通過促進(jìn)絲裂原活化蛋白激酶活化的蛋白激酶2（mitogen activated protein kinase activated protein kinase 2，MAPKAPK-2）磷酸化而激活p38-MAPK信號通路，進(jìn)而促進(jìn)補(bǔ)體C3蛋白表達(dá)。

綜上所述，IL-22可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞向A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，其機(jī)制可能與IL-22促進(jìn)MAPKAPK-2磷酸化，進(jìn)而激活p38-MAPK信號通路有關(guān)，這為MS發(fā)病機(jī)制的研究提供了新方向。

作者貢獻(xiàn)：甄瑾、馬翔凌進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計；春梅、李敏、劉斌進(jìn)行研究的實施與可行性分析；王梅玲、柳雅潔進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；春梅、云永利進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；甄瑾撰寫、修訂論文，負(fù)責(zé)質(zhì)量控制及審校，并對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。